玉米肽對雙歧桿菌免疫力作用的影響

張智，林秀芳，馬建章，*，鄭喜群

（1.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040；2.齊齊哈爾大學，黑龍江齊齊哈爾161006）

玉米肽對雙歧桿菌免疫力作用的影響

張智1，林秀芳1，馬建章1，*，鄭喜群2，*

（1.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040；2.齊齊哈爾大學，黑龍江齊齊哈爾161006）

檢測復合益生菌（長雙歧桿菌＋青春雙歧桿菌＋動物雙歧桿菌）與復合益生菌-玉米肽對小鼠免疫功能及抗氧化的影響。將小鼠隨機分為空白組、復合菌高、中、低3個劑量組和復合菌-玉米肽高、中、低3個劑量組。SPF級昆明系小鼠分別經(jīng)口每日連續(xù)灌胃30天后，對免疫器官、碳粒廓清指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應、脾淋巴細胞增殖實驗和體液酶聯(lián)免疫進行測定。碳粒廓清指數(shù)測定實驗中，復合菌和復合菌-玉米肽的高劑量組高于對照組。脾淋巴增殖實驗中，復合菌和復合菌-玉米肽制劑高劑量組刺激指數(shù)高于對照組，差異有顯著性意義，說明該樣品具有增強細胞免疫功能作用。遲發(fā)型變態(tài)反應，復合菌-玉米肽高劑量組明顯優(yōu)于其他組。體液酶聯(lián)免疫測定實驗方法中，復合菌和復合菌-玉米肽制劑高劑量組優(yōu)于對照組，說明該樣品具有促進免疫球蛋白A的功能。由此可見，攝入一定量的復合益生菌和復合益生菌-玉米肽，可增強小鼠的免疫能力，說明該樣品具有增強免疫力的功能作用?？寡趸芰Φ臏y定主要通過測定小鼠血清的SOD酶活性和MDA含量。結(jié)果表明，與對照組相比，復合菌和復合菌-玉米肽能夠提高SOD酶活性、降低血清中MDA含量，具有一定的抗氧化能力。

玉米肽；復合益生菌；免疫；抗氧化；影響

根據(jù)研究人體90%的疾病與免疫有關(guān)，故免疫系統(tǒng)在抵御外界環(huán)境有害物質(zhì)入侵方面起著至關(guān)重要的作用。免疫反應的調(diào)節(jié)在預防疾病方向起著至關(guān)重要的作用。越來越多的人們對這方面愈加重視。最近有研究表明，免疫調(diào)節(jié)劑可增強機體防御反應，此方式是一項有效增加對疾病抗性的方式[1]。已有研究表明乳酸桿菌（LAB）對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，具有一定的免疫功能。證明益生菌對免疫條件作用有一定的影響[2]。通過食用河蟹，能提高免疫力與抗病能力[3]。說明提高免疫的同時，也能提高抗病能力。

益生菌（Probiotic）又稱活菌制劑，是有益的的細菌或真菌。益生菌能夠促進宿主腸道內(nèi)微生物菌群的生態(tài)平衡，對宿主生理功能和健康產(chǎn)生都有一定的促進作用[4]。益生菌具有減緩乳糖消化不良[5]、治療腹瀉[6]、激活免疫系統(tǒng)、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]等多種保健功能。雙歧桿菌一直被公認為是安全的益生菌，對機體健康沒有致病性，具有食品安全性。長雙歧桿菌（Bifidobacrium Longum）是一種專性厭氧菌，已有研究表明長雙歧桿菌可以增強機體的免疫力[9]。青春雙歧桿菌（Bifidobacrium adolescent）是一種嚴格厭氧菌，已有研究證明其免疫功能。張炳華[10]等研究表明環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的恢復和增強作用。動物雙歧桿菌（Bifidobacrium animalis）被認為是一種嚴格專性厭氧菌。已有研究表明含動物雙歧桿菌的益生菌酸乳便秘癥狀有所改善[11]。

免疫佐劑（immunoadjuvant）是指能夠先于抗原或與抗原同時作用，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，能增強相應抗原的免疫原性或改變免疫反應類型[12]。已證明玉米肽也是一種較好的提高免疫力的物質(zhì)。羅軍[13]等研究玉米肽對輻射大鼠的作用，結(jié)果表明玉米肽能夠促進大鼠外周血象的影響，提高機體免疫力。單一益生菌由于其嚴格厭氧特性的制約，很難發(fā)揮其很好的免疫作用，因此希望通過加入其他物質(zhì)以提高其免疫活性，更好地應用于生產(chǎn)實際。目前此三種雙歧桿菌復合菌及復合菌-玉米肽的免疫活性與抗氧化能力少見報道。本試驗主要探究復合菌[長雙歧桿菌∶青春雙歧桿菌∶動物雙歧桿菌（質(zhì)量比）=1∶1∶1]及在此基礎(chǔ)上添加玉米肽的復合菌制劑（質(zhì)量比＝1∶1∶1∶1）的免疫功能及抗氧化能力，旨在更好地提高復合益生菌的免疫及抗氧化能力，為研制新型免疫佐劑提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

昆明系清潔級雄性小鼠，體重18 g～22 g，6周齡～ 8周齡。玉米肽：由齊齊哈爾大學食品與生物工程學院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1G超凈工作臺：江蘇凈通凈化設(shè)備有限公司；JA2003型電子天平：上海精科儀器有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：上海博訊實業(yè)有限公司；DHP-9272型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；DL-6M型立式離心機：湖南星科科學儀器有限公司；RT-6000全自動酶標儀：Rayto；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；免疫球蛋白IgA試劑盒、免疫球蛋白IgG試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒：購自南京建成生物制劑公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

取斜面保存的菌種，經(jīng)活化、MRS培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)得到長雙歧桿菌（Bifidobacrium Longum）BL-01、青春雙歧桿菌（Bifidobacrium adolescent）BA-10及動物雙歧桿菌（Bifidobacrium animalis）BA-30。然后將這三種菌種分別于改良培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，3500 r/min離心10min，除去上清，收集菌體沉淀。烘干，冷凍干燥得到菌粉。收集冷藏備用。將三者等比例混合得到復合益生菌。再按照一定比例混合玉米肽，得到復合益生菌增強劑。

1.3.2 小鼠喂養(yǎng)及分組

灌胃前適應環(huán)境一周。將小鼠隨機分為正常對照組、復合菌低劑量組、復合菌中劑量組、復合菌高劑量組、復合菌-玉米肽制劑低劑量組、復合菌-玉米肽制劑中劑量組和復合菌-玉米肽制劑高劑量組。正常對照組灌胃生理鹽水，每天灌胃0.2mL/10 g。飲用水為無菌水。飼料為普通飼料。自由采食。每天換水。隔天換墊料。連續(xù)灌胃30 d。記錄體重變化。

1.3.3 免疫器官

各組小鼠末次灌胃給藥，第2天稱重記錄。所有小鼠眼眥取血于無抗凝劑的離心管中，3 000 r/min離心10min，分離得到血清。小鼠脫臼處死，取其脾臟和胸腺，用生理鹽水進行清洗，去除表面的血跡，并用濾紙擦干表面。稱重記錄脾臟與胸腺的重量[14]。

脾臟（胸腺/肝臟）指數(shù)=脾臟（胸腺/肝臟）質(zhì)量/小鼠體重

1.3.4 碳粒廓清指數(shù)

參照其他試驗方法，略作改動[15]。小鼠稱重，用印度墨汁（10mL/kg，用前稀釋3倍～4倍）由尾靜脈注入體內(nèi)，觀察墨汁注入小鼠體內(nèi)成功后，立即計時。間隔時間分別為2min及10min時，分別以毛細管取眼眥靜脈叢取血20μL，注入盛有2mL 0.1%的Na2CO3溶液的比色皿中，測定OD600并記錄，以Na2CO3溶液作為空白對照。將小鼠脫臼處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重，計算吞噬指數(shù)α。

式中：OD1為2min時的吸光值；OD2為10min時的吸光值；t1為2min；t2為10min；k為廓清指數(shù)。

1.3.5 遲發(fā)型變態(tài)反應

參照方筍的試驗方法[16]，略作改動。預先將小鼠腹部脫毛，首次將1%二硝基氟苯（DNFB溶液）（以體積比=1∶1的丙酮麻油溶液配制）定量取50μL致敏小鼠。第五天再用DNFB涂右耳致敏，24 h后處死動物剪下小鼠的左右耳殼，用打孔器取直徑8mm的相同部分的耳片，分別稱重，用左右耳的重量之差來代表遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）的程度。

1.3.6 脾淋巴細胞增殖實驗

參照郭淼[17]的實驗方法，略作改動。將小鼠脫臼處死，75%乙醇中浸泡10min，無菌條件下取脾，制備成細胞懸液，經(jīng)篩網(wǎng)過濾，清洗兩次，1000 r/min離心10min，棄去上清液。加入RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，用臺酚藍染色計數(shù)（活力應大于95%）。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入96孔培養(yǎng)板中，一孔加5μL伴刀豆球蛋白A促細胞分裂劑，另一孔作為對照，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）進行細胞計數(shù)實驗，加入MTT（5mg/mL）10μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，離心，吸出上清液，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，于波長570 nm處測定吸光度，計算刺激指數(shù)SI。

式中：SI為刺激指數(shù)；a為ConA組在570 nm處的吸光值；b為對照組在570 nm處的吸光值。

1.3.7 體液免疫試驗

小鼠脫臼致死，取血清。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定樣品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白G的含量。

準備試劑、樣品和標準品，加入樣品和標準品，生物素標記二抗和酶標試劑，37℃保溫反應60min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10min，加入終止液，10min之內(nèi)讀完OD值（450 nm）。計算免疫球蛋白含量。

1.3.8 抗氧化活性測定

小鼠采用摘除眼球的方法取血，3 000 r/min離心10min。獲得血清。之后按照試劑盒的要求測定小鼠血清中SOD和MDA。丙二醛采用TBA法進行測定?？偝趸锲缁覆捎昧u胺法測定。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用excel2010、origin8.5處理數(shù)據(jù)和SPSS21.0中One-way ANOVA分析，各組數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，以P＜0.05為統(tǒng)計學意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 臟器指數(shù)

臟器指數(shù)的變化見表1。

表1 臟器指數(shù)的變化Table1 The varities of weights of spleen and thymus

實驗過程中，小鼠無死亡現(xiàn)象，活動正常，無異?，F(xiàn)象，脫臼處死后，脾臟、胸腺等器官無異常現(xiàn)象。脾臟指數(shù)中，與空白對照組相比，復合菌高、中劑量組顯著增加（P＜0.01）；復合菌-玉米肽高、中劑量組顯著增加（P＜0.01）。胸腺指數(shù)中，復合菌與復合菌-玉米肽均無顯著性差異（P＞0.05）。說明復合菌與復合菌-玉米肽對脾臟影響顯著，對胸腺影響差異不顯著。肝臟指數(shù)中，復合菌中劑量組與對照組存在顯著差異（P＜0.05）。復合菌高劑量組與低劑量組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。復合菌-玉米肽高劑量組與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。復合菌低劑量組無明顯差異變化。

2.2 碳粒廓清指數(shù)

碳粒廓清指數(shù)的變化見表2。

表2 碳粒廓清指數(shù)Table2 Carbon granule clearance assay

如表2所示，復合菌3個劑量都能夠顯著地提高，復合菌-玉米肽只有高劑量組能提高小鼠地碳粒廓清指數(shù)，低劑量組與中劑量無法提高該指數(shù)。與空白組相比，復合菌3個劑量組存在極顯著差異（P＜0.01），復合菌-玉米肽只有高劑量組存在顯著差異（P＜0.05），中劑量組和高劑量組無明顯差異（P＞0.05）。證明復合菌與復合菌-玉米肽都能提高碳粒廓清指數(shù)，具有對細胞免疫有一定的調(diào)節(jié)，且存在一定的劑量依賴。

2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應

遲發(fā)型變態(tài)反應的變化見表3。

表3 遲發(fā)型變態(tài)反應Table3 The varities of DHT

遲發(fā)型變態(tài)反應（DHT）屬于Ⅳ型變態(tài)反應，是由T細胞介導的炎癥免疫反應。當皮膚接觸到一些小分子半抗原物質(zhì)，半抗原可與皮膚蛋白結(jié)合形成完全抗原，激活對抗原敏感的T細胞，當機體再次接觸致敏原。如表3所示，復合菌與復合菌-玉米肽對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應有一定的影響。復合菌中劑量組與空白對照組存在顯著差異（P＜0.01）。復合菌高劑量組與低劑量組與對照組差異不顯著。復合菌-玉米肽高、中、低三個劑量組與空白組都存在顯著差異（P＜0.01）。在一定的劑量范圍內(nèi)，復合菌與復合菌-玉米肽能夠促進小鼠的細胞免疫，且玉米肽佐劑的加入能夠顯著提高DHT指標。

2.4 脾淋巴細胞增殖試驗

脾淋巴細胞增殖試驗的變化見表4。

表4 脾淋巴細胞增殖試驗Table4 Plaque forming assay

如表4所示，復合菌高劑量組與中劑量組能夠提高脾淋巴細胞刺激指數(shù)，與空白對照組相比，高劑量組存在極顯著差異（P＜0.01）。復合菌-玉米肽能夠顯著提高脾淋巴細胞刺激指數(shù)，與空白對照組相比，低劑量組存在不顯著差異（P＞0.05），中劑量組和高劑量組存在極顯著差異（P＜0.01）。證明復合菌與復合菌-玉米肽都能提高脾淋巴細胞刺激指數(shù)，且隨著劑量的增加，刺激指數(shù)增大，免疫活性增強。

2.5 體液酶聯(lián)免疫

體液酶聯(lián)免疫的變化見表5。

表5 分泌型免疫球蛋白Table5 The varities of IgA and IgG

分泌型球蛋白對腸道黏膜防御起著重要作用，是防御病原菌在腸道黏膜黏附的第一道防線，對機體的健康狀況起著重要的作用。如表5所示，與空白對照組相比，復合菌-玉米肽高、中、低劑量組存在顯著性差異（P＜0.01）；復合菌制劑高、中劑量組與空白對照組相比差異顯著（P＜0.01）。說明復合菌與復合菌-玉米肽能夠在一定程度上促進免疫球蛋白A。如表5所示，免疫球蛋白G整體呈增長趨勢。與空白對照組相比，復合菌高、中劑量組存在極顯著性差異（P＜0.01），復合菌低劑量組無顯著性差異。復合菌-玉米肽中劑量組與對照組相比存在顯著性差異（P＜0.01）。低劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。說明玉米肽的加入有助于提高免疫球蛋白G的含量，有助于提高機體抵御外界致病菌的侵入。

2.6 抗氧化指標

小鼠脫臼致死，取血清，按照試劑盒說明書方法進行實驗?？寡趸笜说淖兓姳?。

表6 抗氧化指標Table6 The varities of antioxidation

機體內(nèi)酶與非酶系統(tǒng)不斷產(chǎn)生能攻擊生物細胞膜中的多不飽和脂肪酸的氧自由基，從而引起脂質(zhì)的過氧化。脂質(zhì)的過氧化最終形成醛基、羥基、酮基等新的氧自由基。氧化產(chǎn)物過多會引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的聚合，從而具有一定的毒性，對人體造成傷害。丙二醛（MDA）含量的多少反應了機體的氧化損傷程度，是評價機體代謝的重要指標。SOD酶活性是作為評價藥物抗衰老的重要指標，是生物體體內(nèi)重要的生物酶之一。

如表6所示，復合菌與復合菌-玉米肽的MDA含量總體呈下降趨勢。與空白對照組相比，復合菌高、中低劑量組能夠降低血清中的MDA含量。復合菌-玉米肽高劑量和中劑量組能夠降低血清中MDA含量。與空白對照組相比，復合菌低劑量組存在差異顯著（P＜0.05）。復合菌-玉米肽制劑高劑量組能夠顯著降低小鼠血清中MDA含量，結(jié)果存在差異性顯著（P＜0.01）。復合菌中劑量組與對照組相比存在顯著差異（P＜0.05）。復合菌-玉米肽中劑量組與對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。說明玉米肽佐劑的加入能夠顯著提高SOD活性。

3 結(jié)論

益生菌具有多種生理功能，不僅能夠有效地調(diào)節(jié)機體的微生態(tài)平衡，而且能夠提高機體免疫力，提高抗病性，是一種有效的提高機體健康的物質(zhì)。雙歧桿菌更是被公認為安全無毒的益生菌。但是單一的雙歧桿菌的活性受限，為了更好的提高雙歧桿菌的活性，本試驗采用復合雙歧桿菌，以期能夠更好的提高生物效價，玉米肽的加入作為免疫增強劑，也能高效地促進雙歧桿菌的免疫活性的發(fā)揮。機體正常菌群在機體內(nèi)保持著動態(tài)平衡，這種動態(tài)平衡對機體的免疫作用的正常發(fā)揮以及生命活動都是起著至關(guān)重要的作用。機體免疫活性的正常發(fā)揮對機體的穩(wěn)定起著重要的作用。玉米肽氨基酸的組成中谷氨酰胺的含量很高，谷氨酰胺是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，同時也是合成核酸的氮源，與組織生長、修復密切相關(guān)。雖非必需氨基酸，但在提高機體免疫力、維持腸道黏膜正常結(jié)果和功能等方面起著重要的作用。淋巴細胞是重要的免疫器官，脾臟是機體重要的免疫器官。含有大量的T淋巴細胞及B淋巴細胞。所以測定脾淋巴細胞的增殖情況對于研究免疫而言起著重要的作用。碳粒廓清試驗中發(fā)現(xiàn)復合菌與復合菌-玉米肽制劑能夠提高碳粒廓清指數(shù)。遲發(fā)型變態(tài)反應試驗中，玉米肽的加入提高了復合雙歧桿菌的刺激T細胞的能力。脾細胞細胞增殖試驗中，復合菌與復合菌-玉米肽制劑高劑量結(jié)果呈差異性顯著。能夠有效的促進脾淋巴增殖。免疫球蛋白A是機體內(nèi)較為常見的蛋白。免疫球蛋白A的含量一定程度上反映機體的免疫情況。復合菌-玉米肽制劑高劑量組度都能促進機體內(nèi)免疫球蛋白A?？寡趸芰χ饕獪y定SOD活性與MDA含量，試驗結(jié)果表明復合菌和復合菌-玉米肽能夠提高SOD活性，降低MDA含量。結(jié)果表明復合菌與復合菌-玉米肽制劑有一定的抗氧化能力。雙歧桿菌為常見的益生菌，對人體起著重要的作用。玉米肽的加入能夠有效地提高雙歧桿菌的免疫活性與抗氧化能力，為接下來的研究提供一定的參考。

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The Effect of Corn Peptide on Immunity Function of Bifidobacriums

ZHANG Zhi1，LIN Xiu-fang1，MA Jian-zhang1，*，ZHENG Xi-qun2，*
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

The research was mainly about the immunity function of complex probiotics（Bifidobacrium Longum＋Bifidobacrium adolescent＋Bifidobacrium animalis）and complex probiotics-corn peptide.Mice were randomly divided into seven groups including blank control group，three groups treated with compound probiotics liquid at different doses and three groups treated with complex probiotics-corn peptide at different doses.Mice（SPF grade from Kunming）were continuously eaten after 30 d.The methods for immunity function were relative to weights of spleen and thymus，carbon granule clearance assay，plaque forming assay，DHT，and Elisa.Through the carbon granule clearance experiment，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide have obvious changes compared with the control team.Through the splenic lymphocyte proliferation experiment，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide have markedly obvious changes compared with the control team. The experiment showed that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide enhanced certain parameter of splenic lymphocyte function.Through DHT experiment，the results implied that complex probiotics-corn peptide have changes compared with the control team.Through the Elisa experiment，the experiment implied that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide could enhance IgA.In conclusion，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide could be able to enhance mice immunity function.The measures of antioxidation function were the content of MDA and the activity of SOD.The results showed that complex probi－otics and complex probiotics-corn peptide could reduce the content of MDA and improve the activity of SOD. The experiment showed that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide had antioxidation function.

corn peptide；probiotics；immunity；antioxidation；effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.003

2016-11-12

大熊貓國際資金項目（SG1409）；黑龍江省應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（GA13B201）

張智（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物與發(fā)酵工程。

*通信作者：馬建章（1937—），男（漢），教授，博士，研究方向：主要從事野生動物生態(tài)管理與自然保護區(qū)方面的研究；鄭喜群（1963—），男（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及應用酶學。