小黃魚內(nèi)臟蛋白的提取及應(yīng)用研究

吳凱強(qiáng)，姜維，郭健，應(yīng)知偉，宋文東，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江海洋學(xué)院創(chuàng)新應(yīng)用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山316022）

小黃魚內(nèi)臟蛋白的提取及應(yīng)用研究

吳凱強(qiáng)1，姜維2，郭健1，應(yīng)知偉3，宋文東2，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江海洋學(xué)院創(chuàng)新應(yīng)用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山316022）

本文以小黃魚內(nèi)臟為研究對(duì)象，從中分離提取出活性蛋白。通過(guò)對(duì)緩沖液pH，提取時(shí)間，醇液比3個(gè)單因素的考察，確定因素水平，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明最佳提取工藝為：提取時(shí)間5h，緩沖液pH9，醇液比0.8∶1（體積比），在此工藝下所提取的蛋白液濃度為3.409mg/mL。最后，用所提取的活性蛋白進(jìn)行初步應(yīng)用性試驗(yàn)，通過(guò)美拉德反應(yīng)，制備食品添加劑，為小黃魚下腳料的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

小黃魚；廢棄內(nèi)臟；活性蛋白

小黃魚[1-2]，拉丁名Pseudosciaena polyactis，又名小鮮、黃花魚、花色、黃鱗魚、小春色等，是輻鰭魚綱，鱸形目，石首魚科，黃魚屬。它是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，與大黃魚、帶魚并稱“中國(guó)三大海產(chǎn)”。小黃魚中蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)元素含量豐富[3-4]。因此在日常生活中深受人們的喜愛，而在我國(guó)南方因大量生產(chǎn)小黃魚干制品而產(chǎn)生大量的魚類下腳料[5]，對(duì)其有效地利用成為企業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵[6-7]。

隨著我國(guó)水產(chǎn)品加工行業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品廢棄物的利用越來(lái)越受到重視[8-9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多領(lǐng)域的研究者投入到對(duì)此類資源的開發(fā)和利用的研究中去，這其中包含了食品專業(yè)、醫(yī)藥專業(yè)、環(huán)境保護(hù)專業(yè)等[10-12]。

目前，雖然有研究者對(duì)小黃魚的生物習(xí)性及分布進(jìn)行了研究[13-14]，但尚少有研究過(guò)小黃魚內(nèi)臟中活性蛋白的基本生物學(xué)性質(zhì)以及蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和遺傳學(xué)性質(zhì)等內(nèi)容，故本文以小黃魚作為研究對(duì)象，用正丁醇優(yōu)化粗提了小黃魚內(nèi)臟的活性蛋白并對(duì)其進(jìn)行一定的應(yīng)用型研究，從而解決小黃魚下腳料的閑置浪費(fèi)問(wèn)題，為開發(fā)一種天然的食品保鮮劑提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所需小黃魚：舟山臨城老碶菜場(chǎng)[魚身長(zhǎng)度（14±5）cm，魚體重量（30±10）g]；堿性蛋白酶（生化試劑，酶活力>30 000U/g）、木瓜蛋白酶（生化試劑，酶活力>50 000U/g）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；PHB-4雷磁便攜式pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1100分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；TM-767 II攪拌器、AR124CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；BCD-256KT海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；DGG-9030BD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CF16RN臺(tái)式微量高速離心機(jī)：Hitachi Koki Co.Ltd.（JAPAN）。

1.3 方法

1.3.1 主要工藝流程

原料→洗凈→勻漿→離心取上清液→正丁醇提取粗蛋白→硫酸銨分級(jí)沉淀→透析→粗蛋白定量→酶解→美拉德反應(yīng)

1.3.2 勻漿液的制備

用剪刀解剖小黃魚，取內(nèi)臟，用蒸餾水清洗后稱重。將魚內(nèi)臟和一定pH值的磷酸鹽緩沖液，按質(zhì)量體積比為1 g/3mL加入到高速勻漿機(jī)中勻漿；取出后4℃下靜置40min；冷凍離心取上清液，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白100mg，置于100mL的容量瓶中，用蒸餾水充分溶解，定容至刻度線，靜置，備用。得到濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

取9支試管，用移液槍分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，加水稀釋至10mL，渦流混勻，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)量吸光值。

1.3.4 單因素試驗(yàn)的考察

取適量小黃魚內(nèi)臟和pH分別為5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行勻漿。取出后靜置40min；離心取上清液。分別量取各個(gè)pH值下所得的勻漿上清液20mL，分別加入正丁醇12、16、20、24、28mL，攪拌均勻后，在4℃下分別靜置2、3、4、5、6 h后，冷凍離心，收集上清液。

離心所得的上清液用飽和度為20%～50%的硫酸銨分級(jí)沉淀法，提取上清液中的活性蛋白后，透析脫鹽24 h，即得小黃魚活性蛋白提取液。采用紫外分光法在波長(zhǎng)為280 nm處測(cè)量吸光值。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取緩沖液pH值為7、8、9，提取時(shí)間為3、4、5 h，醇液比為0.6∶1、0.8∶1、1∶1（體積比）。對(duì)緩沖液pH值、提取時(shí)間、醇液比3個(gè)因素進(jìn)行考察，通過(guò)L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以粗提液中的蛋白質(zhì)含量為考察標(biāo)準(zhǔn)，探討優(yōu)化小黃魚內(nèi)臟活性蛋白的工藝條件，正交水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factor levels orthogonal experiment

1.3.6 一種新型的食品添加劑的粗制備

1.3.6.1 酶解原料的制備

制備最佳工藝條件下的活性蛋白液100mL，在50℃下，pH為7時(shí)加入0.5 g的木瓜蛋白酶和0.5 g的堿性蛋白酶反應(yīng)5 h后，在90℃滅酶20min，冷卻后在8 000 r/min下離心20min，傾出酶解液，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.6.2 美拉德反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取50mL的稀釋若干倍木糖母液和50mL的蛋白酶解液，充分?jǐn)嚢韬?，?0%NaOH調(diào)節(jié)pH至8；將溶液倒入250mL的蒸餾燒瓶中，在100℃下分別蒸餾2 h；冷卻后，使用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量吸光值。美拉德反應(yīng)的程度由反應(yīng)后溶液的吸光度值作為依據(jù)，以未反應(yīng)的溶液作為參比溶液，測(cè)量美拉德反應(yīng)后溶液在波長(zhǎng)490nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定及繪制

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Bovine serum albumin

根據(jù)圖1得到牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)線性方程：y= 0.652 4x-0.005 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可進(jìn)行關(guān)于提取量的定量，計(jì)算公式如下：

式中：m表示提取量，mg；y表示透析液的蛋白濃度，mg/mL。

2.2 緩沖液的pH值對(duì)活性蛋白提取量的影響

不同緩沖液pH值對(duì)蛋白濃度的影響如圖2所示。

圖2 不同緩沖液pH值對(duì)蛋白濃度的影響Fig.2 The influence of different buffer pH value on the protein concentration

由圖2可知，當(dāng)緩沖液pH在5～9之間逐漸增加時(shí)，活性蛋白提取液的濃度是呈先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)pH為8時(shí)，所測(cè)的提取液濃度是最高的。由此可見，緩沖液pH值的酸性太強(qiáng)，或堿性太高都會(huì)導(dǎo)致活性蛋白的失活，影響活性蛋白的提取量，因此當(dāng)pH為8時(shí)，活性蛋白的提取量最高。

2.3 提取時(shí)間對(duì)活性蛋白提取量的影響

不同提取時(shí)間對(duì)蛋白濃度的影響如圖3所示。

由圖3可知，在提取時(shí)間為2 h～6 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的逐漸增加，活性蛋白提取液的濃度先增后減。在4 h時(shí)，活性蛋白提取液的濃度是最高的。低于4 h，由于蛋白漿液中的活性蛋白沒有被充分提取出來(lái)，而導(dǎo)致提取液濃度過(guò)低。而高于4 h，由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，活性蛋白中存在的一些蛋白酶可能會(huì)分解蛋白質(zhì)，而出現(xiàn)蛋白自溶的現(xiàn)象。另外，提取環(huán)境的不穩(wěn)定，也可能會(huì)導(dǎo)致在長(zhǎng)時(shí)間下，一些活性蛋白的失活，而影響活性蛋白提取液的濃度。因此，當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)，活性蛋白的提取量最高。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)蛋白濃度的影響Fig.3 The influence of different extraction time on the protein concentration

2.4 醇液比對(duì)活性蛋白提取量的影響

不同醇液比對(duì)蛋白濃度的影響如圖4所示。

圖4 不同醇液比對(duì)蛋白濃度的影響Fig.4 Different alcohol liquid ratio on the protein concentration

由圖4可知，在醇液比在0.6∶1～1.4∶1時(shí)，隨著醇液比的增加，活性蛋白提取液的濃度先增后減。在醇液比為0.8∶1（體積比）時(shí)，活性蛋白提取液的濃度達(dá)到最大。醇液比較少時(shí)，由于無(wú)法完全提取出蛋白漿液中的蛋白，會(huì)導(dǎo)致提取液的蛋白濃度過(guò)低。由于丙酮、正丁醇等此類的有機(jī)溶劑容易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活，所以整個(gè)試驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行。而過(guò)量的提取劑，就會(huì)導(dǎo)致蛋白漿液中有機(jī)溶劑分子過(guò)多，使部分蛋白質(zhì)出現(xiàn)變性失活現(xiàn)象。因此，當(dāng)醇液比為0.8∶1（體積比）時(shí)，活性蛋白的提取量最高。

2.5 正交試驗(yàn)考查結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，對(duì)美拉德反應(yīng)程度影響的主次關(guān)系為B>A>C，即提取時(shí)間>緩沖液pH>醇液比，根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳條件為A3B3C2，即pH為9，提取時(shí)間為5 h，醇液比為0.8∶1（體積比）。在此最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到蛋白濃度為3.409mg/mL，說(shuō)明此時(shí)蛋白濃度最高。由表3可知，緩沖液的pH，醇液比對(duì)結(jié)果影響顯著。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table3 The analysis of variance

2.6 美拉德反應(yīng)結(jié)果分析

根據(jù)木糖母液美拉德反應(yīng)結(jié)果可知，平均的吸光值達(dá)到0.749，說(shuō)明樣品中存在揮發(fā)性酯類成分，可進(jìn)行進(jìn)一步的分離提純?nèi)ヨb別分析，為木糖母液以及小黃魚下腳料綜合應(yīng)用去生成一種新型的食品添加劑提供了理論參考。

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種新的提取工藝，從小黃魚的內(nèi)臟中提取出活性蛋白。這是目前在小黃魚研究方面還沒有出現(xiàn)過(guò)新方法。整個(gè)蛋白提取試驗(yàn)雖然沒有采用色譜柱分離或凝膠過(guò)濾法等高新技術(shù)進(jìn)行分離，但試驗(yàn)內(nèi)容合理嚴(yán)謹(jǐn)，多次單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終優(yōu)化了內(nèi)臟活性蛋白的提取工藝，得到較高的提取量。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的提取工藝，最佳工藝條件是提取時(shí)間為5 h，緩沖液pH為9，醇液比為0.8∶1（體積比），通過(guò)正交試驗(yàn)驗(yàn)證得出由此可以看出，此提取工藝穩(wěn)定，效果好，應(yīng)用性強(qiáng)。另外，本論文中對(duì)所提取活性蛋白的應(yīng)用，也進(jìn)行了嘗試性試驗(yàn)。通過(guò)美拉德反應(yīng)，研究出了一種新型食品添加劑[15-17]。這也為進(jìn)一步開發(fā)利用該資源提供了有益的參考和科學(xué)參考。

如今，隨著人口的增長(zhǎng)，人們?cè)絹?lái)越依靠海洋資源。中國(guó)水產(chǎn)品的產(chǎn)量持續(xù)上升迎合了市場(chǎng)的需求，但這也帶來(lái)了大量水產(chǎn)廢棄物，如果能對(duì)這些水產(chǎn)廢棄物的開發(fā)利用進(jìn)一步研究，會(huì)有更大的前景和市場(chǎng)潛力可以被開發(fā)出來(lái)。目前，有許多國(guó)家都正在致力于開發(fā)研究各種水產(chǎn)品廢棄物的利用，前景十分地被看好。

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Study on Purification of Protease from Pseudosciaena polyactis Offal and Its Application

WU Kai-qiang1，JIANG Wei2，GUO Jian1，YING Zhi-wei3，SONG Wen-dong2，*
（1.College of Food and Medical，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；2.Innovative Application Research Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；3.College of Marine Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China）

The small yellow croaker visceral as the research object，designing the extraction process，separating and extracting the active protein from the small yellow croaker visceral.Determining the factor level through the investigation of three single factor，buffer pH，extraction time and alcohol liquid，to optimize the process and obtain the best extraction process by designing the orthogonal experimental L9（33）.The results showed that：5 h of extraction time，9 of buffer pH，0.8∶1（volume ratio）of alcohol liquid ratio made the best extraction，in this process the extracted an average of3.409 mg/mL.Finally，with the extraction of active protein applied experiments，through maillard reaction，the preparation of food additives，provides theoretical basis for the application of small yellow croaker scraps.

Pseudosciaena polyactis；fish offa；active protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.012

2015-12-31

舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C11009）；浙江海洋學(xué)院科研啟動(dòng)項(xiàng)目（21025011013）

吳凱強(qiáng)（1991—），男（漢），在讀碩士，研究方向：海洋資源高值化利用研究。

*通信作者:宋文東（1960—），男，教授，博士，研究方向：海洋資源高值化利用研究