大米蛋白酶解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性及其分子質(zhì)量分布

楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，魏 康，馬海樂

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

大米蛋白酶解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性及其分子質(zhì)量分布

楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，魏 康，馬海樂*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

本文采用堿性蛋白酶酶解大米蛋白，研究了不同時間酶解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制活性，大米蛋白水解度，酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量及多肽分子質(zhì)量分布與酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的關(guān)系。結(jié)果表明：大米蛋白的水解度在15 min內(nèi)呈現(xiàn)線性增長，60 min后逐漸趨于平緩；75 min酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高（63.27%），但與60、90 min的ACE抑制率無顯著差異（P＞0.05）；酸溶蛋白和總蛋白含量隨著酶解時間的延長，均呈現(xiàn)上升的趨勢；多肽分子質(zhì)量分布在200～1000 Da的比例最高。

大米蛋白；ACE抑制肽；蛋白質(zhì)含量；分子質(zhì)量分布

大米蛋白是工業(yè)生產(chǎn)淀粉或糖的副產(chǎn)物，氨基酸組成平衡且富含必需氨基酸。然而，其中幾乎不溶于水的高含量的谷蛋白限制了大米蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，造成了優(yōu)質(zhì)蛋白資源的浪費(fèi)。研究表明，植物蛋白具有多種生物學(xué)活性，尤其是蛋白經(jīng)過酶解以后 （Kuba等，2009）。因此，制備活性多肽是對大米蛋白合理利用的一個有效途徑。

高血壓是一種慢性的心血管疾?。–hen等，2013），能引起中風(fēng)、慢性腎病、心臟衰竭和許多其他的并發(fā)癥，對于老年人更為嚴(yán)重（Bakris等，2009）。眾所周知，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）能將無活性的血管緊張素-I轉(zhuǎn)化為有活性的血管緊張素-Ⅱ，同時使緩激肽失活，從而達(dá)到升高血壓的目的。因此，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑能抑制ACE的活性，從而控制血壓 （Correa等，2014）。研究表明，從植物中提取的多肽具有高效的ACE抑制活性 （Ambigaipalan等，2015；Jia 等 ，2015；Qu等 ，2013；Jia等 ，2010；Vercruysse等，2009）。

堿性蛋白酶廣泛地應(yīng)用于蛋白酶解（Zhong等，2007；Zhu等，2006），并且具有比風(fēng)味蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，中性蛋白酶，胃蛋白酶，復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶更高的水解能力（Ambigaipalan等，2015；Ahn等，2012）。堿性蛋白酶可切割蛋白質(zhì)或肽的共價連接，并通過水解分解成小分子肽，蛋白水解的程度可以反映其水解過程。隨著酶解時間的延長，酶解液中的多肽含量逐漸增多，其中二肽和三肽不僅能快速被人體吸收，并且有很高的降血壓活性。因此，本文研究了大米蛋白在不同時間酶解后的ACE抑制活性，以及酶解產(chǎn)物中酸溶蛋白的含量和分子質(zhì)量分布的關(guān)系。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料 大米蛋白 （蛋白質(zhì)含量57.90%），由湖北京源山生物技術(shù)有限公司提供。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），實(shí)驗(yàn)室自制。馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL），購于Sigma公司。堿性蛋白酶，酶活2.280×105U/g，購于諾維信生物技術(shù)有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 WFJ 7200型可見分光光度計，北京普析儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LD5-2A離心機(jī)，北京醫(yī)用廠；Agilent 1100液相色譜，美國安捷倫公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 大米蛋白酶解液的制備 稱取12 g大米蛋白放入燒杯中，加入400 mL蒸餾水，待溫度升高到50℃時，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，穩(wěn)定10 min后，加入0.9 mL堿性蛋白酶開始酶解，在酶解過程中滴加NaOH維持pH穩(wěn)定。分別在酶解30、45、60、75、90 min時取樣，沸水浴滅酶10 min，冷卻后于5000 r/min離心15 min，收集上清液待測。

2.2 大米蛋白水解度的測定 水解度的測定采用pH-Stat法Adler-Nissen（1989），計算公式如下：

式中：B為消耗氫氧化鈉的體積，mL；Nb為氫氧化鈉的濃度，mol/L；α在本試驗(yàn)條件下為0.9617；htot為每克蛋白質(zhì)的肽鍵，mmol/g，大米蛋白為8.40。

2.3 ACE抑制活性的測定 ACE抑制率的測定采用高效液相色譜法檢測（Jia等，2010）。計算公式為：

式中：Sb為空白試劑馬尿酸的峰面積，Si是待測樣品馬尿酸的峰面積。

2.4 酶解產(chǎn)物中總蛋白和TCA酸溶蛋白的測定總蛋白的測定采用福林酚法測定。測定TCA酸溶蛋白的樣品處理方法如下：20 mL酶解液加入10 mL 15%三氯乙酸，于25℃水浴條件下沉淀大分子蛋白30 min后，5000 r/min離心15 min，收集上清液測定酸溶蛋白含量。

2.5 酶解液中多肽的分子質(zhì)量分布 酶解液中多肽的分子質(zhì)量分布采用高效液相排阻色譜法，色譜柱：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量30 μL，柱溫30℃。校準(zhǔn)曲線根據(jù)平均洗脫體積和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子質(zhì)量繪制。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別為：牛血清白蛋白（66430 Da），細(xì)胞色素C（12500 Da），桿菌肽（1450 Da），色氨酸（204.23 Da）。

2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件對顯著性進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果均以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。所有圖表均由OriginPro8軟件繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解產(chǎn)物ACE抑制活性 多肽具有多種生物學(xué)活性，尤其是ACE抑制活性（Bernardini等，2012）。不同酶解時間酶解產(chǎn)物的ACE抑制率結(jié)果見圖1，酶解30、45、60、75、90 min的ACE抑制率分別為 （60.34±0.42）%，（65.85±1.21）%，（71.58±1.10）%，（73.27±0.36）%和 （69.67± 0.41）%。后三者的ACE抑制活性沒有顯著差異（P＞0.05）。這與綿羊干酪乳清蛋白的結(jié)果不同（Correa等，2014）。其原因可能是，不同的原料其氨基酸組成不同，不同的酶解時間產(chǎn)生多肽的種類也不相同，酶解75 min的ACE抑制活性有降低的趨勢，原因可能是因?yàn)槊附鈺r間過長，導(dǎo)致多肽過度酶解，形成大量氨基酸所致。

圖1 大米蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率

3.2 大米蛋白的水解度 不同時間大米蛋白的水解度結(jié)果見圖2，在酶解的前15 min，酶解曲線幾乎呈現(xiàn)線性增長，大米蛋白的水解度在酶解30～90 min內(nèi)，從17.71%增加到23.23%，在酶解60 min以后趨于平緩。此結(jié)果與酶解產(chǎn)物ACE抑制率的結(jié)果相符。

圖2 大米蛋白水解度

3.3 酶解產(chǎn)物中總蛋白含量和TCA酸溶蛋白含量 酶解產(chǎn)物中總蛋白和TCA酸溶蛋白含量結(jié)果見圖3，酶解可以提高蛋白質(zhì)含量和酸溶蛋白含量。TCA酸溶蛋白占總蛋白的比例分別為56.80%、57.95%、70.19%、82.00%和83.28%，由試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著酶解時間的增加，大分子蛋白含量逐漸降低。

圖3 酶解產(chǎn)物中總蛋白和TCA酸溶蛋白含量

水解產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)含量，是評價其生物活性的一個重要指標(biāo)。TCA是一種蛋白質(zhì)凝結(jié)劑，可以通過暴露蛋白的疏水性基團(tuán)而沉淀大分子蛋白，但小分子的多肽則不會析出 （Jang等，2016；Sokolowski等，2003）。隨著酶解過程的進(jìn)行，大分子蛋白之間的肽鍵逐漸斷裂。

3.4 酶解產(chǎn)物中多肽的分子質(zhì)量分布 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和酶解液多肽的分子質(zhì)量色譜分別如圖4（1）和（2）所示，酶解產(chǎn)物的多肽分子質(zhì)量分布的結(jié)果見表1。酶解30 min的酶解產(chǎn)物中，多肽分子質(zhì)量大于1000 Da的比例最高（30.13%），并且與其他時間的酶解產(chǎn)物的多肽相比具有顯著差異（P＜0.05）。酶解60 min的酶解產(chǎn)物中，多肽分子質(zhì)量介于200～1000 Da的比例最高，且與酶解75 min和90 min的多肽分子質(zhì)量分布沒有顯著差異（P＜0.05）。同時，酶解30 min的多肽小于200 Da的比例最低（27.35%），隨后呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。隨著水解的進(jìn)行，小分子肽或氨基酸的含量增加。

圖4 大米蛋白酶解產(chǎn)物多肽分子質(zhì)量分布

表1 酶解產(chǎn)物中多肽的分子質(zhì)量分布

大多數(shù)氨基酸的分子質(zhì)量小于200 Da，而多數(shù)的生物活性肽的分子質(zhì)量為200～1000 Da（Jin等，2016b）。分子質(zhì)量分布的結(jié)果與ACE抑制活性的結(jié)果相一致，說明ACE抑制率的大小可能與200～1000 Da多肽分子質(zhì)量的分布有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：（1）不同酶解時間產(chǎn)物ACE抑制活性不同，隨著酶解的進(jìn)行，ACE抑制率先升高，然后趨于穩(wěn)定；（2）大米蛋白水解度在前15 min呈現(xiàn)線性增加，60 min后逐漸平緩，與ACE抑制率的變化趨勢相同；（3）總蛋白質(zhì)和TCA酸溶蛋白含量隨時間增加均顯著增加，并且TCA酸溶蛋白占總蛋白的含量不斷升高，相對應(yīng)時間的ACE抑制率也顯著提高；（4）隨著酶解的進(jìn)行，酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量分布在200～1000 Da多肽含量不斷升高，然后趨于平穩(wěn)，此結(jié)果與ACE抑制活性一致，說明ACE抑制活性與200～1000 Da多肽的分布呈正相關(guān)。

綜上所述，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性與蛋白質(zhì)水解度、總蛋白質(zhì)和酸溶蛋白質(zhì)含量、多肽分子質(zhì)量分布均有一定的相關(guān)性。

The angiotensin-I-converting enzyme（ACE）inhibitory activity of hydrolysates from rice protein hydrolyzated by alcalase at different time was studied.And the degree of hydrolysis（DH），protein content，the relationship between molecular weight distribution of hydrolysates and ACE inhibitory activity were also discussed.The results showed that the DH of rice protein presented linear growth within 15 min and flatten gradually after 60 min.ACE inhibitory rate of hydrolysates for 75 min was the highest（63.27%）and had no significant difference compared to that of 60 min and 90 min （P>0.05）.TCA-soluble protein and total protein content showed an upward trend during enzymatic process.Molecular weight distribution presented the highest proportion between 200 and 1000 Da.

rice protein；ACE inhibitory peptide；protein content；molecular weight distribution

S816.11

A

1004-3314（2017）03-0023-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170307

基金課題：國家863計劃“高生物利用度蛋白制備關(guān)鍵技術(shù)研究與開發(fā)”（2013AA102203）；江蘇大學(xué)高級人才科研啟動基金（16JDG049）

*通訊作者