抗體介導的假性血小板減少及其解決方法*

朱建鋒，郭瑋，潘柏申

(復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032)

·專題筆談·

抗體介導的假性血小板減少及其解決方法*

朱建鋒，郭瑋，潘柏申

(復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032)

假性血小板減少(PTCP)是指血液分析儀計數(shù)得到的血小板結果明顯低于血小板真實值。盡管存在多種原因可導致PTCP，但臨床上主要用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，故PTCP以乙二胺四乙酸(EDTA)引起的血小板假性減少(EDTA-PTCP)為主。鑒別EDTA-PTCP快速、直觀的方法是制作血涂片并通過顯微鏡觀察血小板，一旦發(fā)現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，則用其他方法計數(shù)血小板以避免誤診和其他不必要的檢查、治療及相關費用。

假性血小板減少；抗凝劑；解決方法

假性血小板減少(pseudothrombocytopenia，PTCP)是指抗凝血液中血小板聚集，導致血液分析儀無法識別血小板，引起血小板計數(shù)結果明顯低于血小板真實值。這種情況在臨床易被誤診為免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，進而引起不必要的檢查、治療及相關費用。

引起PTCP的原因主要有以下3種：(1)抗體介導的血小板聚集，最常見原因是抗凝劑乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)引起的假性血小板減少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)和血小板衛(wèi)星現(xiàn)象；(2)未正確采集血標本或抗凝劑未充分混勻而致血小板活化引起血小板聚集；(3)其他一些巨大血小板引起血小板計數(shù)假性減低。本文主要討論抗體介導的PTCP。

1 抗體介導的PTCP的主要類型

1.1EDTA-PTCP 1951年，Proesche記載了EDTA作為一種抗凝劑可用于血液檢測，但直到1969年Gowland等[1]報道了2例EDTA-PTCP。EDTA-PTCP機制較復雜、尚不完全明確，主要是在體外受到免疫(血小板抗體)、化學(抗凝劑)和物理(溫度)等因素共同作用引起血小板假性減少現(xiàn)象。門診EDTA-PTCP發(fā)生率約0.09%～0.11%[2]，住院患者約1.9%[3]?？鼓齽〦DTA螯合鈣離子引起血小板膜蛋白構象改變，暴露抗原決定簇，與體內(nèi)一些自身抗體結合。這些抗體多數(shù)是4～20 ℃時反應活性最強的冷抗體，IgM出現(xiàn)頻率較IgG高，而IgA極少；而約20%在22 ℃與37 ℃時反應也較活躍，幾乎均為IgM型抗體。將患者血漿或血清與健康人EDTA抗凝血混合后能重現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，提示抗體直接作用的抗原廣泛存在[4]。

1.2枸櫞酸鹽引起PTCP 發(fā)生EDTA-PTCP時，枸櫞酸鹽常作為替代抗凝劑用于糾正EDTA引起的血小板聚集。但有10%～20%標本改用枸櫞酸鹽抗凝檢測后仍然存在血小板聚集，不能糾正EDTA-PTCP。因為枸櫞酸鹽螯合鈣離子，與體內(nèi)的一些自身抗體結合，發(fā)生血小板聚集現(xiàn)象。這些抗體多為IgM型，可能與37 ℃時EDTA抗凝劑誘導的PTCP為同一種抗體類型[2]。

1.3其他抗凝劑引起PTCP 文獻報道有許多替代的螯合或非螯合作用的抗凝劑[5-12]，如肝素鈉、草酸銨、氟化鈉、β-羥乙基茶堿、枸櫞酸鈉-5-磷酸吡哆醛-Tris緩沖液(citrate-pyridoxalphosphate-Tris，CPT)、枸櫞酸-枸櫞酸鈉-葡萄糖(acid-citrate-dextrose,ACD)、枸櫞酸鈉-茶堿-腺苷-潘生丁(citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole,CTAD)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)、疊氮化鉀、氯化鈣/肝素鈣等。盡管這些抗凝劑常作為一種替代抗凝劑，但實際上很多抗凝劑會引起PTCP，故不能完全適用于常規(guī)血液檢查。CPT被證實能有效防止血小板聚集，同時能獲得準確的血細胞計數(shù)結果，有望取代EDTA，但需要校正紅細胞壓積與體積，且檢測成本較EDTA高，尚未推廣使用[13]。德國的一項研究顯示，以硫酸鎂為抗凝劑的商品化采血管可用于糾正PTCP，同時不影響紅細胞、白細胞及白細胞分類等結果[14]。

1.4血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導致PTCP 1963年，F(xiàn)ield和MacLeod最早記載了一位14歲少年的抗凝外周血涂片中發(fā)現(xiàn)5～10個血小板圍繞于中性分葉核粒細胞外圍，偶見20個以上血小板；而單核、淋巴細胞未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象[15]。隨后陸續(xù)有少量報道[16-17]，主要見于體外EDTA抗凝標本中，以血小板聚集在多形核細胞(polymorphonuclear，PMN)周圍的形態(tài)特征而得名[18]。也有單核與淋巴細胞衛(wèi)星現(xiàn)象報道[19-20]。它是一種自身抗體引起的免疫反應現(xiàn)象，只是不同于血小板聚集抗體類型，為37 ℃無活性的IgG?？贵w作為連接血小板和PMN之間的橋梁，將靶抗原血小板GPⅡb/GPⅢa和中性粒細胞FcγRⅢ受體連接起來，形成血小板圍繞在分葉核細胞表面的現(xiàn)象。血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導致的血小板假性減低程度沒有EDTA-PTCP嚴重，對儀器血小板計數(shù)結果的影響相對較小。也正因為如此，某種程度上可能低估了血小板衛(wèi)星現(xiàn)象的發(fā)生率。

1.5藥物治療引起PTCP 一些單抗藥物治療后可發(fā)生PTCP，經(jīng)皮冠脈造影患者為預防血栓形成，服用阿昔單抗時會出現(xiàn)PTCP，發(fā)生率為2.1%。對于此類患者必須明確真性或假性血小板減少，若為真性血小板減少，則必須停藥，同時需輸注單采血小板；而PTCP則可繼續(xù)抗凝治療。文獻報道1例ITP患者接受TPO(thrombopoietin，TPO)受體激動劑藥物羅米司亭治療后，出現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，導致血小板假性減低發(fā)生[21]；此時需明確是否為EDTA-PTCP，避免錯誤評估藥物療效。

2 抗體介導的PTCP的發(fā)生機制

EDTA-PTCP產(chǎn)生的確切機制尚不完全清楚，但通常認為是一種免疫機制介導的現(xiàn)象，發(fā)生在體外血液中，EDTA依賴性血小板自身抗體誘導血小板聚集。Pegels等[22]發(fā)現(xiàn)一種血小板無力癥，即Glanzmann病(Glycoprotein GPⅡb/GPⅢa缺失，血小板膜糖蛋白GPⅡb/GPⅢa缺失)，無此現(xiàn)象發(fā)生，從而推測抗體作用位點是GPⅡb/GPⅢa。研究發(fā)現(xiàn)EDTA-PTCP的自身抗體主要作用于血小板GPⅡb[23]。GPⅡb是一種Ca2+依賴蛋白質(zhì)，Ca2+存在時其與GPⅢa組成異源二聚體。當Ca2+濃度降低時，GPⅡb/GPⅢa二聚體解離，顯露出GPⅡb上的隱性表位，而一些自身抗體正是作用于這一隱性表位，從而引起血小板聚集。因此，該現(xiàn)象是EDTA抗凝劑對鈣離子的螯合效應所致，并非EDTA本身引起，所以具有螯合作用的枸櫞酸鈉等抗凝劑一定程度上均會引起血小板假性降低。

血小板衛(wèi)星現(xiàn)象導致PTCP發(fā)生的機制可能為體內(nèi)一些自身抗體可作為橋梁連接血小板和PMN，由于PMN細胞表面的是FcγRⅢb結構，而自然殺傷細胞和單核細胞表面的是FcγRⅢa結構。PMN以Fab端連接血小板出現(xiàn)血小板圍繞的特征，而NK細胞和單核細胞以Fc端鏈接血小板，從而引發(fā)Fc端介導的吞噬作用，周圍血涂片可見血小板被吞噬現(xiàn)象[24]。至于何時發(fā)生血小板聚集現(xiàn)象或血小板衛(wèi)星現(xiàn)象，原因仍不清楚，可能是存在兩種針對不同血小板GPⅡb/GPⅢa的自身抗體。而藥物引起PTCP的產(chǎn)生機制與EDTA-PTCP相似，是人鼠嵌合Fab片段單抗能結合血小板GPⅡb/GPⅢa復合物的β3亞基，引起血小板膜構象改變，進而發(fā)生EDTA-PTCP[25]。

3 檢測PTCP的重要性

PTCP可發(fā)生于自身免疫病、炎癥、病毒或細菌感染、代謝綜合征、腫瘤、干細胞移植患者及妊娠者中。健康人群中也可發(fā)生PTCP，且維持長久，提示這類自身抗體與人群未來患病之間并無關聯(lián)。PTCP患者無出血或血栓形成的風險，不必進行其他實驗室檢查或治療。但有報道患者因PTCP而被收治入院進行不必要的治療[26-27]，如單采血小板輸注，骨髓穿刺與活檢術，長期皮質(zhì)醇激素治療，脾切除手術，也有誤診為血小板減少癥，給患者帶來不必要的身心壓力。報道對低溫心臟手術的PTCP患者，即使體溫降到28～30 ℃仍可行冠狀動脈旁路移植術或瓣膜置換手術[28]。Sweeney等[29]報道輸注PTCP供體血液后未見輸血不良反應及PTCP，提示PTCP健康人群血液制品可用于輸血治療。另有報道，急性冠脈綜合征患者中，因PTCP而未能及時進行肝素、溶栓治療導致不良后果發(fā)生[30]。所以PTCP的重要性在于準確判斷、及時糾正血小板結果，從而避免不合理的檢查、輸血及疾病誤診、誤治。

4 實驗室解決方法

血小板聚集成團后體積大小等同或大于白細胞，根據(jù)血細胞分析儀的電阻抗原理，儀器將聚集成團的血小板誤認為白細胞進行計數(shù)，導致白細胞計數(shù)假性升高和PTCP。因此，檢驗人員必須重視EDTA-PTCP，確定EDTA-PTCP快速、直觀的方法是血涂片人工顯微鏡檢查，一旦發(fā)現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象，標本需采用其他方法檢測。而在添加上述抗凝劑的采血管尚未商品化之前，更換枸櫞酸鈉抗凝劑或末梢血采血檢查具有一定可操作性。然而仍需警惕無法糾正的少數(shù)案例，即更換枸櫞酸鈉抗凝管也不能糾正血小板結果的情況。而末梢血顯微鏡計數(shù)血小板盡管存在重復性與精密度等問題，目前而言仍不失為一種血小板計數(shù)的“金標準”方法。文獻報道外周血涂片顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)血小板聚集后的解決方法[4]：首先排除靜脈穿刺不順、抗凝劑比例不當或標本未及時混勻等不恰當?shù)臉吮静杉绞剑蝗缓笫褂?7 ℃預熱管采集，并置于37 ℃恒溫箱中直至檢測，采用急診或優(yōu)先模式上機檢測，確保標本未冷卻，不推薦對冷卻標本反復溫浴、檢測；按上述操作檢測后，仍有10%～20%病例存在EDTA-PTCP，則提示存在IgM抗體。此類標本使用枸櫞酸鈉管也不能糾正血小板結果，建議采集末梢血進行改良牛鮑氏手工計數(shù)血小板；最后登記患者信息，告知患者下次血常規(guī)檢查時需37 ℃恒溫采血，或末梢采血計數(shù)血小板。

總之，PTCP發(fā)生與血液分析儀自動化程度或真空采集管使用有密切關系，國外自動化程度起步較早，相應報道比較多且全面。隨著我國檢驗科自動化儀器及真空采集管的普遍運用，這種EDTA-PTCP也漸漸為檢驗工作者熟悉。盡管儀器能快速地提供血常規(guī)結果，局限在于不能很好地提示EDTA-PTCP，對于患者無瘀點、瘀斑等血小板減少癥相關表現(xiàn)的血小板嚴重減少標本必須進行顯微鏡人工鏡檢復核，可避免誤診以及所帶來的不必要后果。

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A

2017-03-03)

(本文編輯王海燕)

國家自然科學基金面上項目(81572064)；上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重要薄弱學科建設項目(2015ZB0201)。

朱建鋒，1977年生，男，主管技師，大學本科，主要從事外周血與骨髓細胞形態(tài)學檢查工作。

潘柏申，研究員，E-mail：pan.baishen@zs-hospitial.sh.cn。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.12