甜菜堿對銅綠假單胞菌生物膜形成與分散及耐藥性的影響*

夏文穎，王玨，金菲，許雨喬，倪芳，趙旺勝(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

·微生物生物膜·

甜菜堿對銅綠假單胞菌生物膜形成與分散及耐藥性的影響*

夏文穎，王玨，金菲，許雨喬，倪芳，趙旺勝
(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

目的 探討甜菜堿對銅綠假單胞菌生物膜形成抑制及分散的作用，及其生物膜的形成與抑制對銅綠假單胞菌耐藥性的影響。方法 收集20株臨床銅綠假單胞菌，采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行生物膜形成能力試驗(yàn)及甜菜堿對銅綠假單胞菌的生物膜抑制與分散試驗(yàn)，并比較銅綠假單胞菌在生物膜形成與抑制情況下對環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度(MIC)變化。結(jié)果 20株銅綠假單胞菌均形成生物膜，24 h時即可形成成熟生物膜，吸光度(A590 nm)為1.90±0.66。與對照組比較，甜菜堿作用24 h則可明顯抑制銅綠假單胞菌生物膜形成(t=4.36,P<0.01)，48 h可達(dá)最大抑制作用，A590 nm為1.12 ±0.60；甜菜堿對銅綠假單胞菌的成熟生物膜分散作用24 h即可達(dá)最大分散作用。環(huán)丙沙星對20株銅綠假單胞菌MIC范圍0.03～4 μg/mL，MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為2 μg/mL，甜菜堿抑制生物膜后環(huán)丙沙星MIC無變化。形成成熟生物膜后環(huán)丙沙星MIC均大于16 μg/mL。結(jié)論 甜菜堿可有效抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成并能分散成熟生物膜，為臨床感染的治療帶來更多選擇。環(huán)丙沙星在有甜菜堿參與抑制時，對產(chǎn)膜細(xì)菌殺菌效果無變化。

生物膜；銅綠假單胞菌；甜菜堿；環(huán)丙沙星

細(xì)菌生物膜(bacteria biofilm，BBF)是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細(xì)胞相對應(yīng)的生長方式，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)組成。BBF的存在使細(xì)菌的耐藥性比浮游菌增加了10～1 000 倍，且抗生素應(yīng)用難以清除BBF，還會誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。目前生物膜引起的微生物耐藥現(xiàn)象明顯增加，是臨床上難治性感染的重要原因之一[1]。銅綠假單胞菌被認(rèn)為是產(chǎn)生物膜微生物中對人類危害最嚴(yán)重的一種[2]，常見于肺部囊性纖維化、傷口慢性感染、導(dǎo)管相關(guān)感染和戴隱形眼鏡引起的角膜炎等[3]。甜菜堿(betaine)又名三甲基甘氨酸，是一種季銨型水溶性生物堿，具有良好的殺菌消炎作用，有研究證實(shí)甜菜堿具有抑制微生物過度增殖的作用[4]。本研究旨在探討甜菜堿在體外對銅綠假單胞菌生物膜形成與分散的影響，以及其對細(xì)菌耐藥性的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 20株臨床分離的銅綠假單胞菌均分離自2016年5月至6月我院住院患者治療前采集的下呼吸道標(biāo)本，剔除同一患者的重復(fù)菌株。Vitek 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)對其進(jìn)行鑒定和藥敏分析。藥敏結(jié)果按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S26[5]規(guī)定判讀。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2 試劑與儀器 結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫飽和液(結(jié)晶紫2 g溶于100 mL 95%乙醇)20 mL+10 g/L草酸按溶液(草酸銨10 g加溫溶解于1 L蒸餾水)80 mL，混勻后用中速濾紙過濾后置于棕色瓶中備用。96%甜菜堿(南京明生醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；環(huán)丙沙星(廣東南新制藥有限公司)；Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、DESICHECK比濁儀(法國生物梅里埃公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國 Corning/Coster公司)；SHA-B全自動恒溫震蕩儀(金壇市國華儀器廠)；Thermo 自動酶聯(lián)儀(美國Thermo公司)。

1.3 生物膜形成能力測定 采用結(jié)晶紫染色法[6]檢測。挑取新鮮銅綠假單胞菌單個菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，將上述菌液濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬?∶100稀釋后加入96孔板，每孔加100 μL，同時每孔加LB培養(yǎng)液100 μL，每株菌做3個復(fù)孔，以LB培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。吸去96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，加入200 μL結(jié)晶紫溶液染色15 min，棄染色液并用PBS沖洗3次，室溫干燥后加入200 μL 95%乙醇，用酶聯(lián)儀測590 nm處吸光度(A590 nm)，重復(fù)3次，取平均值。以空白對照孔的平均值+3倍空白對照的標(biāo)準(zhǔn)差作為cut off值(Ac)。若實(shí)驗(yàn)組的A590 nm≤Ac，則成膜能力陰性；若A590 nm>Ac，則成膜能力陽性。

1.4 銅綠假單胞菌生物膜抑制試驗(yàn) 0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝汇~綠假單胞菌菌懸液制備同1.3操作，1∶100稀釋后加入96孔板，每孔加100 μL，同時每孔加2.0 g/L甜菜堿100 μL，每株菌做3個復(fù)孔，以含有相同終濃度菌懸液的LB培養(yǎng)液作實(shí)驗(yàn)對照，以LB培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。采用結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)菌生物膜A590 nm。

1.5 銅綠假單胞菌生物膜分散試驗(yàn)[7]0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝汇~綠假單胞菌菌懸液制備同1.3操作，1∶100稀釋后加入96孔板，每孔加100 μL，每株菌做3個復(fù)孔，以含有相同終濃度菌懸液的LB培養(yǎng)液作實(shí)驗(yàn)對照，以LB培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗3遍以去除浮游菌后，每孔加1.0 g/L甜菜堿100 μL，35 ℃培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。采用結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)菌生物膜A590 nm。

1.6 銅綠假單胞菌生物膜形成與抑制對細(xì)菌耐藥性的影響 環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)共設(shè)置常規(guī)組、生物膜組和生物膜抑制組3組。常規(guī)組：0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝汇~綠假單胞菌菌懸液制備同1.3操作，1∶100稀釋后加入96孔板，每孔加100 μL，將環(huán)丙沙星倍比稀釋配制成2倍終濃度的藥液分別加入96孔板孔內(nèi)，最高終濃度為16 μg/mL，每孔加100 μL，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果；生物膜組：同常規(guī)MIC組將菌液加入96孔板后，溫育24 h待形成生物膜后，PBS清洗3遍以去除浮游菌，測定環(huán)丙沙星對細(xì)菌的MIC值；生物膜抑制組：0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝汇~綠假單胞菌菌懸液制備同1.3操作，1∶50稀釋后加入96孔板，每孔加50 μL，再加入4.0 g/L甜菜堿50 μL，將環(huán)丙沙星倍比稀釋配制成2倍終濃度的藥液分別加入96孔板孔內(nèi)，最高終濃度為16 μg/mL，每孔加100 μL，35 ℃培養(yǎng)24 h，測定環(huán)丙沙星對加入生物膜抑制劑后的細(xì)菌的MIC值。結(jié)果按照CLSI[5]規(guī)定判讀。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。生物膜形成能力A590 nm數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌生物膜形成能力 20株臨床分離銅綠假單胞菌均形成生物膜，24 h、48 h和72 h后檢測A590 nm值分別為1.90±0.66、1.82±0.69和1.44±0.73，24 h、48 h時生物膜形成能力與72 h時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.08和3.31,P均<0.01)，24 h與48 h時成膜能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 甜菜堿對銅綠假單胞菌生物膜抑制及分散作用 與未加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)對照組相比，甜菜堿作用銅綠假單胞菌24 h、48 h和72 h后，A590 nm值均顯著下降(t值分別為4.36、4.21和3.21，P均<0.01)；甜菜堿作用48 h、72 h時A590 nm值低于作用24 h時(t=3.61，P<0.01；t=2.33，P=0.04)，48 h時為最低。從2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知顯示銅綠假單胞菌24 h即形成成熟生物膜，因而將銅綠假單胞菌24 h生物膜A590 nm值與甜菜堿分散成熟生物膜24 h、48 h和72 h的A590 nm值比較，結(jié)果顯示甜菜堿分散生物膜的3個時間點(diǎn)A590 nm值均顯著低于對照生物膜A590 nm值(t分別為5.76、3.71和3.70，P均<0.01)，分散不同時間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

注：*，與相同時間點(diǎn)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；#，與24 h對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；△，與抑制作用24 h組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 銅綠假單胞菌生物膜形成與抑制對其耐藥性的影響 常規(guī)組中，20株銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星MIC范圍為：0.03～4 μg/mL，MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為2 μg/mL，16株環(huán)丙沙星敏感，2株環(huán)丙沙星耐藥；生物膜抑制組MIC值與常規(guī)組完全一致；生物膜組銅綠假單胞菌MIC值均大于16 μg/mL。

3 討論

本研究中20株銅綠假單胞菌均形成生物膜，進(jìn)一步證實(shí)銅綠假單胞菌較強(qiáng)的成膜能力。本研究中銅綠假單胞菌24 h即可形成成熟生物膜，48 h與24 h成膜能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，72 h生物膜則開始衰減，這與其他研究所證實(shí)的指數(shù)生長期、平臺期及衰退期時間范圍基本一致[8]。

甜菜堿廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi)，可從甜菜制糖后的廢糖蜜中提取，也可采用三甲胺和氯乙酸為主要原料進(jìn)行化學(xué)合成[9]。之前對甜菜堿的研究主要集中在對抗高同型半胱氨酸綜合征，能保肝護(hù)腎、保持心臟與血管健康、保護(hù)細(xì)胞抵抗高滲、促進(jìn)脂肪代謝等。近年來有文獻(xiàn)報道甜菜堿能降低炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，顯示其具有降低炎癥相關(guān)疾病發(fā)病率的潛力[10]。陳云霞等[4]證實(shí)甜菜堿具有抑制微生物過度增殖的作用。本研究結(jié)果證實(shí)甜菜堿在對銅綠假單胞菌生物膜的抑制形成及分散中也能發(fā)揮很好的作用，甜菜堿可在24 h內(nèi)即發(fā)揮顯著的生物膜抑制作用，48 h后抑制作用達(dá)到最大值，使得銅綠假單胞菌的生物膜A590 nm值達(dá)到最低值；對成熟生物膜的分散試驗(yàn)結(jié)果顯示，甜菜堿作用24 h后達(dá)到最大分散效果。以上結(jié)果證實(shí)甜菜堿可用于體外抑制及分散細(xì)菌生物膜，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示銅綠假單胞菌生物膜形成后，環(huán)丙沙星MIC值增高。細(xì)菌形成生物膜后耐藥性明顯增加，一旦生物膜形成，在其內(nèi)部的病原菌抗原靶點(diǎn)則被覆蓋，降低了人體免疫監(jiān)視的敏感性，再加上生物膜耐藥屏障的存在，導(dǎo)致外界的抗生素?zé)o法有效滲入膜內(nèi)達(dá)到抗菌效果。本研究中使用甜菜堿作為抑制劑時環(huán)丙沙星的殺菌作用未有加強(qiáng)效應(yīng)，可能由于甜菜堿只用于抑制與分散生物膜，利于抗生素滲入膜內(nèi)，而對藥物的殺菌作用未有幫助。后續(xù)研究將關(guān)注不同濃度的甜菜堿在體內(nèi)抑制及分散細(xì)菌生物膜的作用及其作用機(jī)制，以期為臨床感染治療提供更準(zhǔn)確的使用依據(jù)。

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(本文編輯：劉群)

Effects of betaine on formation and dispersion ofPseudomonasaeruginosabiofilm and its drug-resistance

XIAWen-Ying,WANGJue,JINFei,XUYu-Qiao,NIFang,ZHAOWang-sheng
(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To investigate the effects of betaine on the formation and dispersion of biofilm ofPseudomonasaeruginosaand its drug-resistance. Methods A total of 20 strains ofPseudomonasaeruginosawere obtained from clinical inpatients. The biofilm formation abilities of thePseudomonasaeruginosawere evaluated by violet staining, and the effects of betaine on the formation and dispersion of biofilm were studied. The minimum inhibitory concentration(MIC) values ofPseudomonasaeruginosaon ciprofloxacin were compared with the controls when biofilm was formed and inhibited. Results Biofilm was formed in all the 20 strains ofPseudomonasaeruginosain 24 hours with absorbance(A590 nm)(1.90±0.66). Betaine significantly inhibited biofilm formation ofPseudomonasaeruginosain 24 hours compared with control group(t=4.36,P<0.01) and the maximum inhibition reached in 48 hours with absorbance(A590 nm)(1.12±0.60). The maximum dispersion of betaine on mature biofilm ofPseudomonasaeruginosareached in 24 hours. The MIC range of ciprofloxacin to the 20 strains ofPseudomonasaeruginosawas 0.03 to 4 μg/mL with 0.25 μg/mL of MIC50and 2 μg/mL of MIC90. After the biofilm was inhibited by belaine, the MIC of ciprofloxacin toPseudomonasaeruginosadid not changed. The MIC of ciprofloxacin to biofilm-formedPseudomonasaeruginosawas more than 16 μg/mL. Conclusion Betaine could effectively inhibit the formation of biofilm and disperse the mature biofilm ofPseudomonasaeruginosa, which may provide more choices for the treatment of clinical infection. The germicidal efficacy of ciprofloxacin has no changed on the biofilm-formed bacteria when inhibition of betaine was involved.

biofilm;Pseudomonasaeruginosa; betaine; ciprofloxacin

江蘇省實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金(xk201114)；南京醫(yī)科大學(xué)“十二五”教育研究課題(JYY2015020)。

夏文穎，1986年生，女，碩士，研究方向?yàn)楦腥九c腫瘤的診斷研究。

趙旺勝，主任技師，E-mail：zwsjsph@sohu.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.05

R446.5

A

2017-02-01)