磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展

任志忠， 張躍偉

(遵義醫(yī)學(xué)院， 貴州 遵義 563000)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展

任志忠， 張躍偉

(遵義醫(yī)學(xué)院， 貴州 遵義 563000)

肝癌是常見惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的肝癌治療方法各自存在局限性。磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)3是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過程，是一種肝癌特異性癌胚抗原。GPC3在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。GPC3不僅在肝癌診斷方面有獨(dú)特價(jià)值，在肝癌治療方面更有重要作用。介紹了應(yīng)用GPC3瘤苗、GPC3抗體、GPC3基因及靶向等治療手段,為肝癌治療提供了新的思路。

肝腫瘤； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖類； 治療； 綜述

肝癌是威脅人類健康重大疾病之一，發(fā)病率及病死率在我國(guó)均居第4位[1]。目前公認(rèn)的治療方案是以手術(shù)切除為核心的多學(xué)科綜合治療，近期療效雖有提高，但遠(yuǎn)期療效仍不理想，因此探究治療肝癌更加有效的新策略是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[2]。自1996年磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Gypican，GPC)3被發(fā)現(xiàn)以來[3]，其在肝癌中的作用機(jī)制以及對(duì)肝癌的診治價(jià)值已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

GPC3是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素(heparan sulphate,HS)糖蛋白，是肝癌特異性相關(guān)抗原。它是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖三者共價(jià)連接的復(fù)雜糖復(fù)合物, 通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜表面。GPC3基因定位于人染色體Xq26, 基因組結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)大約900 kb，具有中央球狀結(jié)構(gòu)空間、C′端糖胺聚糖側(cè)鏈連接位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。其HS基與生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和黏附分子等相互作用, 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附和遷移等。它主要通過Wnts信號(hào)途徑發(fā)揮作用，通過自分泌和旁分泌的方式來激活經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑使Wnt基因高表達(dá), 而Wnt基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠促進(jìn)多種腫瘤組織生長(zhǎng)。GPC3表達(dá)特點(diǎn)是在肝癌組織中過表達(dá)，而在正常肝組織不表達(dá)或低表達(dá)，基于GPC3特有的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn), 將其作為肝癌的治療靶點(diǎn)，有可能成為治療肝癌的一把利劍。本文就GPC3在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展作一概述。

1 GPC3基因治療對(duì)肝腫瘤增殖的影響

目前已經(jīng)有研究[4-5]顯示，通過GPC3 microRNA(miRNA)、小發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)和小干擾RNA(small interfering,siRNA)介導(dǎo)的基因治療肝癌取得良好的療效。通過敲除肝癌細(xì)胞中GPC3基因，Wnt信號(hào)通路發(fā)生改變，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平升高，促進(jìn)Bax/Bcl-2/細(xì)胞色素c/caspase-3通路功能障礙，抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，并且逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥耐藥性[6-7]。由于肝癌細(xì)胞特殊的生物學(xué)行為干預(yù)了GPC3基因正常轉(zhuǎn)錄，因此楊婕等[8]構(gòu)建4種GPC3-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，以Real-time PCR、Western Blot法觀察GPC3基因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示4種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中shRNA1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞效率>85%，在mRNA水平的沉默效率為89.3%，GPC3蛋白表達(dá)顯著抑制。特異性shRNA干預(yù)GPC3轉(zhuǎn)錄可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，與抗腫瘤藥物協(xié)同抑制癌細(xì)胞增殖，提示GPC3基因是潛在治療肝癌的新靶點(diǎn)[8-9]。

另有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)將GPC3基因轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞(DC)與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells,CIK)共同培養(yǎng)抗腫瘤，可引起特異性免疫反應(yīng)。DC-GPC3顯著促進(jìn)自體CIK分化，以及抗腫瘤細(xì)胞因子IFNγ分泌。DC-GPC3-CIK能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)殺傷腫瘤活性。

過度表達(dá)的GPC3通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制肝癌細(xì)胞增殖。GPC3基因重組轉(zhuǎn)染在Huh7和SK-Hep-1兩個(gè)肝癌細(xì)胞系，應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法證實(shí)GPC3過度表達(dá)，通過負(fù)調(diào)節(jié)IGF2和FGF2途徑，有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[11]。經(jīng)過負(fù)向調(diào)節(jié)使GPC3過度表達(dá)，逆向誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制肝癌細(xì)胞增殖，成為一種新的治療思路。

2 多肽GPC3瘤苗及肝癌微創(chuàng)介入誘導(dǎo)機(jī)體GPC3特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)免疫反應(yīng)

GPC3多肽疫苗通過激活患者自身免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。Sawada等[12]應(yīng)用多肽疫苗治療33例晚期肝癌患者，第1、15、29天皮下注射多肽GPC3瘤苗遞增劑量依次為0.3、1.0、3.0 mg，結(jié)果證實(shí)GPC3多肽疫苗具有良好的安全性和耐受性。接受GPC3多肽疫苗治療的肝癌患者平均中位生存期為9.0個(gè)月。根據(jù)實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，4例患者獲得完全緩解、1例部分緩解、19例病情穩(wěn)定在2個(gè)月內(nèi)。獲得部分緩解患者鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶和肝內(nèi)2個(gè)病灶明顯縮小，并且胸骨轉(zhuǎn)移病灶在第3次疫苗注射后1個(gè)月出現(xiàn)液化壞死。這些患者均誘導(dǎo)GPC3特異性CTL反應(yīng)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)法觀察疫苗注射后CTL頻數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)CTL頻數(shù)≥50(n=15)，中位生存時(shí)間12.2個(gè)月，CTL頻數(shù)<50(n=18)，中位生存時(shí)間8.5個(gè)月，可見GPC3特異性CTL頻數(shù)越多，中位生存時(shí)間越長(zhǎng)并且總生存期也越長(zhǎng)，特異性CTL頻數(shù)可以作為GPC3多肽疫苗治療后肝癌患者總生存期的預(yù)測(cè)指標(biāo)。隨后該團(tuán)隊(duì)臨床研究又發(fā)現(xiàn)GPC3疫苗治療肝癌誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)瘤體和瘤周的病理學(xué)證據(jù)。1例經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療失敗、索拉非尼治療無效的巴塞羅那分期C期肝癌患者，間隔25 d接受2次GPC3多肽瘤苗皮下注射治療，注射后患者出現(xiàn)發(fā)熱、肝損傷和全身乏力等表現(xiàn)，第二次注射后癥狀顯著。第二次注射后第10天增強(qiáng)CT顯示，肝臟腫瘤顯著壞死、縮小，但與治療前相比，右心房癌栓明顯增大，30 d后該患者死于循環(huán)衰竭。2周后尸檢發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)殘留癌灶和壞死腫瘤與正常肝組織交接區(qū)域，而瘤周正常肝組織中則未見CD8+T淋巴細(xì)胞。右心房癌栓卻只有微少量CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。該病例通過免疫組化方法證實(shí)大量的浸潤(rùn)型CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)入殘存的腫瘤組織中，但是還不能證實(shí)，這些T淋巴細(xì)胞能夠?qū)Ρ磉_(dá)GPC3的肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。所以該研究團(tuán)隊(duì)從已經(jīng)完成的I期臨床研究中，應(yīng)用HLA-A2-限制性GPC3多肽疫苗治療人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*02:07陽(yáng)性肝癌，獲取部分緩解療效的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，從中培養(yǎng)出GPC3肽特異性CTL克隆，進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，克隆的CTL只對(duì)表達(dá)內(nèi)源性GPC3和HLA-A*02:07陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有良好的親和力，并分泌IFNγ發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[14]。上述研究初步形成GPC3多肽疫苗皮下注射能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生GPC3特異性CTL治療肝癌的較完整的證據(jù)鏈條。

另外有學(xué)者[15]證實(shí)，肝癌微創(chuàng)介入術(shù)后壞死的腫瘤細(xì)胞或暴露的腫瘤抗原物質(zhì)，同樣能夠誘導(dǎo)機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。Nobuoka等[15]將27例肝癌患者平均分為3組進(jìn)行射頻消融(radiofrequencey ablation,RFA)、手術(shù)切除和TACE治療。在3種方法治療后循環(huán)血中GPC3特異性CTL增加情況：RFA組5例，TACE組4例，手術(shù)切除組1例。RFA術(shù)后GPC3-CTL數(shù)量增加明顯高于手術(shù)切除。同樣在帶瘤小鼠模型中，RFA術(shù)后GPC3-CTL頻率也明顯高于手術(shù)切除。并且通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)方法證實(shí)，RFA及TACE術(shù)后顯色斑點(diǎn)個(gè)數(shù)及大小均明顯大于術(shù)前，證實(shí)RFA及TACE術(shù)后GPC3表達(dá)增加且誘導(dǎo)特異性的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。通過外源或內(nèi)源性方法激活腫瘤相關(guān)抗原的特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，這對(duì)于未來肝癌免疫治療進(jìn)展具有重要意義。

3 GPC3抗體治療肝癌的研究進(jìn)展

GPC3抗體是目前肝癌免疫治療領(lǐng)域引人關(guān)注的研究方向，包括GC33、HN3、py7、HS20等。GC33是目前從功能、基礎(chǔ)研究到臨床研究較為深入的GPC3抗體，并且已經(jīng)注冊(cè)了臨床研究(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00746317)。

GC33是一種針對(duì)GPC3新型重組人單克隆抗體，與GPC3有很高的親和力。GC33依靠抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，通過識(shí)別GPC3外功能區(qū)來發(fā)揮抗腫瘤活性[16]。Ishiguro等[17]在裸鼠的肝癌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GC33抗體能夠顯著降低表達(dá)GPC3的肝癌鼠血清中GPC3和AFP水平,對(duì)表達(dá)GPC3的肝癌細(xì)胞和移植于鼠體內(nèi)的Hun7人肝癌細(xì)胞具有殺傷作用。2012年，美國(guó)哈佛大學(xué)研究人員進(jìn)行一項(xiàng)GC33抗體治療肝細(xì)胞癌(HCC)的一期臨床研究[18]，入組20例巴塞羅那分期C期肝癌患者采用靜脈滴注方法，GC33抗體遞增劑量(2.5、5、10、20 mg/kg，1次/周)，其中15例患者至少完成4次治療。研究結(jié)果顯示，在GPC3高表達(dá)組中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間為26周，AFP較治療前降低。GPC3低表達(dá)或者無表達(dá)組，中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間僅為7.1周。26周以內(nèi)病情穩(wěn)定患者的共同特點(diǎn)是血清GPC3高表達(dá)，提示GPC3高表達(dá)的HCC患者接受GC33抗體治療可能會(huì)取得更好療效。大部分患者在第一次治療后出現(xiàn)一級(jí)或者二級(jí)不良事件，無四級(jí)或五級(jí)不良事件發(fā)生，表明GC33抗體具有較好的安全性。隨后，日本學(xué)者[19]在此基礎(chǔ)上，以13例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，觀察應(yīng)用GC33抗體的臨床療效。研究設(shè)計(jì)了“3+3”劑量爬坡實(shí)驗(yàn)，以確定GC33抗體靜脈途徑應(yīng)用的最大耐受劑量。劑量選擇標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)GC33抗體治療腫瘤移植小鼠的前期研究結(jié)果[17]，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)劑量組，5 mg/kg 4例，10 mg/kg 3例，20 mg/kg 6例，持續(xù)靜脈滴注，30～90 min，1次/周。研究結(jié)果：13例患者中，7例患者病情穩(wěn)定，3例穩(wěn)定時(shí)間超過5個(gè)月；69%(9/13)患者血清AFP下降。無嚴(yán)重不良事件發(fā)生，無因不良事件致死或者停止治療病例，初步研究結(jié)果證實(shí)，靜脈滴注GC33治療HCC具有良好的安全性和療效，耐受劑量可達(dá)每周20 mg/kg。

HN3抗體主要是識(shí)別功能表位和抑制Wnt信號(hào)通路。也有文獻(xiàn)[20]報(bào)道HN3的基本作用機(jī)制可能是阻滯肝癌細(xì)胞周期的G1期相關(guān)蛋白的信號(hào)。與GC33相比HN3有3個(gè)特性;(1)能直接抑制肝癌細(xì)胞的增殖；(2)是一種單域抗體；(3)是完全的人類蛋白。yp7抗體識(shí)別C-末端表位但不抑制Wnt信號(hào)。這兩者都是融合在假單胞菌屬外毒素A的一個(gè)片段來產(chǎn)生免疫抗體的[21]。ir700-HN3抗體是一個(gè)重鏈可變區(qū)抗體，與細(xì)胞表面的GPC3分子有很好親和力。有學(xué)者[22]通過應(yīng)用放射性同位素111In、125I標(biāo)記的ir700-HN3抗體，通過ir700-HN3抗體在體內(nèi)腫瘤分布情況來估測(cè)抗體進(jìn)入腫瘤的數(shù)量以及到達(dá)腫瘤的范圍，從而評(píng)估應(yīng)用該抗體治療肝腫瘤的療效。另外，該學(xué)者通過比較ir700-HN3抗體與yp7抗體，證實(shí)重鏈HN3抗體相比傳統(tǒng)yp7抗體表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢(shì)特性，為抗肝癌的分子靶向抗體設(shè)計(jì)了一個(gè)新的平臺(tái)。

此外,人類單克隆GPC3的HS靶向抗體通過抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)來發(fā)揮治療肝癌的作用。HS20抗體針對(duì)GPC3的HS鏈，抑制Wnt3a/β-連環(huán)蛋白的活化[23]，并擾亂Wnt3a和GPC3的作用，阻斷Wnt a/b-catenin信號(hào)通路，而且HS20抗體在小鼠體內(nèi)沒有顯示出毒性，體現(xiàn)出良好的安全性[24]。

目前尚無研究證實(shí)，肝癌患者經(jīng)過GPC3抗體治療后腫瘤內(nèi)GPC3表達(dá)情況是否改變。有專家[25]認(rèn)為，GPC3抗體治療肝癌后，GPC3表達(dá)下降，會(huì)降低抗體藥物的療效，但機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 GPC3作為靶向載體治療肝癌的其他應(yīng)用

GPC3靶向光免疫治療聯(lián)合納米白蛋白結(jié)合型紫杉醇是一種治療肝癌的有效方法。Hanaoka等[26]將IR700-YP7標(biāo)記GPC3抗體聯(lián)合納米白蛋白結(jié)合型紫杉醇靜脈注射到肝癌小鼠體內(nèi)，發(fā)揮GPC3抗體特異性腫瘤導(dǎo)向作用，靶向引導(dǎo)IR700-YP7標(biāo)記的GPC3抗體沉積在A431/G1細(xì)胞腫瘤內(nèi)，而后應(yīng)用波長(zhǎng)為960±20 mm紅外光照射腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞死亡，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。這一研究說明GPC3靶向光免疫治療有著良好的應(yīng)用前景。

肝癌細(xì)胞中miRNA-520c-3p與GPC3蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miRNA-520c-3p表達(dá)增加能夠降低GPC3蛋白表達(dá)水平。通過將miRNA-520c-3p轉(zhuǎn)染到HCC患者體內(nèi)，降低GPC3蛋白水平來抑制肝癌細(xì)胞增殖及侵襲[27]。

GPC3可誘導(dǎo)Huh7肝癌細(xì)胞增殖。YAP(Yes-associated protein)在肝癌中過表達(dá)，已被確定為Hippo信號(hào)通路(調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和凋亡)的關(guān)鍵效應(yīng)分子，并與GPC3在肝癌發(fā)展過程中起到協(xié)同作用[28]。膜聯(lián)蛋白-V-FLUOS凋亡實(shí)驗(yàn)[29]表明，重組人YAP-1有效地阻止GPC3引發(fā)的Huh7細(xì)胞增殖，從而抑制肝癌的發(fā)生。Magistri等[30]采用3種人肝癌細(xì)胞系(Hep3B、PLC/PRF/5和SK-HEP-1)和1個(gè)Hhresponsive肝星狀細(xì)胞(HSC)系(LX-2)，開展了2個(gè)HCC-to-HSC旁分泌的體外模式，包括共同培養(yǎng)和條件培養(yǎng)模式，證實(shí)了3個(gè)肝癌細(xì)胞系具有降低HSC的能力。GPC3通過Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)HSC。應(yīng)用重組GPC3試劑降低了LX-2的活性，抑制了Hedgehog的靶點(diǎn)基因，進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞系降低HSC能力的作用。另外重組GPC3試劑作為Hh基因調(diào)控員，促進(jìn)了Hh基因?qū)SC能力的提升作用，從而抑制腫瘤增殖?？傊? 以GPC3為靶向載體治療肝癌已出現(xiàn)各種方式和方法, 相信不久以GPC3作為肝癌治療靶點(diǎn)的研究將會(huì)取得重大進(jìn)展。

5 展望

GPC3在肝癌發(fā)生和發(fā)展中作用機(jī)制的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。GPC3在肝癌診斷方面亦有其獨(dú)特的價(jià)值[31-32]。GPC3瘤苗、GPC3抗體、GPC3基因及靶向等治療手段是治療肝癌的諸多利劍。隨著對(duì)GPC3功能的深入研究及開發(fā)GPC3在肝癌診療中的新應(yīng)用, 必將大大推動(dòng)肝癌治療的發(fā)展, 造福于廣大肝癌患者。

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(本文編輯：林 姣)

Advances in the application of GPC3 in treatment of liver cancer

RENZhizhong,ZHANGYuewei.

(ZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563000,China)

Liver cancer is one of the most common malignant tumors in the world, and traditional liver cancer treatment methods have their own limitations. Glypican-3 (GPC3) is a cell-surface heparan sulfate proteoglycan and is involved in the regulation of individual development and cell proliferation and differentiation. It is also a hepatoma-specific carcinoembryonic antigen. The mechanism of action of GPC3 in the development and progression of liver cancer has become a hot research topic. GPC3 not only has a unique value in the diagnosis of liver cancer, but also plays an important role in the treatment of liver cancer. This article also introduces the application of GPC3-derived tumor vaccines, GPC3 antibodies, GPC3 gene therapy, and targeted therapy and brings new ideas for the treatment of liver cancer.

liver neoplasms； glypicans； therapy； review

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.037

2017-01-02；

2017-01-24。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81571783)

任志忠(1990-)，男，主要從事肝腫瘤的介入治療及免疫微環(huán)境變化。

張躍偉，電子信箱：zhangyuewei1121@sina.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)07-1369-04