多種基于微流控芯片的檢測方法用于細菌檢測*

邵奕霖，徐小平，高菊逸(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌 330006；.香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳 518053)

·綜述·

多種基于微流控芯片的檢測方法用于細菌檢測*

邵奕霖1,2，徐小平2，高菊逸2
(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌 330006；2.香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳 518053)

致病菌常規(guī)檢測方法以培養(yǎng)鑒定為主，該方法周期長，培養(yǎng)條件苛刻，難以做到快速檢測。微流控芯片具有小型化、高通量、快速、集成、耗材少等優(yōu)點，近年得到了快速發(fā)展并逐步應(yīng)用于各個領(lǐng)域。利用微流控芯片技術(shù)可實現(xiàn)細菌的快速檢測，將該技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合也得到了廣泛應(yīng)用。該文就近些年聯(lián)合其他細菌檢測方法設(shè)計的微流控芯片進行了綜述，并探討各種協(xié)同方法的優(yōu)缺點及臨床應(yīng)用前景或價值。

微流控芯片；細菌；快速檢測

微流控芯片(microfluidic chip)技術(shù)是在微米級通道內(nèi)操控微量流體的技術(shù)，通過微進樣技術(shù)和對微通道內(nèi)流體的控制，可將芯片分隔成多個功能模塊，包括樣品分選室、富集室、反應(yīng)室、檢測室等，也被稱為微整合分析芯片(micrototal analytical systems)。微流控芯片在細菌檢測上具有巨大潛力，已發(fā)展成多學(xué)科交叉的新型研究領(lǐng)域。目前利用傳統(tǒng)檢測方法設(shè)計制作的芯片包括化學(xué)芯片和基因芯片?，F(xiàn)就幾種芯片的優(yōu)缺點綜述如下。

1 電化學(xué)芯片

細菌懸液經(jīng)負壓吸引通過檢測孔時，因細菌體積大小、表面性質(zhì)的不同產(chǎn)生不同的脈沖信號，經(jīng)放大、分選后累加記錄，可將脈沖信號轉(zhuǎn)化為細菌數(shù)量和種類等相關(guān)信息。近些年，電阻抗技術(shù)也被應(yīng)用到微流控芯片上。Mejri等[1]制作的芯片有3個3 mm×3 mm獨立檢測室，每個檢測室包繞有交錯的微金電極，聯(lián)合紅外光譜檢測大腸埃希菌，檢出限(limit of detection，LOD)達到104CFU/mL。Syed等[2]設(shè)計的納米微電極芯片基于雙向電泳和嵌入式垂直碳納米纖維，能在高流速(1.6 mm/s)菌液中捕獲大腸埃希菌。Del等[3]建立的芯片實現(xiàn)了實時監(jiān)控交叉電極室的細菌積累狀況，整個系統(tǒng)自動化集中操作，通過遠程計算機控制，儀器記錄電阻抗的變化來檢測大腸埃希菌。電化學(xué)芯片檢測細菌具有靈敏、快速等優(yōu)點。傳統(tǒng)電阻抗法檢測細菌時待測細菌濃度需達到106～107個/mL時才會有明顯脈沖信號，而電阻抗芯片降低了細菌檢出所需的濃度。由于可選電極多樣，微流控芯片個性化的設(shè)計，二者的結(jié)合方式成為未來電阻抗芯片的研究方向。但電阻抗芯片對設(shè)備要求及設(shè)計成本高，在以后的研究中應(yīng)努力降低材料成本。

2 等溫擴增基因芯片

環(huán)介導(dǎo)等溫體外擴增是利用2對具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，讓引物在等溫條件(60～65 ℃)下順利結(jié)合，并在30～60 min內(nèi)完成特異、快速的擴增。因該技術(shù)具有易操作、耗時少等特點，使其在體外擴增領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。秦奎偉等[4]建立了一種NOA81型環(huán)介導(dǎo)等溫擴增芯片用來檢測沙門菌屬，該技術(shù)結(jié)合微流控芯片耗材少、小體積、集成化等優(yōu)點和等溫擴增技術(shù)操作簡單、擴增時間短、靈敏度高等特點，能快速檢測細菌。Xia等[5]設(shè)計的芯片上有散射狀排布的20個直徑為0.8 mm的微通道，91個微孔，能同時檢測臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、河流弧菌和副溶血弧菌，其中對河流弧菌的檢出限為7.2 copies/μL，并且檢測以上5種細菌的準(zhǔn)確率達100%。Safavieh等[6]設(shè)計的微流控芯片，恒溫擴增大腸埃希菌DNA，利用熒光染料(Hoechst 33258)直接對DNA染色，減少了富集大腸埃希菌的步驟，縮短檢測時間，使其檢出限為24 CFU/mL。2016年，Oh等[7]將等溫擴增技術(shù)協(xié)同洛黑T比色檢測法在大腸埃希菌O157:H7、鼠傷寒沙門菌和副溶血弧菌的混合物中，檢測大腸埃希菌O157:H7檢出限為380 copies/μL。聯(lián)合等溫擴增技術(shù)的微流控芯片，具有恒溫擴增、耗時短、易操作等優(yōu)勢，在臨床即時診斷(point-of-care testing，POCT)的應(yīng)用中具有很大的潛力，易于在醫(yī)院推廣。

3 化學(xué)熒光芯片

免疫熒光檢測是將特異性抗原抗體反應(yīng)、熒光標(biāo)記、熒光顯微鏡結(jié)合起來的檢測技術(shù)，能對細菌定性或定量分析。張望等[8]利用免疫熒光設(shè)計的芯片同時檢測10個樣本，耗時少、高通量，檢測大腸埃希菌O157：H7的敏感性和特異性分別為62%和100%。納米熒光檢測則是利用高強度熒光、低背景熒光干擾且具有高選擇性的納米熒光探針對細菌快速檢測。Nuchtavorn等[9]設(shè)計的毛細管電泳微流控芯片，利用尼羅藍進行標(biāo)記，通過激光誘導(dǎo)熒光(laser induced fluorescence，LIF)在30～40 s內(nèi)能對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和假絲酵母菌快速分離標(biāo)記。與傳統(tǒng)熒光染料相比，納米熒光不僅具有更高的熒光強度以及穩(wěn)定性，同時具有更好的生物相容性，可在幾十分鐘內(nèi)實現(xiàn)對細菌的實時跟蹤檢測[10-11]。Mitchell等[12]將氨基化納米磁珠(magnetic bead，MB)和羧基化量子點(QD655)結(jié)合而設(shè)計了一種芯片，對大腸埃希菌O157:H7菌液DNA定量檢測，通過芯片分選富集和熒光信號放大檢測，其檢出限達到了4.9×10-14mol/L。隨著量子點和熒光納米探針的不斷研發(fā)，納米熒光探針會慢慢代替現(xiàn)有的有機熒光材料，聯(lián)合微流控技術(shù)設(shè)計的熒光芯片能實現(xiàn)對細菌靈敏快速的檢測，具有很好的發(fā)展前景。

4 化學(xué)發(fā)光芯片

拉曼光譜是分子的振動光譜，分子結(jié)構(gòu)的變化能在拉曼光譜上反映出來，并可以對物質(zhì)定性和定量分析。對比普通光學(xué)檢測法，增強拉曼光譜(surface-enhanced raman scattering，SERS)和微流控芯片的結(jié)合能實現(xiàn)細菌的快速檢測[13]。Cheng等[14]設(shè)計的微流控芯片利用有拉曼光譜活性的粗糙電極對細菌進行富集，僅3 min將原濃度為5×103CFU/mL的菌液富集提高約1 000倍，并能在1 min檢測出金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，而且在細菌的富集和檢測過程中未使用抗體和其他化學(xué)試劑。Deng等[15]設(shè)計的微流控芯片聯(lián)用介電電泳技術(shù)和SERS富集檢測金黃色葡萄球菌，在15 s內(nèi)完成對金黃色葡萄球菌的分選富集，并在富集區(qū)利用SERS技術(shù)完成檢測。SERS具有譜帶寬、檢測無損、處理簡單、靈敏度高、抗光漂白等優(yōu)點。微流控芯片聯(lián)合光學(xué)檢測技術(shù)制備的光譜芯片對于微小檢測物具有很高的靈敏度，在細菌快速檢測上的應(yīng)用仍具有很好的發(fā)展前景。

5 基因芯片

微流控平臺結(jié)合PCR技術(shù)則具有高通量、耗材少、耗時短、多分析模塊等優(yōu)勢。朱強遠等[16]將數(shù)字PCR協(xié)同微流控芯片，可同時檢測4個樣本，由于進樣、分選和檢測都在密閉的芯片內(nèi)部，避免環(huán)境可能對結(jié)果造成的污染。Julich等[17]建立的基因芯片通過聯(lián)用磁珠對捕獲的DNA進行高效的洗滌和洗脫，檢測水表面蘇云金桿菌和土拉熱桿菌，其檢出限分別為102GE(genome equivalents)/mL和103GE/mL。PCR檢測芯片不受通道尺寸的影響，具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度?；蛐酒臉?gòu)建是未來實現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷的發(fā)展方向。法國生物梅里埃公司通過基因芯片分離擴增基因片段，生物分析儀檢測，建立了全自動微生物分型系統(tǒng)(DiversiLab System)，實現(xiàn)了基因芯片的產(chǎn)品化。

6 結(jié)論與展望

微流控技術(shù)的發(fā)展為POCT的實現(xiàn)提供了一個平臺?；瘜W(xué)芯片是將芯片作為微反應(yīng)器通過控制液滴，實現(xiàn)高通量化學(xué)反應(yīng)，提高了檢測靈敏度；小樣本檢測也為即時診斷提供了方便快速的檢驗結(jié)果。基因芯片有兩個特點，一是對細菌的檢測不受微通道空間的影響，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度；另一個是不受標(biāo)本來源的約束，不存在檢測環(huán)境對標(biāo)本檢測的影響。

未來微流控芯片將結(jié)合3D打印技術(shù)建立仿生實驗室，在芯片上構(gòu)建感染的器官，模擬細菌在體內(nèi)生活的微環(huán)境，同時通過構(gòu)建的器官芯片模擬抗生素對細菌的作用效果，為臨床治療提供參考。微觀上，基因芯片通過將大量的DNA探針集成在一塊芯片上，使其與帶有熒光標(biāo)記的DNA樣本進行雜交，通過檢測雜交信號強度來采集樣本的基因序列，從而實現(xiàn)細菌準(zhǔn)確、快速、大量的檢測。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

深圳市科技創(chuàng)新項目[(2013)171號,(2016)148號]；深圳市科技計劃項目(201101004)。

邵奕霖，1992年生，男，技師，碩士研究生，研究方向為微流控芯片在臨床檢驗診斷上的應(yīng)用。

徐小平，主任技師，E-mail: jyoxu@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2016.04.16

R446.6

A

2016-11-10)