臨床菌株耐藥性分子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

梁有才綜述，陸學(xué)東審校(.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東湛江 534000； .中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 58033)

·綜述·

臨床菌株耐藥性分子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

梁有才1綜述，陸學(xué)東2審校
(1.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東湛江 534000； 2.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518033)

臨床菌株分子檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用已較為成熟；基因芯片、多重基因遺傳信息表達(dá)分析系統(tǒng)對(duì)部分菌株耐藥基因檢測(cè)的方法已經(jīng)建立；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)在菌株蛋白質(zhì)分子及單核苷酸突變檢測(cè)方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；最新一代DNA測(cè)序技術(shù)在簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程的同時(shí)大幅削減成本，其應(yīng)用可能為臨床菌株鑒定及其耐藥性檢測(cè)帶來(lái)新的革命。該文對(duì)上述幾種分子檢測(cè)技術(shù)在臨床菌株耐藥檢測(cè)方面進(jìn)行介紹，為臨床應(yīng)用與研究提供參考。

細(xì)菌；耐藥基因；聚合酶鏈反應(yīng)；多重基因分析系統(tǒng)；MALDI-TOF MS；DNA測(cè)序

基因檢測(cè)具有快速、可預(yù)測(cè)菌株潛在耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)臨床重癥感染緊急用藥治療具有指導(dǎo)意義，甚至有可能成為某些病原菌耐藥檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步帶動(dòng)了臨床菌株分子檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展。本研究對(duì)PCR、基因芯片(gene chip)、多重基因遺傳信息表達(dá)分析系統(tǒng)(gene expression profiler genetic analysis system, GeXP)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)、DNA測(cè)序(DNA sequencing)這5種重要的分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，為相關(guān)應(yīng)用與研究提供參考。

1 PCR技術(shù)

多種PCR技術(shù)均可用于微生物檢測(cè)，包括巢式PCR、數(shù)字PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、重復(fù)序列PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescene quantitative PCR，Real-time PCR)等。其中，Real-time PCR在臨床菌株耐藥基因檢測(cè)方面的應(yīng)用比較成熟。Wang等[3]應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)血培養(yǎng)液中甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌基因16S rRNA(細(xì)菌感染內(nèi)參)、nuc(金黃色葡萄球菌共有基因)與mecA(甲氧西林耐藥相關(guān)基因)，敏感性依次為100%、97.2%和99.2%，特異性均為100%，最低細(xì)菌檢測(cè)濃度為103CFU/mL。Van等[4]應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)革蘭陰性桿菌耐藥基因blaOXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM與blaKPC，篩查58株產(chǎn)碳青霉烯酶菌株與28株陰性質(zhì)控株，敏感性與特異性均為100%。Peng等[5]應(yīng)用多熒光實(shí)時(shí)定量熒光PCR(multi-fluorescence quantitative Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、mabA-inhA和oxyR-ahpC基因突變導(dǎo)致的耐藥，鑒別利福平耐藥與藥敏試驗(yàn)相比，敏感性與特異性分別為94.6%與100%，與DNA測(cè)序相比分別為97.2%與100%；鑒別異煙肼耐藥與藥敏試驗(yàn)相比，敏感性與特異性分別85.9%與95.3%；與DNA測(cè)序相比分別為97.9%與96.4%。該技術(shù)同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌保守基因rrS來(lái)鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，準(zhǔn)確率達(dá)100%，擴(kuò)增過(guò)程僅需2.5 h。

Real-time PCR優(yōu)點(diǎn)為：(1)靈敏度高，可定量分析；(2)具有引物與探針(或者染料)的雙重特異性，比傳統(tǒng)PCR特異性好；(3)在封閉管內(nèi)一步完成檢測(cè)，自動(dòng)化程度高，不易交叉污染或污染環(huán)境。缺點(diǎn)為：(1)不能檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小；(2)由于熒光素種類及檢測(cè)光源局限，復(fù)合式(multiplex)檢測(cè)能力受限；(3)引物難以設(shè)計(jì)，反應(yīng)中引物相互干擾，降低擴(kuò)增效率。

2 基因芯片技術(shù)

固相芯片也稱DNA微陣列(DNA microarray)，基本原理是將已知序列的寡核苷酸探針固定在固相支持物表面；DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后被熒光標(biāo)記，與芯片上寡核苷酸探針雜交；通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)進(jìn)行定性與定量分析。該技術(shù)在菌株鑒定及耐藥基因檢測(cè)方面較Real-time PCR通量更高。Ting等[6]應(yīng)用固相芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌β-內(nèi)酰胺類耐藥相關(guān)基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaDHA、blaCIT、blaVIM、blaKPC與blaOXA-23，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR一致，敏感性與特異性均為100%。Boqaerts等[7]應(yīng)用固相芯片技術(shù)檢測(cè)革蘭陰性桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaBEL、blaPER、blaGES和blaVEB)、頭孢菌素類耐藥基因(blaCMY-2-like、blaDHA、blaFOX、blaACC-1、blaACT/MIR和blaCMY-1-like/MOX)以及碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaGIM、blaSPM、blaOXA-23、blaOXA-24和blaOXA-58)，敏感性依次為100%、99.5%和100%，特異性均為100%；還能將產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶與產(chǎn)碳青霉烯酶菌株進(jìn)行有效鑒別，檢測(cè)48株菌用時(shí)僅需7～8 h。固相芯片可包含成千上萬(wàn)種DNA探針，檢測(cè)通量明顯提高；可分析小片段缺失與插入，敏感性比PCR+瓊脂糖電泳高10倍[8]。但在芯片表面原位合成核酸探針時(shí)易發(fā)生錯(cuò)誤或混入雜質(zhì)而降低雜交特異性。目前固相芯片可檢測(cè)項(xiàng)目還比較少，尚難以廣泛應(yīng)用。

液相芯片也稱為微球體懸浮芯片(liquid chip，suspension array)，主要包括Luminex公司推出的Luminnex 100/200和Flexmap 3D技術(shù)平臺(tái)。Luminex 100/200系統(tǒng)用紅色與橙色熒光染料將聚苯乙烯微球染成不同色彩后標(biāo)記核酸探針，在懸液中樣品分子(PCR產(chǎn)物)特異結(jié)合報(bào)告分子與微球探針，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)被激光激發(fā)出熒光，經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定性或定量分析。Flexmap 3D加入3種不同熒光素，檢測(cè)分子數(shù)從100提高到500，多方面提高檢測(cè)能力及效率[9]。李婧嬋等[10]基于Luminex 200平臺(tái)結(jié)合等位基因特異性引物延伸技術(shù)，建立檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點(diǎn)rpoB526、katG315、ropB531的方法，在樣本濃度為1.5×105ng/mL時(shí)，批間和批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為6.48%～12.15%和0.35%～6.92%；在樣本濃度為2 ng/mL時(shí)，批間和批內(nèi)CV分別為5.73%～10.77%和0.97%～8.91%；重復(fù)性好；最低檢測(cè)濃度可達(dá)1 ng/mL，且多位點(diǎn)檢測(cè)互不干擾；1人在8 h內(nèi)可完成上百例樣本的多突變位點(diǎn)檢測(cè)。液相芯片靈敏度高，最低檢測(cè)濃度達(dá)0.1 pg/mL，克服了固相芯片檢測(cè)大分子易受動(dòng)力學(xué)指標(biāo)干擾的缺點(diǎn)，線性范圍可達(dá)0.2～32 000 pg/mL。Flexmap 3D理論上能夠在20 min內(nèi)對(duì)96個(gè)樣本的500種目的分子同時(shí)定性或定量檢測(cè)，PCR 擴(kuò)增后1 h即可得到結(jié)果[9]。但是，液相芯片技術(shù)應(yīng)用能力受PCR多重?cái)U(kuò)增能力限制,儀器價(jià)格昂貴，臨床推廣有難度。

3 GeXP技術(shù)

GeXP系統(tǒng)融合多重PCR與毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，采用熒光標(biāo)記的通用引物和末端連有通用引物標(biāo)簽的特異性嵌合引物，反應(yīng)起始由反向嵌合引物與RNA模板逆轉(zhuǎn)錄出cDNA(DNA樣品無(wú)此步驟)，cDNA與正向嵌合引物結(jié)合，擴(kuò)增出通用互補(bǔ)序列，再由通用引物與之結(jié)合擴(kuò)增出熒光標(biāo)記產(chǎn)物，經(jīng)毛細(xì)管電泳分離，與標(biāo)準(zhǔn)DNA(DNA size standard)遷移對(duì)比可計(jì)算擴(kuò)增片段大小，可定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度,反映擴(kuò)增片段含量。

GeXP系統(tǒng)可應(yīng)用于菌株鑒定及耐藥基因分析。吳金燕等[11]應(yīng)用GeXP系統(tǒng)檢測(cè)白假絲酵母菌參照基因ITS及其與氟康唑耐藥相關(guān)的ADH1、ERG11、CDR2、CDR1、FLU1、MDR1和ERG3基因，靈敏度達(dá)102拷貝/μL。研究發(fā)現(xiàn)除了ADH1與FLU1，其余6種基因從熱帶假絲酵母菌氟康唑耐藥株中檢出的濃度不同程度地高于敏感株。Hu等[12]應(yīng)用GeXP系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷類耐藥相關(guān)基因aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、aac(6′)-Ⅱ、ant(3′)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅵ、armA和rmtB，與傳統(tǒng)PCR相比，敏感性依次為92.5%、100%、88.89%、100%、83.33%、95.24%和93.33%。

GeXP系統(tǒng)相比PCR+瓊脂糖凝膠電泳有諸多優(yōu)勢(shì)：(1)可分辨相差5 nt基因片段，提高了分辨率；(2)一個(gè)反應(yīng)可從5～500 ng RNA樣本中同時(shí)檢測(cè)30～40個(gè)基因，提高了效率；(3)可分辨0.5倍基因表達(dá)量變化，提高了靈敏度；(4)將多基因整合在同一體系分析，消除分管操作和孔間誤差，提高了準(zhǔn)確性與可重復(fù)性[13]。GeXP系統(tǒng)也有缺陷：(1)靶序列濃度差異過(guò)大，易導(dǎo)致低濃度序列檢測(cè)假陰性；(2)為避免擴(kuò)增偏倚，目的片段需控制在150～350 bp之間；(3)每對(duì)引物需逐一優(yōu)化調(diào)整；(4)最后判讀峰圖尚無(wú)固定標(biāo)準(zhǔn)。

4 MALDI-TOF MS技術(shù)

MALDI-TOF MS利用激光激發(fā)樣本(蛋白質(zhì)分子或核酸分子)與基質(zhì)的結(jié)晶產(chǎn)生離子，離子進(jìn)入真空管后，其質(zhì)荷比與飛行時(shí)間成正比，由質(zhì)譜儀探測(cè)繪成質(zhì)譜峰圖，比對(duì)參考圖譜即可辨別樣本分子。MALDI-TOF MS可通過(guò)分析菌株核蛋白獲得特征峰(蛋白質(zhì)指紋圖譜)來(lái)鑒別菌株及其耐藥性。例如Wang等[14]應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒別金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性，甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)菌株在3 784～5 700區(qū)間有區(qū)別于MSSA菌株的特征峰，該檢測(cè)過(guò)程僅需30 min，儀器自動(dòng)檢測(cè)靶板上96例樣本僅須2 h，與PCR及表型檢測(cè)法相比準(zhǔn)確率為97%。Sparbier等[15]將金黃色葡萄球菌接種在含苯唑西林與同位素標(biāo)記賴氨酸的培養(yǎng)基中，MRSA菌株利用賴氨酸合成菌體蛋白，而MSSA菌株由于抗生素壓力未獲合成，導(dǎo)致兩者的MALDI-TOF MS檢測(cè)圖譜有特征性區(qū)別，鑒別結(jié)果與表型檢測(cè)法(E-test法)一致。此外，MALDI-TOF MS還可根據(jù)菌株酶解抗生素分子的改變[16]以及菌株外膜蛋白的改變[17]來(lái)分析其耐藥性。

在核酸檢測(cè)方面，MALDI-TOF MS與PCR相結(jié)合的微測(cè)序法(mini sequencing)可以檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變導(dǎo)致的耐藥?；玖鞒虨椋篜CR擴(kuò)增模板核酸，蝦堿性磷酸酶(SAP)處理產(chǎn)物，再利用單核苷酸引物延伸技術(shù)擴(kuò)增，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化產(chǎn)物，再M(fèi)ALDI-TOF MS分析。延伸產(chǎn)物比引物多一個(gè)堿基，該堿基依SNP位點(diǎn)堿基改變而改變(互補(bǔ)配對(duì))，產(chǎn)物分子量因此不同，導(dǎo)致MALDI-TOF MS檢測(cè)圖譜的特征性改變，以此判斷SNP的存在。Ikryannikowa等[18-19]利用該方法檢測(cè)大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌blaTEM基因突變以及結(jié)核分枝桿菌rpoB和katG基因突變所導(dǎo)致的耐藥，結(jié)果與DNA測(cè)序一致。

MALDI-TOF MS鑒定微生物與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，具有快速、靈敏、高通量、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)，但其無(wú)法對(duì)樣品定量；儀器成本高；結(jié)果判讀無(wú)固定標(biāo)準(zhǔn)；基于蛋白質(zhì)指紋的耐藥檢測(cè)目前僅適用少部分菌株；在核酸檢測(cè)時(shí)，PCR體系中的離子會(huì)影響質(zhì)譜分辨率和信號(hào)強(qiáng)度；基因突變檢測(cè)效益尚未明確，相關(guān)試劑成本高，距離臨床推廣尚有段距離。

5 DNA測(cè)序技術(shù)

第一代DNA測(cè)序技術(shù)是指?jìng)鹘y(tǒng)的化學(xué)降解法與雙脫氧鏈終止法(Sanger法)以及以其為基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)的各種DNA測(cè)序技術(shù)。第一代測(cè)序技術(shù)原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，讀長(zhǎng)達(dá)1 000 bp；但成本高，速度慢，通量低，影響基因組測(cè)序效率。第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing)主要包括Roche、Illumina和ABI公司的454、Solexa和SOLiD平臺(tái)[20]，相對(duì)前一代技術(shù)成本低，通量高，一次測(cè)序可讀取100 000～1 000 000條序列，準(zhǔn)確率至少可達(dá)99.5%；但讀長(zhǎng)較短(454技術(shù)可達(dá)700 bp)，任何影響PCR擴(kuò)增的因素皆可影響測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。第三代測(cè)序技術(shù)[21](next-next-generation sequencing)是單分子測(cè)序技術(shù)，包括：Heloscope BIoScience、Pacific BioSciences、VisiGen Biotechnologies、Life Technologies和Oxford Nanopore technologies 5個(gè)公司分別擁有的SMS、SMRT、FRET、Ion Torrent PGM和新型納米孔測(cè)序技術(shù)。第三代測(cè)序技術(shù)無(wú)需PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)；以SMRT為代表，讀長(zhǎng)可達(dá)3 000 bp，但錯(cuò)誤可達(dá)15%。Nanopore新型納米孔技術(shù)[22-23]棄用以往的聚合酶生化反應(yīng)，以分析電參數(shù)特征來(lái)分辨堿基種類，速度可達(dá)20～400 nt/s，該技術(shù)的發(fā)展有望改變第三代測(cè)序準(zhǔn)確性偏低的缺點(diǎn)。

第二代測(cè)序技術(shù)在實(shí)現(xiàn)高通量的同時(shí)降低成本，使通過(guò)測(cè)序大規(guī)模獲取基因組數(shù)據(jù)成為可能。經(jīng)DNA測(cè)序分析菌株全基因組或特定基因片段可以鑒別細(xì)菌及其耐藥基因。Cordon等[24]采用基因組測(cè)序篩查491株金黃色葡萄球菌的24種耐藥基因(與12種抗生素相關(guān))，與表型檢測(cè)相比，敏感性與特異性分別為97%(95%CI:0.95～0.98)和99%(95%CI:0.99～1)。Cloman等[25]未經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)，直接提取痰標(biāo)本中細(xì)菌基因組核酸，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌7種抗生素相關(guān)耐藥基因，與表型檢測(cè)的符合率為97%。此外，Laabei等[26]對(duì)90株MRSA進(jìn)行基因組測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)121個(gè)基因位點(diǎn)與菌株致病毒力相關(guān)，基于上述位點(diǎn)建立起菌株毒力預(yù)測(cè)模型,可將臨床感染菌株行基因組測(cè)序與該模型比對(duì)，為臨床診治提供有力證據(jù)。

6 展望

PCR技術(shù)仍然是臨床應(yīng)用較成熟的耐藥基因檢測(cè)技術(shù)，基因芯片與GeXP技術(shù)研究主要在方法建立階段。MALDI-TOF MS具備直接檢測(cè)臨床樣本中病原菌的能力，但在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方面仍存在諸多難以解決的問(wèn)題。上述技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)需在核酸提取與PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行，操作繁瑣，最終結(jié)果的確認(rèn)有賴于DNA測(cè)序。第三代DNA測(cè)序技術(shù)無(wú)需PCR擴(kuò)增，在數(shù)十分鐘內(nèi)可完成基因組測(cè)序；同時(shí)可進(jìn)行菌株鑒定及分型、耐藥基因譜篩查、毒力基因譜篩查以及基因突變分析。隨著病原菌耐藥基因與臨床耐藥機(jī)制關(guān)系的逐步明了，測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及檢測(cè)成本的進(jìn)一步下降，新一代測(cè)序技術(shù)有望在臨床推廣應(yīng)用，為臨床病原菌感染的診斷治療帶來(lái)革命性前景。

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(本文編輯：周萬(wàn)青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.17

梁有才，1986年生，男，技師，碩士研究生，主要從事微生物檢驗(yàn)工作。

陸學(xué)東，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:luxuedong2004@163.com。

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2016-10-25)