溶菌酶的分離方法及進(jìn)展

(泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

?

溶菌酶的分離方法及進(jìn)展

宋娟

(泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

溶菌酶是一種生物酶，可選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁。作為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，溶菌酶在醫(yī)藥、食品行業(yè)、飼料工業(yè)得以廣泛的應(yīng)用。本文綜述了溶菌酶生產(chǎn)工藝中各種分離方法及其進(jìn)展，對(duì)未來(lái)溶菌酶的分離純化進(jìn)行了展望。

溶菌酶 ； 分離 ； 純化

Keywords:lysozyme ； separation ； purification

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，廣泛存在于人和高等動(dòng)物的組織、分泌物及體液中，鳥類和家禽的蛋清以及微生物中也含此酶，其中以新鮮雞蛋清中含量最為豐富[1]。溶菌酶本身無(wú)毒，它可以在不破壞其他組織的前提下，選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁。這一特性使其成為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，在醫(yī)藥、食品行業(yè)、飼料工業(yè)得以廣泛的應(yīng)用[2-7]。此外，溶菌酶還可以被用作基因工程和細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶，應(yīng)用價(jià)值極高[8]。近年來(lái)，隨著生物分離技術(shù)的不斷推陳出新，溶菌酶分離純化的方法也愈來(lái)愈多，從傳統(tǒng)的結(jié)晶法到離子交換法和色譜法，再到后來(lái)的新技術(shù)如膜分離技術(shù)、超濾法和親和—膜過(guò)濾技術(shù)等[9]。本文就近年來(lái)常用的一些分離純化方法進(jìn)行綜述。

1 分離純化方法

1.1結(jié)晶法

結(jié)晶法是制備溶菌酶晶體最傳統(tǒng)的一種方法，1937年MayerAbraham等獲得結(jié)晶溶菌酶之后，Alderton等[10]在1945年提出了直接結(jié)晶法。該法根據(jù)溶菌酶耐熱、耐酸，在鹽溶液中易溶且穩(wěn)定性好的特性，加入中性鹽使其溶解。然后利用溶菌酶和其他物質(zhì)等電點(diǎn)的差異，調(diào)節(jié)溶液的pH值使其析出。結(jié)晶法操作簡(jiǎn)單但生產(chǎn)周期長(zhǎng)，雖然經(jīng)過(guò)重結(jié)晶可得到高純度的溶菌酶，不過(guò)原料損耗相對(duì)較大，產(chǎn)率一般為60%～80%。楊景芝等[11]對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)，在加入中性鹽之前用724樹脂進(jìn)行吸附，隨后將洗脫液進(jìn)行鹽析，透析后調(diào)整透析液pH值，二次調(diào)整其pH值，加入磷酸緩沖溶液，最后離心去除雜質(zhì)得到純化液。經(jīng)過(guò)改進(jìn)，從雞蛋清中提取溶菌酶的產(chǎn)率提高，并且活性增加。因?yàn)榻Y(jié)晶法要求溶菌酶的含量相對(duì)較高，對(duì)于微量的溶菌酶分離效果較差，所以目前除了蛋清，其他來(lái)源的溶菌酶分離純化一般不采用結(jié)晶法。

1.2離子交換法

離子交換法一直是分離純化溶菌酶常用的方法，是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異來(lái)分離純化物質(zhì)的一種方法。因?yàn)槿芫笧閴A性蛋白質(zhì)，最適宜酸度pH值為6.5，故可利用弱酸型陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)其進(jìn)行分離，然后再用氯化鈉或硫酸銨溶液洗脫，達(dá)到分離的目的。該法簡(jiǎn)便、高效、成本低，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化連續(xù)操作。常用的離子交換劑有Duolite-464、羧酸纖維素(PC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基瓊脂糖等[12]。李蓉等[13]選擇硅膠基質(zhì)交換柱，建立了比傳統(tǒng)的軟基質(zhì)離子交換分離速度快、純化效率高的新方法。將蛋清樣品勻漿后，用NaCl初步純化，然后用硅膠基質(zhì)弱陽(yáng)離子交換柱XIDACE-WCX分離，溶菌酶純化倍數(shù)提高了5.6倍。溶菌酶活性回收率為107%，蛋白的比活為15 467 U/mg。余海芬等[14]探索出一種高收率、高活性的雞蛋清溶菌酶提取技術(shù)，選用D152陽(yáng)離子交換樹脂，確定了最佳提取條件，得率為2.95 mg/mL，比活為9 500 U/mg左右，純度為96.3%。趙林等[15]將蛋清稀釋后先利用等電點(diǎn)沉淀去除部分雜質(zhì)，然后利用快流速羧甲基—瓊脂糖凝膠柱層析進(jìn)行純化。得到的溶菌酶純度達(dá)到95%以上，比活達(dá)到17 600 U/mg，收率達(dá)到4.2 mg/mL，比余海芬等收率高約42.4%，比活也提高很多，高效快速地完成了蛋清溶菌酶的純化。離子交換法提取分離蛋清中溶菌酶，設(shè)備簡(jiǎn)單成本低，操作方便周期短，且所得溶菌酶活力和收率較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1.3色譜法

色譜法以親和力為基礎(chǔ)，制備具有特異親和性的分離介質(zhì)，選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，再依據(jù)待分離物質(zhì)的特性選擇適合的溶液洗脫而達(dá)到分離的目的，其中以20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的親和色譜技術(shù)應(yīng)用最廣。親和色譜又稱為親和層析法，是根據(jù)酶與作用底物的特異性親和能力，利用酶分子獨(dú)有的專一性結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分離方法，它的選擇性好、高效快速，能夠滿足蛋清溶菌酶高效分離與純化的需要。HeL Z等[16]采用多步親和層析法分離純化溶菌酶，結(jié)果表明，利用三步親和層析系統(tǒng)對(duì)溶菌酶進(jìn)行純化，可以將產(chǎn)率從一步法的61%提高到96%。王建山等[17]利用一種新型的強(qiáng)陽(yáng)離子交換/疏水色譜(SCX/HIC)雙功能色譜柱構(gòu)建了在線單柱二維液相色譜(2DLC-1C)，利用在線2DLC-1C技術(shù)在70 min內(nèi)完成了對(duì)雞蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白三種活性蛋白的快速分離純化，其純度分別為95%、93%和97%。該分離系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)控制，操作簡(jiǎn)單，易于放大，純化速度快，有望廣泛應(yīng)用于活性蛋白的快速分離制備和工業(yè)化生產(chǎn)。

1.4膜分離技術(shù)

膜處理技術(shù)是指在一定的驅(qū)動(dòng)力下，使溶液通過(guò)一定孔徑的膜，達(dá)到濃縮溶質(zhì)或凈化溶劑的效果，通稱為膜分離技術(shù)。工業(yè)化的膜分離過(guò)程主要有：微濾、超濾、反滲透、滲析、電滲析、氣體分離和滲透汽化。近來(lái)，研發(fā)人員以傳統(tǒng)的膜處理為基礎(chǔ)，將親和配基結(jié)合在分離膜上，利用親和配基與目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合，雜質(zhì)則大部分透過(guò)膜孔流出，通過(guò)洗滌除去膜上殘留的雜質(zhì)，然后將目標(biāo)分子從膜上洗脫下來(lái)。它具有耗時(shí)短、反應(yīng)溫和、純化效率高等特點(diǎn)，可作為分離、純化DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的新型技術(shù)手段，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用。李靜等[18]用金屬螯合物作為配基的親和膜分離純化溶菌酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，親和膜對(duì)溶菌酶的選擇吸附性能良好，可以用親和膜直接從蛋清(殼)中分離提純?nèi)芫?，純度達(dá)17 500 U/mg。Bayramoglu G等[19]采用一種新型親和染料—配基復(fù)合膜對(duì)溶菌酶的吸附及動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。他們還將活性綠19固定在甲基丙烯酸羥乙酯殼聚糖復(fù)合膜上，使得溶菌酶在上面的吸附量相比于普通復(fù)合膜的提高了9倍[20]。

1.5超濾法

超濾是一種新興的分離純化物質(zhì)的技術(shù)，它以壓力為動(dòng)力，利用超濾膜不同孔徑對(duì)液體進(jìn)行分離的物理篩分過(guò)程，具有產(chǎn)品得率高、雜質(zhì)少、純度高等優(yōu)點(diǎn)，一般應(yīng)用在反滲析和濃縮等方面，近來(lái)也在蛋白質(zhì)的分離純化中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。在無(wú)菌條件下操作，可以直接生產(chǎn)無(wú)菌的溶菌酶溶液，直接用于臨床治療[21]。如果在原料液中加入親和載體，再與傳統(tǒng)超濾技術(shù)相結(jié)合，而實(shí)現(xiàn)特異性分離目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)叫作親和—膜過(guò)濾技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)由Medda于1981年首次提出，它是首先利用相對(duì)分子質(zhì)量較高的水溶性分子化合物為載體基質(zhì)，在基質(zhì)上耦連一定量能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分子的親和配基以獲得親和載體[22]。再利用親和載體親和吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成大分子復(fù)合物，通過(guò)超濾膜進(jìn)行超濾分離。此時(shí)超濾膜可以完全截留大分子復(fù)合物，而雜質(zhì)分子則透過(guò)濾膜，接著用洗脫液解吸大分子復(fù)合物，使親和載體和目標(biāo)分子分離后再次通過(guò)超濾膜。這次大分子親和載體將被截留，而目標(biāo)蛋白質(zhì)分子則通過(guò)濾膜得以純化[23]。陳萍等[24]以200 kDa的水溶性葡聚糖為基質(zhì)，Cu2+做親和配基的大分子水溶性葡聚糖親和—超濾載體對(duì)溶菌酶的吸附分離特性。結(jié)果表明親和—超濾載體與溶菌酶的吸附能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸附平衡，擬合最大理論吸附量為13.65 mg/g，親和—超濾載體有良好的重復(fù)使用特性，且平均洗脫率約達(dá)92%。

2 展望

溶菌酶由于其廣泛用途，成為生化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而溶菌酶的分離與純化方法更是研究的重點(diǎn)。目前因?yàn)殡u蛋清中溶菌酶的含量較高，國(guó)內(nèi)外主要從雞蛋清中提取溶菌酶，但是，即使在雞蛋清中的溶菌酶含量較高，也相當(dāng)有限。為了滿足人們對(duì)溶菌酶越來(lái)越大的需求，探討高效的溶菌酶分離技術(shù)，提高溶菌酶生產(chǎn)質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，適應(yīng)各種應(yīng)用的需求，勢(shì)在必行。單一分離純化方法往往存在純度不高、回收率低和自動(dòng)化難以實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題，因此需要建立多階段復(fù)合的分離純化體系，再結(jié)合基因工程及蛋白質(zhì)工程，建立重組溶菌酶的微生物表達(dá)系統(tǒng)，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)出高活性溶菌酶的高產(chǎn)表達(dá)菌株，來(lái)提高溶菌酶產(chǎn)量和效率滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

[1] 方元超,梅叢笑,尹 寧.溶菌酶及其應(yīng)用前景[J].中國(guó)食品添加劑,1999,4:39-42.

[2] 林尚澤.口咽部惡性腫瘤患者在化—放療過(guò)程中溶菌酶的應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè),1982,5:290-291.

[3] 潘 洛,楊光偉,周懷理.溶菌酶含片預(yù)防放射性口咽反應(yīng)的臨床療效觀察[J].腫瘤藥學(xué),2014,4(4):294-297.

[4] 崔 紅.天然微生物防腐劑溶菌酶在食品中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2015, 21(12):28-31.

[5] 馮棋琴,周立梅,高文功,等.溶菌酶在食品工業(yè)中的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2015，36(5):134-136.

[6] 張瑞姿,趙雪敏,郭 曦,等.溶菌酶及其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[J].獸藥與飼料添加劑,2009,14(5):16-18.

[7] 邢思華,華雪銘,朱站英,等.漁用溶菌酶制品的穩(wěn)定性研究[J].飼料工業(yè),2014,22:20-23.

[8] Paola A,Joseph H.H.Immobilization of lysozyme on food contact polymers as potential antimicrobial films[M].Packaging Technology and Science,1997,10:271-279.

[9] 林 立.溶菌酶分離方法綜述及進(jìn)展[J].廣州化工,2012,40(7):53-56.

[10] Alderton G,Ward W,Fevold H.Isolation fo lysozyme from egg white[J].Journal of Biological Chemistry,1945,157:43-58.

[11] 楊景芝,孫衍華,白吉?jiǎng)?等.雞蛋清溶菌酶提取工藝的改進(jìn)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(5):85-87.

[12] Lichan E,Nakai S,Sim J,et al.Lysozyme sepraration from eggwhite by cation exchang column chromatography[J].Journal of foodscience,1986,51(4):1032-1036.

[13] 李 蓉,陳國(guó)亮.高效陽(yáng)離子交換色譜法分離純化蛋清中的溶菌酶[J].色譜,2002,20(3):259-261.

[14] 余海芬,馬美湖,劉 巖.陽(yáng)離子交換法提取蛋清溶菌酶的研究[J].中國(guó)家禽,2008,30(24):22-25.

[15] 趙 林,蔡金艷,周 林等.一步陽(yáng)離子柱層析高效純化溶菌酶及其溶菌活性[J].中國(guó)藥房,2013,24(1):30-32.

[16] HeL Z,Sun Y.Purification of lysozyme by multistage affinity filtration[J].Bioprocess Biosyst Eng,2002,25:155-158.

[17] 王建山,夏紅軍,萬(wàn)廣平,等.在線單柱二維液相色譜法對(duì)蛋清中三種活性蛋白的快速分離純化[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2016,74:265-270.

[18] 李 靜,陳歡林,柴 紅.金屬螯合親和膜吸附分離與純化溶菌酶的研究[J].膜科學(xué)與技術(shù),2001,21(4):5-9.

[19] Bayramoglu G,Yglmaz M,Arica M Y.Affinity dye-ligand poly(hydroxyethyl ethacrylate) /chitosan composite membrane for adsorptionlysozyme and kinetic properties[J].Biochemical Engineering Journal,2003,13(1):35-42.

[20] Yilmaz M,Bayramoglu G,Arica MY.Separation and purification of lysozyme by Reactive Green 19 immobilised membrane affinity chromatography[J].Food Chemistry,2005,89(1):11-18.

[21] 陳慧英,吳曉英,林 影.溶菌酶分離純化方法的研究新進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2003,19(4):355-258.

[22] Adamsi M D,Nguyen Q T,Dellacherie E.[J].Membrane Science,1981,9(3):337-342.

[23] 李存芝,李 琳,胡松青,等.親和—膜過(guò)濾技術(shù)及其應(yīng)用[J].現(xiàn)代化工,2004,1(24):64-66.

[24] 陳 萍,趙 瑋,李 琳,等.水溶性葡聚糖親和—超濾載體對(duì)溶菌酶吸附分離特性的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(8):84-86.

SeparationMethodsandProgressofLysozyme

SONGJuan

(Taizhou University，Taizhou 225300 , China)

Lysozyme is a kind of biological enzyme,which can selectively decompose cell wall of microorganisms.As a kind of natural and safe baltericide and antiseptic,lysozyme is widely used in medicine,food industry and feed industry.In this paper,the separation methods and progress of lysozyme production are reviewed.The separation and purification of lysozyme in the future is prospected.

2017-04-10

宋 娟(1977-)，女，副教授，從事應(yīng)用化學(xué)方面的工作，電話：13912193222。

TQ426.9

：A

：1003-3467(2017)07-0016-03