單向灌流法評價(jià)復(fù)方龍脈寧湯劑配伍對葛根素腸吸收的影響

柏?；?劉詩雨+王晶+王昌利+宋逍

[摘要]建立大鼠在體單向腸灌流模型，采用高效液相色譜法測定灌流液中葛根素的濃度，考察葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復(fù)方龍脈寧4種湯劑在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中葛根素的吸收情況。結(jié)果顯示在十二指腸和回腸中，葛根穿山龍組與復(fù)方龍脈寧組葛根素的吸收參數(shù)無顯著性差異，但均顯著高于葛根和葛根川芎組的吸收（P<005）；在空腸和結(jié)腸中，3個(gè)配伍組中葛根素的吸收參數(shù)與葛根單藥組相比，存在顯著性差異（P<005），而復(fù)方龍脈寧組中葛根素的吸收參數(shù)與葛根穿山龍和葛根川芎組相比也存在顯著性差異（P<005）。表明在大鼠全腸段中，復(fù)方龍脈寧湯劑對葛根素的吸收有明顯的促進(jìn)作用。在十二指腸和回腸中，復(fù)方中穿山龍對葛根素的吸收有明顯的促進(jìn)作用；在空腸和結(jié)腸中，穿山龍和川芎能協(xié)同促進(jìn)葛根素的吸收。

[關(guān)鍵詞]葛根素； 復(fù)方龍脈寧； 配伍； 單向灌流模型； 重量法Effect of compound

中藥無論是單味藥還是復(fù)方，均含有眾多的化學(xué)成分，多成分是中藥制劑臨床使用的基本特征，但是單味藥在臨床應(yīng)用中往往存在活性成分生物利用度低、吸收差的問題，而復(fù)方配伍后藥物之間會(huì)發(fā)生某些相互作用并產(chǎn)生不同的效用，能夠改善有效成分的生物利用度[13]。

復(fù)方龍脈寧方（FFLMN）由葛根、穿山龍、川芎、蜂膠4味中藥組成，具有通絡(luò)活血、化瘀解毒的功效，臨床上主要用于治療中風(fēng)所致的半身不遂、肢體麻木、口眼歪斜和胸痹所致的胸悶氣短、心悸、失眠等癥[4]。葛根為全方君藥，其主要有效成分葛根素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈及腦血管、改善心肌代謝、改善腦部微循環(huán)、抗心律失常、降低血壓、抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用[45]。但是葛根素水溶性較差，口服后難以被吸收，絕對生物利用度只有375%左右[5]。因此本試驗(yàn)采用大鼠在體單向灌流模型，考察葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復(fù)方龍脈寧4種湯劑在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中對葛根素吸收的影響，探討中藥復(fù)方用藥與單味用藥的吸收差異，說明中醫(yī)復(fù)方配伍用藥的科學(xué)性。

1材料

UltiMate3000液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；BT1001F型蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；AR1140電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；HH2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；X1型高速離心機(jī)（Gene Company Limited）。

蜂膠，陜西省咸陽市自然之子蜂產(chǎn)品公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為正品蜂膠；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號110752201514）；烏來糖（上海山浦化工有限公司）；氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；乙腈（色譜純，Thermo Fisher Scientific）；水為超純水；其余試劑均為分析純。葛根飲片，寶雞向源中藥飲片有限責(zé)任公司，批號20160301，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王繼濤教授鑒定為豆科植物野葛的干燥根莖；穿山龍飲片、川芎飲片（西安盛興中藥飲片公司，批號20160301）。

SD雄性大鼠，體重（250±20） g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號SCXK（陜）2012003。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

2方法與結(jié)果

21湯劑的制備

211復(fù)方龍脈寧湯劑取葛根6 g，穿山龍4 g，川芎4 g，蜂膠2 g，分別加14倍量純凈水浸泡60 min。葛根先煎30 min，蜂膠除蠟[6]，而后將4味藥合并煎煮（先武后文）2次，第1次30 min，第2次20 min，合并煎煮濾液，濃縮至50 mL，即得復(fù)方龍脈寧湯劑（FFLMN）儲備液。

212方藥不同配伍湯劑A：葛根6 g；B：葛根6 g穿山龍4 g；C：葛根6 g川芎4 g。分別按與FFLMN相同煎煮方法制備，即得葛根湯劑（GG）、葛根穿山龍湯劑（GGCSL）、葛根川芎湯劑（GGCX）儲備液。

213湯劑中葛根素含量測定FFLMN及其不同配伍湯劑中葛根素的含量按照文獻(xiàn)[7]條件測定。結(jié)果表明葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復(fù)方龍脈寧4種湯劑中葛根素的質(zhì)量濃度分別為30，21，24，28 g·L-1。

22溶液的配制

221Krebsringer試液（KR緩沖液）[8]稱取NaCl 78 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g，加蒸餾水定容至1 L，即得。

222葛根素對照品的配制精密稱取葛根素對照品75 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為300 mg·L-1的葛根素對照品儲備液。

223腸灌流液的配制分別移取GG，GGCSL，GGCX，F(xiàn)FLMN湯劑儲備液適量于100 mL量瓶中，KR液稀釋定容至刻度，得葛根素質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的GG，GGCSL，GGCX，F(xiàn)FLMN腸灌流液。

23分析方法的建立

231色譜條件[7]BDS HYPERSIL C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈01%磷酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長203 nm；流速10 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

242數(shù)據(jù)分析本試驗(yàn)采用重量法對供試液流入和流出的體積進(jìn)行校正，并計(jì)算藥物吸收常數(shù)（Ka）和表觀吸收常數(shù)（Papp）。

Ka=1-ρoutρin×VoutVin×Qπr2l

Papp=-Qlnρoutρin×VoutVin2πrl

其中，Vin和Vout分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積（mL）（假定灌流液和收集液的密度相同），l和r分別為灌流腸段的長度（cm）和橫截面半徑（cm），Q為灌流速度（mL·min-1），ρin和ρout分別為灌流液和收集液的質(zhì)量濃度（mg·L-1）。

243統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS190軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），當(dāng) P<005時(shí)判定具有顯著差異，結(jié)果以±s表示，組間差異的比較采用t檢驗(yàn)。

244不同配伍組中葛根素在十二指腸中的吸收取葛根素質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項(xiàng)下方法操作，計(jì)算各配伍組中葛根素在十二指腸的吸收參數(shù)，結(jié)果見表3，4。在十二指腸中，葛根穿山龍組與復(fù)方龍脈寧組中葛根素的吸收參數(shù)無顯著性差異，但與葛根組和葛根川芎組比較均有顯著性差異（P<005）。表明復(fù)方中穿山龍對葛根素的吸收起主要促進(jìn)作用。

245不同配伍組中葛根素在空腸中的吸收取葛根素質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項(xiàng)下方法操作，計(jì)算各配伍組中葛根素在空腸的吸收參數(shù)，結(jié)果見表3，4。在空腸中，葛根穿山龍、葛根川芎及復(fù)方組中葛根素的吸收均高于葛根組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明其具有顯著性差異（P<005）；而復(fù)方組與葛根穿山龍、葛根川芎組比較，葛根素的吸收也存在顯著性差異（P<005）。結(jié)果表明復(fù)方中穿山龍、川芎對葛根素的吸收起協(xié)同促進(jìn)作用。

246不同配伍組中葛根素在回腸中的吸收取葛根素質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項(xiàng)下方法操作，計(jì)算各配伍組中葛根素在回腸的吸收參數(shù)，結(jié)果見表3，4。在回腸中，葛根穿山龍組與復(fù)方龍脈寧組中葛根素的吸收參數(shù)無顯著性差異，但較葛根組與葛根川芎組均有顯著性差異（P<005）。結(jié)果表明復(fù)方中穿山龍對葛根素的吸收起主要促進(jìn)作用。

247不同配伍組中葛根素在結(jié)腸中的吸收取葛根素質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項(xiàng)下方法操作，計(jì)算各配伍組中葛根素在結(jié)腸的吸收參數(shù)，結(jié)果見表3，4。在結(jié)腸中，葛根穿山龍、葛根川芎及復(fù)方組中葛根素的吸收均高于葛根組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明其具有顯著性差異（P<005）；而復(fù)方組與葛根穿山龍、葛根川芎組比較，葛根素的吸收也存在顯著性差異（P<005）。結(jié)果表明復(fù)方中穿山龍、川芎對葛根素的吸收起協(xié)同促進(jìn)作用。

3討論

研究藥物吸收的方法主要有在體法、離體法和體內(nèi)法。相比于后2種方法，在體法因不切斷血管和神經(jīng)系統(tǒng)，提高了腸段的生物活性，因此被廣泛應(yīng)用到藥物吸收的研究中[13]。在體腸道單向灌流常用的體積校正方法有：酚紅法和重量法。重量法因其真實(shí)地反映了腸道水分吸收情況而突顯出一定的優(yōu)勢[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用在體法研究復(fù)方湯劑配伍對君藥葛根中葛根素腸吸收的影響，并利用重量法對灌流前后體積進(jìn)行校正。

中藥配伍有減毒增效作用，目前研究主要集中在中藥配伍改善活性成分的藥理效應(yīng)上[1516]，而本文從吸收的角度研究中藥配伍后對活性成分的影響效果。結(jié)果顯示在大鼠全腸段中，復(fù)方龍脈寧湯劑對葛根中葛根素的吸收有明顯的促進(jìn)效果。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在十二指腸和回腸中，復(fù)方中穿山龍對葛根素的吸收起到了明顯的促進(jìn)作用；而在空腸和結(jié)腸中，復(fù)方中穿山龍和川芎對葛根素的吸收起到了協(xié)同促進(jìn)作用。這在一定程度上體現(xiàn)了復(fù)方龍脈寧配伍的科學(xué)性，同時(shí)也說明了中藥復(fù)方配伍用藥的意義之所在。

但是本文略顯不足之處是并未對穿山龍、川芎促進(jìn)葛根素吸收的機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究，因此后續(xù)研究中可針對此方面進(jìn)行相關(guān)研究探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉洋，王剛，董玲，等 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中多成分環(huán)境對葛根素滲透性的影響[J] 中國中藥雜志，2014，39 （23）：4505

[2]陳益杭，李孟璇，孟兆青，等 藥對研究（Ⅲ）葛根人參藥對對大鼠腸吸收的影響[J]中國中藥雜志，2015，40 （15）：3094

[3]郭震浪，蘇振寧，戴韻峰，等葛根芩連湯治療小兒輪狀病毒性腸炎療效的Meta分析[J]中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（24）：199

[4]董林娟，張文娟，劉詩雨，等 龍脈寧方中葛根素在心肌缺血大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)藥效學(xué)相關(guān)性研究[J] 中國中藥雜志，2016，41（8）：1535

[5]黃嗣航，龍曉英，袁飛，等 酚紅法和改良重量法分別研究葛根素的大鼠在體腸吸收機(jī)制[J] 廣東藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28 （6）：603

[6]馬海芳，王昌利，史亞軍 蜂膠除蠟工藝研究[J] 中南藥學(xué)，2014，12 （5）：448

[7]王莎，王昌利，史亞軍 復(fù)方龍脈寧HPLC指紋圖譜的研究[J] 中華中醫(yī)學(xué)刊，2015，33 （1）：89

[8]陳新民，李俊松，李文，等 五味子有效成分的大鼠在體單向灌流腸吸收[J] 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45 （5）：652

[9]Sun M H， Zhai X Z， Xue K W， et al Intestinal absorption and intestinal lymphatic transport of sirolimus from selfmicroemulsifying drug delivery systems assessed using the singlepass intestinal perfusion（SPIP） technique and a chylomicron flow blocking approach：linear correlation with oral bioavailabilities in rats[J].Eur J Pharm Sci， 2011， 43（3）：132

[10]Zuo Z， Zhang L， Zhou L M， et al Intestinal absorption of hawthorn flavonoids——in vitro， in situ and in vivo correlations[J] Life Sci， 2006， 79 （26）：2455.

[11]饒小勇，龔明，尹珊，等 白頭翁皂苷D在大鼠腸道的吸收行為研究[J] 中草藥，2013，44（24）：3515

[12]王進(jìn)榮，王平，楊永茂，等 單向灌流法評價(jià)蘆薈大黃素大鼠體內(nèi)腸吸收的研究[J] 中國中藥雜志，2011，36 （17）：2393

[13]鄧少東，張鵬，林勵(lì)，等 單向灌流法研究巴戟天低聚糖的大鼠腸吸收特性[J] 中國中藥雜志，2015，40 （1）：134

[14]劉詩雨，柏?；?，董林娟，等 基于單向灌流法的葛根素羧甲基殼聚糖微球腸吸收特性研究[J] 中草藥，2016，47 （14）：2488

[15]汪汀，馮芳 單向灌流法評價(jià)梔子厚樸湯方劑配伍對梔子苷腸吸收的影響[J] 藥學(xué)與臨床研究，2012，20 （3）：177

[16]李桓，周學(xué)平，陸艷基于代謝組學(xué)的中藥配伍減毒研究策略探討[J]中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（8）：226[責(zé)任編輯曹陽陽]

劉群等：麝香保心丸中5種人參皂苷類化合物在心肌梗死大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究

[收稿日期]20160823

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473327）

[通信作者]*柳潤輝，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分和中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究，Tel：（021）81871245，Email：lyliurh@126com