免疫組庫及高通量分析技術(shù)在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的研究進(jìn)展

趙丹彤， 郭昌龍， 閆惠平

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 自身免疫性肝病臨床研究中心暨臨床檢驗中心， 北京 100069；2 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所， 北京 100081)

免疫組庫及高通量分析技術(shù)在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的研究進(jìn)展

趙丹彤1， 郭昌龍2， 閆惠平1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 自身免疫性肝病臨床研究中心暨臨床檢驗中心， 北京 100069；2 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所， 北京 100081)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種器官特異性自身免疫性肝臟疾病，發(fā)病機制尚不明確。T淋巴細(xì)胞受體(TCR)和B淋巴細(xì)胞受體(BCR)互補決定區(qū)3氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性，構(gòu)成容量巨大的抗原識別受體庫，即免疫組庫。采用第二代測序技術(shù)結(jié)合多重PCR或擴增子救援多重PCR技術(shù)研究PBC患者免疫組庫特征是近年的研究熱點，目前發(fā)現(xiàn)PBC存在特異性CD4+T淋巴細(xì)胞大量克隆擴增，B淋巴細(xì)胞克隆多樣性、體細(xì)胞高頻突變及類別轉(zhuǎn)換現(xiàn)象明顯減少，熊去氧膽酸治療后克隆多樣性增加。上述發(fā)現(xiàn)有待通過大范圍體內(nèi)和體外試驗及不同的免疫組庫研究策略進(jìn)行驗證。

肝硬化， 膽汁性； 免疫組庫； 互補決定區(qū)； 綜述

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)，又名原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)，是一種以膽汁淤積為特點的慢性自身免疫性肝病，發(fā)病機制尚不完全清楚，可能與遺傳背景、感染及環(huán)境等因素所致的異常自身免疫有關(guān)[1]。PBC患者存在細(xì)胞免疫和體液免疫的異常，以血清抗線粒體抗體(AMA)陽性及自身免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)中小膽管損傷為特點[2]。

免疫組庫(immune repertoire，IR)指在任何指定時間，某個個體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的總和，反映機體整體免疫能力。T淋巴細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)和B淋巴細(xì)胞受體(B cell receptor, BCR)互補決定區(qū)(complementarity determining regions,CDR)3區(qū)氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性，構(gòu)成容量巨大的抗原識別受體庫，即免疫組庫。在個體水平，每個機體的免疫組庫是有差別的，它取決于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)位點的遺傳多態(tài)性、抗原接觸史及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與修復(fù)能力。近年，隨著基因擴增和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，免疫組庫高通量測序及臨床應(yīng)用成為生物信息學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱點，本文就該技術(shù)在PBC中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 TCR免疫組庫與PBC

T淋巴細(xì)胞通過TCR識別并清除外環(huán)境中的病原體及其產(chǎn)生的毒素、內(nèi)環(huán)境中因基因突變產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞、自身凋亡組織細(xì)胞或自身變性抗原，保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。TCR由α/β或γ/δ異源二聚體組成，參與特異性免疫應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞主要是α/β T淋巴細(xì)胞，占外周T淋巴細(xì)胞的90%～95%。TCR β鏈CDR3在抗原特異性識別中起關(guān)鍵作用，是直接與抗原肽的結(jié)合位點，其編碼基因位于人類7號染色體(7q34)，全長620 kb，由50多個可變區(qū)(V區(qū))基因片段、2組上游D基因片段/下游恒定區(qū)(C區(qū))基因片段、6～7個J區(qū)基因片段組成，這些基因在T淋巴細(xì)胞發(fā)育早期不連續(xù)分布，在胸腺內(nèi)原始T細(xì)胞階段，D-J區(qū)片段連接為DJ片段；在成熟T淋巴細(xì)胞階段，V、DJ、C區(qū)基因片段相連成VDJC片段。

據(jù)推測，胚系VDJC基因片段隨機組合、重排以及TCR α/β鏈和γ/δ鏈V區(qū)基因重排產(chǎn)生的TCR克隆數(shù)量高達(dá)1015～1018，構(gòu)成多樣性極其豐富的T淋巴細(xì)胞抗原受體庫，即TCR免疫組庫，是機體所有功能性T淋巴細(xì)胞總和。不同T淋巴細(xì)胞克隆有不同序列或長度的TCR-CDR3基因，翻譯出不同的CDR3多肽序列，從而反映T淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)。在發(fā)生特異性免疫應(yīng)答時，TCR多樣性發(fā)生變化，出現(xiàn)寡克隆甚至單克隆擴增，隨著胸腺再生，大量原始T淋巴細(xì)胞增殖，TCR免疫組庫多樣性得以恢復(fù)和重建。

自身抗原特異性T淋巴細(xì)胞克隆擴增在自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。PBC主要靶抗原是位于線粒體內(nèi)膜上參與能量代謝的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，免疫熒光檢測顯示AMA靶抗原均勻分布于患者肝臟膽管上皮細(xì)胞，且PBC患者膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞表達(dá)大量的MHCⅠ、Ⅱ類分子以及免疫識別所需的淋巴細(xì)胞共刺激分子和細(xì)胞間黏附分子，提示抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞損傷。

在特異性抗原的刺激下，TCR譜出現(xiàn)的選擇性分布異常預(yù)示著相應(yīng)T淋巴細(xì)胞的克隆擴增性增殖及功能性改變。鮑俊杰等[3]利用擴增子救援多重PCR(amplicon rescued multiplex PCR,arm-PCR)技術(shù)和高通量測序技術(shù)，半定量擴增并測序了7例PBC患者CD4+TCR Vβ鏈的CDR3序列，初步建立了PBC患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞TCR Vβ鏈CDR3免疫組庫，通過與健康對照組比較，初步篩選出4種優(yōu)勢取用氨基酸序列，提示特征性(具有特定性TCR Vβ CDR3序列)的CD4+T淋巴細(xì)胞大量克隆擴增可能是PBC發(fā)生發(fā)展的重要因素。但該研究例數(shù)較少，有待通過大范圍的體內(nèi)和體外試驗進(jìn)一步驗證。

2 BCR免疫組庫與PBC

BCR具有抗原結(jié)合特異性，在同一個體內(nèi)，其多樣性高達(dá)109～1012，構(gòu)成容量巨大的BCR庫，賦予個體識別各種抗原，產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答的巨大潛能。BCR即膜表面免疫球蛋白，是B淋巴細(xì)胞特異性識別和結(jié)合抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，主要由兩條重鏈和兩條輕鏈連接而成，其中重鏈(H鏈)分為V區(qū)、C區(qū)、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)；而輕鏈(L鏈)則只有V區(qū)和C區(qū)。V區(qū)由VH和VL兩個結(jié)構(gòu)域組成，各有3個CDR即CDRl、CDR2和CDR3。決定B淋巴細(xì)胞識別抗原的關(guān)鍵部位是最具多樣性的重鏈CDR3區(qū)，其多樣性的產(chǎn)生源于IGHV(51個功能性基因片段)末端-IGHD(23個功能性基因片段)-IGHJ前端(6個功能性基因片段)基因重排及V-D和D-J連接時非模板依賴性核苷酸插入或剪切和體細(xì)胞高頻突變等。

為了解PBC患者潛在的自身抗體特點及整體免疫功能狀態(tài)，F(xiàn)oreman等[4]采用免疫掃描分析技術(shù)比較了35例PBC患者和18例健康對照者IgM、IgG和IgA BCR VH家族基因取用率，除部分患者存在VH3a和VH4家族BCR寡克隆擴增外，并未發(fā)現(xiàn)個體內(nèi)和個體間IgG、IgA和IgM CDR3區(qū)常見的克隆擴增有明顯不同。

Tan等[5]采用多重PCR結(jié)合高通量測序技術(shù)對43例PBC患者Ig基因進(jìn)行研究，通過與健康對照者比較，發(fā)現(xiàn)PBC患者存在14個B淋巴細(xì)胞克隆擴增、8個B淋巴細(xì)胞克隆消失的情況，與IgM相對升高現(xiàn)象一致；同時PBC患者特別在肝硬化階段，B淋巴細(xì)胞克隆多樣性、體細(xì)胞高頻突變及類別轉(zhuǎn)換現(xiàn)象明顯減少，熊去氧膽酸治療后克隆多樣性增加，IgM受體克隆擴增減少，但體細(xì)胞高頻突變現(xiàn)象沒有明顯變化。

3 免疫組庫測序技術(shù)

20世紀(jì)90年代初，Pannetier等[6]首次采用免疫掃描分析技術(shù)將CDR3多樣性和長度分布引入TCR受體庫研究，在此基礎(chǔ)上研發(fā)了免疫掃描譜系分析技術(shù)，該技術(shù)不僅能發(fā)現(xiàn)單/寡克隆增生的T淋巴細(xì)胞，還能提供T淋巴細(xì)胞應(yīng)答庫的組成信息，為疾病個體化診療提供了新的思路和方法，特別在自身免疫疾病TCR免疫組庫研究中有廣泛應(yīng)用[7-9]，但該技術(shù)僅能粗略分析CDR3多樣性或部分序列組成，若研究其與疾病或疾病活動度的關(guān)系、患病個體間及患病群體與健康群體間免疫組庫的差異，需進(jìn)一步在基因水平對其進(jìn)行深入研究。

以454測序系統(tǒng)、SOLiD系統(tǒng)和HiSeq基因組分析平臺為代表的第二代高通量測序技術(shù)，又稱“下一代”測序技術(shù)("Next-generation" sequencing technology，NGS)，為描繪免疫組庫的全貌提供了強有力的技術(shù)支撐[7-8]。NGS在實現(xiàn)低成本、高通量DNA測序的同時，因其顯著的測序深度，使判讀單個堿基的準(zhǔn)確性大為改觀。個體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生多達(dá)1012BCR和1012TCR，傳統(tǒng)的第一代測序技術(shù)根本無法快速地完成大規(guī)模的序列讀取和分析，NGS可從克隆型頻率、CDR3多樣性、CDR3序列分析、V等位基因確認(rèn)等角度對TCR/BCR免疫組庫進(jìn)行深度測序和分析，因此，NGS在TCR/BCR研究中已經(jīng)開始發(fā)揮重要作用[9-10]。

在基因擴增技術(shù)方面，NGS與多重PCR技術(shù)，特別是以arm-PCR的有效結(jié)合，使模板的擴增效率大大提高，具有較高的靈敏度和特異度，真正意義上使免疫組庫的建立變?yōu)楝F(xiàn)實。美國HudsonAlpha生物技術(shù)研究院研究員韓健博士研發(fā)的基于arm-PCR 技術(shù)的iCubate技術(shù)平臺可以使加樣后核酸提取、擴增、檢測操作在密閉空間內(nèi)自動進(jìn)行，提高同一反應(yīng)管內(nèi)多個目標(biāo)基因的擴增效率，減少操作污染，具有多重擴增、全自動、全封閉的特點。該研究團(tuán)隊成員王春林博士等[11]采用該技術(shù)從1例健康人外周血8個T淋巴細(xì)胞亞群中擴增出了與cDNA模板序列對應(yīng)的約167萬個有效序列，其中，CDR3序列共有約148萬個。鑒定了T淋巴細(xì)胞亞群10個最常見的TCRα和TCRβ序列，例如TCRα-CDR3區(qū)“APEAMGGSEKLV”多肽序列。

此外，Gao等[12]并未采用傳統(tǒng)的454測序系統(tǒng)或Illumina基因組分析平臺，而采用新開發(fā)的Ion Torrent個人基因組測序儀從腦膜瘤患者外周血中擴增出IgH V(D)J重組基因后進(jìn)行測序，整個過程在1 d內(nèi)完成，可以高效、低成本、便捷的監(jiān)測V(D)J基因重組情況，為免疫組庫研究提供了參考，具有較廣泛的應(yīng)用前景。

4 免疫組庫生物信息學(xué)分析

在免疫組庫數(shù)據(jù)分析方面，韓健博士成立的iRepretoire公司以免疫組庫方面的產(chǎn)品和服務(wù)為主，研究者注冊并登陸該公司網(wǎng)站后，將測序的原始數(shù)據(jù)上傳，利用iRmap軟件在除去數(shù)據(jù)中的冗余序列、短片段序列及測序質(zhì)量差的序列后，將數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫IMGT(http://www.imgt.org)進(jìn)行比對查詢，根據(jù)IGH-CDR3區(qū)V、J、D各區(qū)段的特點鑒定出每個樣本的CDR3多肽序列，最后通過2D熱力圖、CDR3列表、D50、樹形圖、V取用分布、CDR3長度分布、N端添加的堿基數(shù)分布等參數(shù)和圖表來描述樣本的免疫學(xué)特征。國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所與韓健博士、王春林博士合作，已建立起完整的免疫組庫研究技術(shù)平臺，開展了包括中國正常新生兒的免疫組庫、正常妊娠及妊娠高血壓孕婦的免疫組庫、尋常型銀屑病的免疫組庫在內(nèi)的多項研究[13-16]，目前正與北京佑安醫(yī)院合作開展PBC患者BCR免疫組庫研究，從而了解中國各類疾病的免疫組庫的變化信息，為用免疫組庫技術(shù)篩選各型疾病的診斷及治療標(biāo)志物以及臨床治療提供指導(dǎo)參考。

此外，Michaeli等[17]在沒有模板基因的情況下，整合不同軟件自主研發(fā)出具有高度模塊化的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，能自動分析NGS測序后Ig基因，有助于BCR免疫組庫多樣性的分析。

5 挑戰(zhàn)與展望

免疫組庫多樣性對健康起著至關(guān)重要的作用，多樣性程度越高越能有效抵抗病原體，亞型越少疾病易感性越高。目前研究顯示，健康個體免疫組庫多樣性程度高，無明顯偏移；亞健康或疾病狀態(tài)個體免疫組庫多樣性程度降低，甚至只有個別亞克隆存在。然而，免疫組庫多樣性受個體對特殊病原體抗原的暴露影響，研究中應(yīng)仔細(xì)評估患者的健康狀況。

在技術(shù)方面，免疫組庫測序研究的最大問題是擴增過程引入的偏差，arm-PCR克服了傳統(tǒng)多重PCR的缺限，整個反應(yīng)體系在指數(shù)增長期使用共同引物進(jìn)行擴增，所有目標(biāo)序列的擴增效率基本一致，使得同一反應(yīng)體系內(nèi)多個目標(biāo)基因可以同時高效擴增，因此，將arm-PCR應(yīng)用于免疫組庫的研究能夠如實地反映每個克隆的比例，確保不會造成偏移，可將每段CDR3序列都擴增出來?；赼rm-PCR技術(shù)的大樣本高通量測序研究PBC患者的免疫組庫特征，將進(jìn)一步揭示PBC的免疫應(yīng)答機制，為尋找生物標(biāo)志物、療效監(jiān)測和免疫治療提供科學(xué)依據(jù)。

高通量測序技術(shù)和方法的成熟與進(jìn)步為研究PBC患者免疫組庫特征提供了新的機遇。但應(yīng)認(rèn)識到，目前高通量測序成本仍相對較高、產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，數(shù)據(jù)的解讀和分析過程復(fù)雜，現(xiàn)有的臨床研究受樣本例數(shù)限制存在一定的局限性等問題，免疫組庫應(yīng)用于臨床尚需軟硬件和大數(shù)據(jù)研究的探索與積累。

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引證本文：ZHAO DT, GUO CL, YAN HP. Research advances in immune repertoire and high-throughput sequencing in primary biliary cholangitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1387-1390. (in Chinese) 趙丹彤， 郭昌龍， 閆惠平. 免疫組庫及高通量分析技術(shù)在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的研究進(jìn)展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(7): 1387-1390.

(本文編輯：王 瑩)

Research advances in immune repertoire and high-throughput sequencing in primary biliary cholangitis

ZHAODantong,GUOChanglong,YANHuiping.

(ClinicalResearchCenterforAutoimmuneLiverDisease&ClinicalLaboratoryCenter,BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Primary biliary cholangitis (PBC) is an autoimmune liver disease with unclear pathogenesis. The amino acid composition and sequence in the complementarity-determining region 3 of T cell receptor (TCR) and B cell receptor (BCR) are highly diverse, which forms a large antigen recognition receptor repertoire, i.e., immune repertoire. In recent years, second-generation sequencing techniques combined with multiplex PCR or amplicon rescue multiplex PCR have been used to study the features of immune repertoire in PBC patients, and it has been found that PBC patients have clonal expansion of specific CD4+T lymphocytes, clonal diversity of B lymphocytes, somatic hypermutation, and reduction in class switch, as well as increase in clonal diversity after treatment with ursodeoxycholic acid. These findings need to be confirmed by large-scale in vivo and in vitro studies and different immune repertoire research strategies.

liver cirrhosis, biliary; immunerepertoire; complementarity determining regions; review

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.041

2017-01-09；

2017-01-26。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(81400609)；北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項——“揚帆”計劃資助項目(ZYLX201711)

趙丹彤(1980-)，女，副研究員，博士，主要從事肝病相關(guān)實驗診斷學(xué)研究。

R575.22； R446.62

A

1001-5256(2017)07-1387-04