手性藥物分析方法研究進(jìn)展

?鐘春素 ，楊 華 ?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

手性藥物分析方法研究進(jìn)展

鐘春素1，楊 華2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

從手性藥物的概念入手，闡述了高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、分子印跡技術(shù)、高速逆流色譜法、超臨界流體色譜法和生物酶法等幾種常用的手性藥物分析技術(shù)的原理、特點(diǎn)及研究實(shí)例，以期為手性藥物分離技術(shù)提供指導(dǎo)。

手性藥物；分離；色譜法；研究進(jìn)展

目前，40%～50%的藥物具有手性。而手性藥物的2種不同對(duì)映體的生物活性存在較大差異，一個(gè)可能是有效成分，而另一個(gè)可能是低效甚至是有毒成分。在人體內(nèi)，兩對(duì)映體也可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，這就導(dǎo)致了很多藥物服用之后出現(xiàn)副作用。因此，在對(duì)藥物進(jìn)行理化性質(zhì)分析的時(shí)候，手性藥物的分離技術(shù)發(fā)揮了重要作用。筆者從手性藥物的概念入手，闡述了近幾年常用的幾種手性藥物分析技術(shù)的原理、特點(diǎn)及研究實(shí)例，以期為手性藥物分離技術(shù)提供指導(dǎo)。

1 手性藥物概述

手性藥物即在藥物分子結(jié)構(gòu)中引入手性中心所得到的一對(duì)互為鏡像與實(shí)物的對(duì)映異構(gòu)體。目前，臨床上使用的藥物約有40%～50%是手性藥物。手性藥物的藥理可能有以下4種情況：（1）其中一個(gè)對(duì)映體具有預(yù)期的藥理活性，而另一個(gè)對(duì)映體卻不存在；（2）兩個(gè)對(duì)映體有類(lèi)似或者接近的藥理活性；（3）兩對(duì)映體藥理活性不相同，而且其中一個(gè)有可能是其消旋體藥物副反應(yīng)的根源；（4）兩對(duì)映體藥理活性相同但兩者作用強(qiáng)度不同[1]。在藥代動(dòng)力學(xué)方面，手性藥物也可能在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄中表現(xiàn)出一定程度的立體選擇性。因此進(jìn)行手性藥物的分離以及質(zhì)量控制、藥效評(píng)價(jià)具有很重要的意義。

2 手性藥物分析技術(shù)

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法自20世紀(jì)70年代興起以來(lái)便成為藥物分析最常用的方法之一。在拆分手性藥物對(duì)映體的應(yīng)用中，HPLC法分為直接法和間接法，直接法是將不對(duì)稱(chēng)中心引入分子間，包括手性固定相法和手性流動(dòng)相添加劑法；間接法又稱(chēng)手性試劑衍生化法，它與前者所不同的地方在于它是將不對(duì)稱(chēng)中心引入到分子內(nèi)部。

陳立云等[2]通過(guò)對(duì)照品法測(cè)定安立生坦的對(duì)映異構(gòu)體，用Chiral-pakAD-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）作色譜柱，正己烷-乙醇（95︰5）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm。結(jié)果表明，高效液相色譜法能使安立生坦與其對(duì)映異構(gòu)體有效分離，且分離度達(dá)8.0以上，質(zhì)量濃度在1.04～5.18 μg/mL之間有良好線(xiàn)性關(guān)系。

王麗娜等[3]使用正相高效液相色譜法，以DAICELOJ-H作手性柱，正己烷-乙醇-二乙胺為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫維持30℃，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定左舒必利原料中的雜質(zhì)及其含量。結(jié)果表明，左舒必利的分離度在此實(shí)驗(yàn)條件下為2.1，在1.648～16.48 μg/mL之間線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.099和0.198 μg/mL，通過(guò)該方法檢測(cè)得到3批原料中手性雜質(zhì)含量為0.47%～0.50%。

鄭振等[4]采用反相高效液相色譜法，以環(huán)糊精作固定相分離抗抑郁藥米那普侖對(duì)映體。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)多次拆分條件的優(yōu)化，確定出采用乙?；?β-環(huán)糊精手性柱AstecCYCLOOBONDTMI2000AC作固定相，0.1%的乙腈（體積分?jǐn)?shù)）和pH值5.0的醋酸三乙胺溶液為流動(dòng)相，流速為0.4 mL/min，柱溫維持在25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，米那普侖對(duì)映體能夠快速分離，且分離度達(dá)1.74。

2.2 毛細(xì)管電泳法（CE）

CE是20世紀(jì)80年代初期由傳統(tǒng)電泳技術(shù)與色譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，分離模式多樣化，分離效率高。近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥科學(xué)、食品檢測(cè)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。

付小帥等[5]采用手性選擇劑羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD），以NaH2PO4緩沖溶液為電解質(zhì)，采用未涂層熔融石英材料毛細(xì)管柱，在20 kV電壓下分離佐匹克隆、卡維地洛、普萘洛爾、氧氟沙星和尼卡地平5種堿性藥物對(duì)映體。結(jié)果表明，佐匹克隆等5種藥物在該試驗(yàn)條件下對(duì)映體的分離度分別為5.7、6.2、5.0、9.8和3.0，說(shuō)明CM-β-CD對(duì)佐匹克隆等5種手性藥物有較高的對(duì)映體選擇性。

董樹(shù)清等[6]采用超支化聚合物涂覆于表面的熔融石英作毛細(xì)管柱，以硼砂-氫氧化鈉為背景運(yùn)行緩沖液，分離阿苯達(dá)唑亞砜等幾種手性藥物的基線(xiàn)。結(jié)果表明，超支化聚合物應(yīng)用在毛細(xì)管電泳技術(shù)中能很好地實(shí)現(xiàn)手性藥物的分離，并且分離效率高。

孫嘉怡等[7]采用羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）作手性選擇劑，使用未涂層的石英毛細(xì)管柱，電解質(zhì)為NaH2PO4緩沖溶液，在20 kV電壓下拆分羥氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特羅4種手性藥物。結(jié)果表明，羥氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特羅的分離度分別為6.79、1.56、10.49和3.75，說(shuō)明CM-β-CD針對(duì)這4種手性藥物有很高的選擇性。

左莉華等[8]采用手性選擇劑硫酸化-β-環(huán)糊精（S-β-CD），以未涂壁石英材料作毛細(xì)管柱，背景電解質(zhì)采用NaH2PO4緩沖溶液，在電壓為20 kV下拆分曲馬多、利阿唑、苯丙哌林、1-芐基-3哌啶醇和聯(lián)苯芐唑5種手性藥物。結(jié)果表明，5種藥物的分離度分別為6.10、2.80、10.41、5.50和4.09，說(shuō)明S-β-CD對(duì)這5種手性藥物的選擇性較高。

2.3 分子印跡技術(shù)（MIT）

分子印跡技術(shù)是一種通過(guò)設(shè)計(jì)合成對(duì)目標(biāo)分子（如藥物等）具有親和力和特異選擇性的分子印跡聚合物的技術(shù)，該技術(shù)的發(fā)明啟發(fā)于抗原-抗體的專(zhuān)一性識(shí)別。因分子印跡聚合物（MIPs）具有構(gòu)效預(yù)定性、特異性、穩(wěn)定性、適用廣泛性和結(jié)合能力高等特點(diǎn)，在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9]。

邴乃慈等[10]以4-乙烯基吡啶為功能單體，通過(guò)支撐膜聚偏氟乙烯中空纖維超濾膜和模板分子S-（+）-萘普生設(shè)計(jì)合成分子印跡復(fù)合膜，采用紫外光譜法研究了目標(biāo)分子與模板分子之間的相互作用。結(jié)果表明，分子印跡聚合物膜中存在著與模板分子互補(bǔ)的三維空間結(jié)構(gòu)以及由功能基的孔穴組成的通道，該通道能夠選擇性地透過(guò)S-（+）-萘普生，在親和力和壓力的共同作用下，最大分離因子達(dá)到6.19。

趙瀟等[11]采用S-布洛芬作印跡分子，接枝環(huán)糊精的醋酸纖維素復(fù)合物作鑄膜材料，通過(guò)相轉(zhuǎn)化法合成了具有手性拆分功能的分子印跡膜，并通過(guò)滲透試驗(yàn)考察了所制備分子印跡膜對(duì)外消旋布洛芬的手性拆分效能。結(jié)果表明，在β-環(huán)糊精接枝率為29.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），模板分子濃度比為1︰10，鑄膜液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%的條件下，分子印跡膜對(duì)右旋布洛芬的分離因子可達(dá)2.09。

2.4 高速逆流色譜法（HSCCC）

高速逆流色譜是利用高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)兩相溶劑體系建立起的一種特殊單向性流體力學(xué)平衡，兩相其中一相是固定相，另一相是流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)連續(xù)洗脫過(guò)程能保留大部分固定相的分離方法，因其具有無(wú)污染、樣品無(wú)損失、高效、大制備量分離等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

Tong等[12]使用羥丙基-β-環(huán)糊精手性拆分甲氧萘丙酸，研究了對(duì)手性選擇性和分配系數(shù)均有影響的操作條件，即8種水相pH值及9種溶劑系統(tǒng)，最終挑選出最優(yōu)的操作條件，最終藥品回收率達(dá)89%，并且拆分得到的單體純度高達(dá)99.5%以上。

沈芒芒[13]在分析型高速逆流色譜上采用N-n-十二烷基-L-脯氨酸作手性配體，銅離子作配位金屬，在正丁醇-正己烷-水三相溶劑體系或正丁醇-水兩相溶劑中實(shí)現(xiàn)了7種α-羥基酸類(lèi)手性化合物的手性拆分，成功分離了76 mg 2-氯扁桃酸、74 mg 4-甲氧基扁桃酸和74 mg扁桃酸，并通過(guò)液相檢測(cè)，得出對(duì)映體的純度均超過(guò)96%，回收率在82%～90%之間。

謝娜[14]將水溶性手性萃取劑β-環(huán)糊精（β-CD）及其衍生物添加在水相中，將脂溶性手性選擇劑酒石酸酯類(lèi)衍生物添加至有機(jī)相中，采用疏水性相轉(zhuǎn)移劑四苯硼鈉，通過(guò)HSCCC成功分離了苯基乳酸、酮康唑等外消旋物質(zhì)。

2.5 超臨界流體色譜法（SFC）

超臨界流體色譜法是指采用超臨界流體作流動(dòng)相的色譜法。20世紀(jì)60年代Klesper等[15]首次采用超臨界流體作色譜流動(dòng)相分離了卟啉衍生物，超臨界流體色譜法也在此之后慢慢被發(fā)展起來(lái)。SFC兼具HPLC和GC兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是一種分析難揮發(fā)及不耐熱的大分子化合物和生物試樣的有效方法。

戴濤等[16]考察了ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H、ChiralcelOD-H等5種手性柱的分離效果，并分析了分離度的影響因素，包括改性劑的種類(lèi)、溫度、濃度及背壓。結(jié)果表明，采用ChiralpakAD-H柱、以異丙醇（占流動(dòng)相比例為18%）為改性劑、背壓為14 MPa、溫度為29.85℃時(shí)，齊留通對(duì)映體達(dá)到最佳分離，分離度為11.5，兩對(duì)映體出峰時(shí)間分別為4.59、7.35 min。

金薇等[17]采用色譜柱ChiralcelOD，以超臨界二氧化碳-無(wú)水乙醇作流動(dòng)相，流速為2.0 mL/min，背壓為15 MPa，在220 nm波長(zhǎng)處分離測(cè)定左乙拉西坦及其右旋異構(gòu)體。結(jié)果表明，左乙拉西坦與其右旋異構(gòu)體依次出峰，分離度達(dá)3.7，兩者的濃度線(xiàn)性范圍在0.002～0.041 mg/mL之間，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 5和0.999 4（n=7），檢測(cè)線(xiàn)均為10 ng（S/N=3）。

Chennuru等[18]采用新一代手性柱ChiralpakIA，ChiralpakIB及ChiralpakIC，在SFC和LC兩種分離模式下，對(duì)比6種質(zhì)子泵抑制劑（蘭素拉唑、泮托拉唑、奧美拉唑、艾普拉唑、雷貝拉唑、泰妥拉唑）的對(duì)映選擇性。結(jié)果表明，在SFC和LC模式下，各對(duì)映異構(gòu)體洗脫順序是相同的，3種新型手性柱的分離性能由低到高依次是ChiralpakIB＞ChiralpakIA＞ChiralpakIC。

2.6 生物酶法

生物酶法作用條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)物分離純化簡(jiǎn)便，污染及能耗均較低，且產(chǎn)物光學(xué)純度高，在手性藥物中間體的研發(fā)中應(yīng)用非常廣泛[19]。

傅德進(jìn)等[20]通過(guò)單因素優(yōu)化及正交試驗(yàn)確定了摩氏摩根菌的最佳產(chǎn)酯酶培養(yǎng)基配方，以摩氏摩根菌菌體作催化劑，選擇性地拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，目標(biāo)物轉(zhuǎn)化率達(dá)45%，對(duì)映體的過(guò)量值超過(guò)94%，為酶法在普瑞巴林手性中間體生產(chǎn)中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

于芳等[21]使用生物?；涪裼羞x擇性的將被乙?；耐庀?-溴苯丙氨酸進(jìn)行去酰胺化，分離得到了互為異構(gòu)體的溴代苯丙氨酸鹽酸鹽，并通過(guò)高分辨質(zhì)譜、旋光值及核磁共振等數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了該試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，?；涪窨梢杂行?yīng)用于含溴取代的苯丙氨酸衍生物的手性拆分。這為含有苯丙氨酸衍生物結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物分子和藥物分子的合成提供一個(gè)簡(jiǎn)易可行的路線(xiàn)。

張之建等[22]以固定化脂肪酶為催化劑，以異丙醚為溶劑體系，底物采用乙酸乙烯，來(lái)拆分扁桃酸，當(dāng)乙酸乙烯酯與扁桃酸摩爾濃度比為6，扁桃酸濃度為180 mmol/L，溫度為50℃時(shí)，乙酸乙烯的轉(zhuǎn)化率為50%，產(chǎn)物對(duì)應(yīng)體過(guò)剩量和底物對(duì)應(yīng)體過(guò)剩量超過(guò)99.9%。這表明脂肪酶對(duì)扁桃酸選擇性很高。

3 展 望

手性藥物的研究越來(lái)越受到重視，不同分析方法都具備各自的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足。例如HPLC法雖然是目前常用的方法但其手性固定相的成本太高，手性流動(dòng)相添加劑使色譜條件變得較復(fù)雜；而GC法在藥物分析中對(duì)藥物的沸點(diǎn)要求嚴(yán)格，且其非對(duì)映體制備較困難等。為了彌補(bǔ)單一技術(shù)的不足，各種分離技術(shù)的聯(lián)合使用越來(lái)越多，在未來(lái)手性藥物拆分中將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越顯著的作用。

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Advances?in?Analytical?Methods?of?Chiral?Drugs

ZHONG Chun-su1，YANG Hua2
（1. Biosience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Demonstration Center of Plant Science Experiment Teaching , Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Based on the concept of chiral drugs, the principle, characteristics and research examples of several kinds of commonly used chiral pharmaceutical analysis technology were reviewed, which includes high-performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE), molecular imprinting technology(MIT), high-speed counter-current chromatography (HSCCC), supercritical fluid chromatography (SFC) and enzymatic method. All these may provide guidance for chiral drug separation technology.

chiral drug; separation; chromatography; research progress

R914.1

A

1006-060X（2017）11-0113-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.011.031

2017-09-13

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015RS4059）

鐘春素（1995-），女，廣東河源市人，本科生，生物工程專(zhuān)業(yè)。

楊 華

（責(zé)任編輯：成 平）