重樓皂苷抑制卵巢癌細胞增殖和轉移、誘導其凋亡分子機制研究

劉宗諭，李 丹，王碧航，范麗梅*

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

重樓皂苷抑制卵巢癌細胞增殖和轉移、誘導其凋亡分子機制研究

劉宗諭1，李 丹2，王碧航2，范麗梅2*

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

卵巢癌近年來在婦科門診和病房中發(fā)病率逐漸增多，屬于女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，病死率極高，嚴重危害了患者身體健康和生存質量。目前國內對卵巢惡性腫瘤的治療主要還是以化療、手術切除為主，研究顯示，化療的藥物治療效果和所用劑量呈正比[1]。但是，長期化療，劑量在體內不斷累積會導致較嚴重的不良反應，嚴重的患者可出現(xiàn)過敏性休克、心血管系統(tǒng)和骨髓造血系統(tǒng)均受到嚴重影響，一般不良反應即脫發(fā)、骨骼肌肉酸痛以及胃腸道反應等[2]。因此，臨床許多專家學者對于卵巢癌治療手段已經(jīng)從傳統(tǒng)方法逐漸研究、實驗、開拓到使用天然物質中提取無副作用或者不良反應很輕微的有效成分來對抗惡性腫瘤，本文主要探討從天然中藥材中提取的物質作用于卵巢癌細胞的機制，分析其對抗惡性腫瘤的臨床效果，總結其濃度與癌細胞作用時間的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次實驗所用的實驗材料有人乳頭狀漿液性卵巢癌細胞，來自于我省腫瘤醫(yī)院研究所提供[3]；實驗藥品有重樓皂苷Ⅰ粉劑(中國藥品生物制品檢定所生產，批號111590-200402)。用DMSO(二甲基亞砜)助溶，配成高濃度原液(100 μg/μL)，-20～20℃保存。工作液濃度按實驗需要臨用前用RPMI1640培養(yǎng)液配制，其中DMSO終濃度小于0.5%；實驗試劑HyClon RPMI1640培養(yǎng)基；HyClon胎牛血清；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學研究所生產；Cycle Test PlusrTM DNA Reagent Kit (Becton Dickinson公司)；FITC Annexin V Apoptosis Detection kit(BD Pharmingen公司)；Hoechst33258染色試劑(碧云天生物技術有限公司)；實驗設備與儀器是奧林帕斯倒置顯微鏡(日本Olympus IMT-2-21)；全自動細胞計數(shù)儀(美國Bioscience Nexcelom公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；流式細胞儀(BD FRCS Calihur)；熒光顯微鏡(尼康Ti一E倒置顯微鏡)[4]。

1.2 方法

將重樓皂苷按照不同濃度分為4組，每組濃度間隔為1 μg/ml，接種到平板中，細胞需在常溫下保存，在CO2分壓為5%的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，根據(jù)細胞增殖抑制率公式計算細胞增殖抑制率；細胞周期在重樓皂苷影響的實驗方法也是建立4個不同的濃度梯度，間隔同上，記錄24 h、48 h、72 h三個時間點的數(shù)值，將30萬細胞為單位接種到1640培養(yǎng)液中，在CO2分壓為5%的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，24 h后將細胞收集并且逐漸加入70%的酒精來將細胞進行固定，固定好后置入冰箱備用，冰箱溫度為4℃，待第二天取出固定好的細胞100 μl，離心5 min，去除上清液和酒精；濃度梯度分組同上，采用PI染色法染色，在光鏡下檢測凋亡細胞，接種培養(yǎng)基的細胞單位為50萬，同樣條件下培養(yǎng)細胞，收集3 h和6 h的細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0對所得資料進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用單因素方差分析，各組比較P<0.05表示有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

各時間點細胞增殖抑制曲線所得重樓皂苷I的半數(shù)抑制濃度(IC50)：24 h、48 h、72 h、分別為3.38 μg/mL、1.29 μg/mL、1.17 μg/mL，集中在1-3.5 μg/mL之間；當重樓皂苷作用于卵巢癌細胞不同時相的結果間比較，有統(tǒng)計學差異，詳見表1、表2、表3。

重樓皂苷Ⅰ作用癌細胞3 h便可以誘導其進行早期凋亡，6 h后可顯著誘導，凋亡率分別為30.67%和38.72%，兩組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，高濃度組即3 μg/ml組的凋亡率則有所下降。

表1 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對卵巢癌細胞24 h 周期性影響分析

注：與對照組比較P<0.05

表2 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對卵巢癌細胞48 h 周期性影響分析

注：與對照組比較P<0.05

表3 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對卵巢癌細胞72 h 周期性影響分析

注：與對照組比較P<0.05

3 討論

重樓屬于百合科或七葉一枝花根莖，中醫(yī)認為其藥效具有清熱解毒[5]、消腫止痛、涼肝定驚的功效，西醫(yī)范疇解釋其具有免疫調節(jié)、止血抗腫瘤等藥效作用。甾體皂苷是重樓的主要化學成分，所占比例為80%[6]，是抗癌細胞的有效成分，近年來已經(jīng)有許多學者經(jīng)過實驗證實了重樓皂苷及其提取物有對抗惡性腫瘤的作用[7]。國外學者報道了關于15種中藥的乙醇提取物和水的提取物對癌細胞的抗腫瘤包括了肝癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞以及食管腺癌細胞[8]，胃癌細胞體外的抑制作用較為明顯，通過小鼠模型的實驗證明了無論體外還是體內，重樓皂苷均有很強的抗肺癌作用。

本研究是提取了重樓皂苷Ⅰ，分析其對卵巢癌細胞的抗癌作用效果，按照不同濃度梯度進行實驗分組，結果顯示出重樓皂苷提取物對卵巢癌細胞的抑制作用較為明顯，而當提取物劑量較低時，抑制的效果較差，在濃度劑量為1 μg/ml的時候，抑制率顯著增加，并隨濃度升高而升高，二者存在顯著的劑量-效應關系，這與以往報道相一致[9]。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物多為周期特異性，機理主要是干擾細胞的有絲分裂和增殖，達到抑制腫瘤生長的目的，文獻報道表示[10]，重樓提取液對人的結腸癌細胞增殖作用24 h以后，S期的分布比例上升，而G0/G1期比例下降、G2/M期的細胞分布增加，這一現(xiàn)象說明了重樓提取液可能是抑制了癌細胞的蛋白質和DNA的合成達到抑制生長和增殖的目的[11]，當作用了48 h以后，G0/G1期細胞比例開始顯著減少，S期和G2/M期的細胞分布是增加狀態(tài)，這一結果說明了期干擾DNA合成是在前期。誘導細胞凋亡也是抗腫瘤的機制之一，國外學者研究發(fā)現(xiàn)[12]，重樓皂苷Ⅰ作用于卵巢癌的裸鼠模型時，主要以線粒體途徑來完成誘導細胞凋亡，從而達到抑制癌性生長的目的，本次試驗結果和裸鼠實驗結果相一致[13]，但是本次結果發(fā)現(xiàn)濃度較高時，細胞的凋亡率并不高，這可能與細胞直接殺傷有關[15]。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ對卵巢癌細胞的生長有顯著的抑制作用，各濃度梯度效果不同，可以通過誘導細胞凋亡對抗癌細胞的生長，為臨床治療提供科學的理論依據(jù)。

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吉林省產業(yè)技術與開發(fā)項目(2013C026-4)

1007-4287(2017)02-0317-03

2016-09-28)

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