數(shù)字PCR技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

林佳琪，蘇國(guó)成,2，蘇文金,2，周常義,2

1 集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021

2 廈門市食品科技研發(fā)檢測(cè)中心，福建 廈門 361021

數(shù)字PCR技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

林佳琪1，蘇國(guó)成1,2，蘇文金1,2，周常義1,2

1 集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021

2 廈門市食品科技研發(fā)檢測(cè)中心，福建 廈門 361021

林佳琪, 蘇國(guó)成, 蘇文金, 等. 數(shù)字PCR技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 170–177.

Lin JQ, Su GC, Su WJ, et al. Progress in digital PCR technology and application. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 170–177.

數(shù)字PCR是繼實(shí)時(shí)定量PCR之后新興發(fā)展起來(lái)的一種絕對(duì)定量分析技術(shù)。通過將單個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)移入獨(dú)立的反應(yīng)室，PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)現(xiàn)單分子的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR技術(shù)擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度，在基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)以及下一代測(cè)序等方面均得到廣泛應(yīng)用。本文介紹數(shù)字PCR技術(shù)的定量方法，并評(píng)述該技術(shù)在主要應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

數(shù)字PCR，絕對(duì)定量，泊松分布，突變檢測(cè)，拷貝數(shù)變異檢測(cè)，微生物檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)

1999年，美國(guó)學(xué)者Kenneth Kinzler與Bert Vogelstein首次提出了“數(shù)字PCR (Digital PCR，dPCR)”的概念[1]，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)絕對(duì)定量的突破。其主要特點(diǎn)之一在于將目標(biāo)分子分散入單個(gè)反應(yīng)室中，使每個(gè)反應(yīng)室中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，是實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR高靈敏度和高準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。

1 技術(shù)原理

數(shù)字PCR主要原理是將單個(gè)DNA分子置于獨(dú)立的反應(yīng)室中，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用TaqMan?化學(xué)試劑及染料標(biāo)記探針檢測(cè)特定的靶序列，通過呈現(xiàn)兩種信號(hào)類型的反應(yīng)單元比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)樣品的絕對(duì)定量。因此，數(shù)字PCR也稱單分子PCR，其檢測(cè)過程主要包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。在PCR反應(yīng)前，將樣品分散至幾萬(wàn)個(gè)單元 (反應(yīng)室) 中，使每個(gè)單元中只存在單個(gè)DNA分子。PCR擴(kuò)增階段的擴(kuò)增程序、擴(kuò)增體系與普通PCR并沒有什么不同。在熒光信號(hào)分析階段，采用終端檢測(cè)，是對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，然后直接計(jì)數(shù)或者借用泊松統(tǒng)計(jì)得到樣品的原始濃度或含量 (圖1)。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同的是，整個(gè)數(shù)字PCR過程不需要擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線和看家基因，具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量。

基于分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為3種：微流體數(shù)字PCR (Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 和芯片數(shù)字PCR (Chip digital PCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實(shí)現(xiàn)分液，分隔開的每個(gè)微小區(qū)域都可進(jìn)行單獨(dú)的PCR反應(yīng)，其中mdPCR基于微流控技術(shù)，對(duì)DNA模板進(jìn)行分液，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術(shù)，是相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，利用油包水微滴生成技術(shù)，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200 微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)，其中Bio-rad公司的dPCR系統(tǒng)利用油包水生成技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系生成20 000個(gè)納升級(jí)微滴，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)；cdPCR利用微流控芯片技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系統(tǒng)和Life Technologies公司的QuantStudio系統(tǒng)。利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

圖1 數(shù)字PCR原理[2]Fig. 1 The schematic diagram of digital PCR[2].

2 數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)PCR技術(shù)是將目的基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增循環(huán)，一個(gè)DNA分子模板復(fù)制成成千上萬(wàn)的子代雙螺旋，然后用凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。但是，凝膠電泳檢測(cè)只能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子大小進(jìn)行判斷，而無(wú)法推斷出起始樣品中DNA的含量，因此無(wú)法進(jìn)行定量分析；實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量，其中絕對(duì)定量是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量，標(biāo)準(zhǔn)品可選擇純化的質(zhì)粒DNA或體外合成的ssDNA等，相對(duì)定量通過內(nèi)參等進(jìn)行換算起始樣品中DNA的相對(duì)含量。數(shù)字PCR是基于傳統(tǒng)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第3代PCR技術(shù)，它不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即能實(shí)現(xiàn)更靈敏、更準(zhǔn)確的絕對(duì)定量。

數(shù)字PCR高精確度的另一個(gè)重要因素是將泊松統(tǒng)計(jì)引入數(shù)字PCR的檢測(cè)應(yīng)用中。由于數(shù)字PCR是一種終端檢測(cè)的分析方法，如果目標(biāo)分子沒有得到很好的離散，在一個(gè)反應(yīng)室中不止存在一個(gè)靶DNA，那么得到的濃度便不可信。泊松統(tǒng)計(jì)是對(duì)隨機(jī)分布的一種描述方法，當(dāng)反應(yīng)室/液滴量和其中陰性比例已知，即可通過泊松模型獲得初始濃度。所以，如果反應(yīng)室沒有達(dá)到飽和，研究者也可以計(jì)算樣品的起始分子數(shù)。Beer等的研究表明，基于液滴方法的優(yōu)勢(shì)在于其可擴(kuò)大性，增加反應(yīng)容器的數(shù)量，數(shù)據(jù)的質(zhì)量也就隨之增大[3]。即當(dāng)擴(kuò)大或增加了反應(yīng)容器的數(shù)量時(shí)，泊松精度也隨之提升。

同時(shí)，數(shù)字PCR能夠有效避免反應(yīng)抑制劑的影響。隨著反應(yīng)室的增加，反應(yīng)受到抑制劑的影響就越小。

3 數(shù)字PCR的應(yīng)用

在Web of Knowledge平臺(tái) Science Citation Index Expanded數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索1999年至2016年6月間“digital PCR，dPCR”關(guān)鍵詞 (截止至2016年6月25日)，搜索結(jié)果顯示，共有1 787篇相關(guān)文獻(xiàn)，針對(duì)其中1 405篇article類文章進(jìn)行文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析。如圖2表明，與數(shù)字PCR相關(guān)的研究文章數(shù)量逐年增加，而且自2010年起每年論文數(shù)的增加量迅猛；在眾多國(guó)家中，美國(guó)和中國(guó)是數(shù)字PCR研究大軍中的主要國(guó)家(圖3)。據(jù)Kalorama Information發(fā)布的研究報(bào)告顯示，2019年全球數(shù)字PCR和qPCR市場(chǎng)預(yù)計(jì)將達(dá)到39.7億美元，中國(guó)是最主要的新興市場(chǎng)[4]。

3.1 在突變檢測(cè)方面的應(yīng)用

常規(guī)組織和血液等樣品中，由于單個(gè)突變的體細(xì)胞含量低，使得檢出其的存在變得困難。而dPCR可對(duì)復(fù)雜的大背景進(jìn)行有限的稀釋或分區(qū)，通過有限稀釋，降低野生基因型的背景信號(hào)，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，特別適用于稀有突變的檢測(cè)應(yīng)用。研究表明，低至1/100 000的變異頻率能被檢測(cè)出來(lái)[5–6]。并且隨著反應(yīng)室數(shù)量的增加，對(duì)稀有變異的分析更靈敏。

圖2 SCIE數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)1999?2016年間全球數(shù)字PCR論文發(fā)表量Fig. 2 Number of published papers on digital PCR from 1999 to June 2016 according to SCIE.

圖3 數(shù)字PCR論文發(fā)文量排在前十位的國(guó)家Fig. 3 Top 10 countries which ranked in the number of published papers on digital PCR.

dPCR在稀有突變檢測(cè)方面有廣泛的應(yīng)用和研究，尤其是與癌癥相關(guān)的檢測(cè)和定量研究，如EGFR[7]、BRAF[8]、KRAS[9]、PIK3CA[10–11]、JAK2[12]和miRNAs[13]等。PIK3CA可由IGF-1、HGF、EGF等生長(zhǎng)因子激活，與生長(zhǎng)因子一同作用于受體酪氨酸激酶，促進(jìn)增殖、血管生成和細(xì)胞的新陳代謝。Kim等用ddPCR對(duì)血清中游離的DNA進(jìn)行PIK3CA突變的檢測(cè)分析[10]，血清中低豐度的PIK3CA突變成功被檢測(cè)出來(lái)。對(duì)38份轉(zhuǎn)移性膽道癌樣品進(jìn)行試驗(yàn)，匹配的一份血清樣品PIK3CA p.E542K對(duì)28突變拷貝呈陽(yáng)性，相當(dāng)于48 copies/mL血清和0.3%的等位基因的患病率；另一血清樣品PIK3CA p.H1047R對(duì)10突變拷貝呈陽(yáng)性，相當(dāng)于18 copies/mL血清和0.2%的等位基因的患病率。Miotto等研究表明EvaGreen染料法和TaqMan探針法均可用于人體血漿和血清中循環(huán)miRNA的ddPCR檢測(cè)定量[14]。

3.2 在拷貝數(shù)變異檢測(cè)方面的應(yīng)用

通常基因表達(dá)分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、realtime PCR等方法，拷貝數(shù)的確定總是受到限制。而使用dPCR進(jìn)行直接計(jì)數(shù)目標(biāo)基因和參照基因的雙重反應(yīng)，通過計(jì)算比值，便直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)[15–17]。

影響HIV感染和疾病進(jìn)展的CCL3編碼基因拷貝數(shù)變異 (Copy number variations，CNV)的發(fā)現(xiàn)引起廣泛的爭(zhēng)議，已經(jīng)在一定程度上歸因于拷貝數(shù)評(píng)估方法獲得的不同結(jié)果。CCL3基因編碼CC趨化因子CCL4，也是CCR5受體的自然配體，對(duì)HIV-1起到了保護(hù)作用。Bharuthram等用標(biāo)準(zhǔn)方法qPCR和ddPCR對(duì)CCL4L基因拷貝數(shù)進(jìn)行評(píng)估測(cè)定[18]。研究表明，與qPCR (r=0.87，P＜0.000 1)相比，由ddPCR測(cè)得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關(guān)性 (r=0.99，P＜0.000 1)。而qPCR在高拷貝數(shù)時(shí)出現(xiàn)準(zhǔn)確性明顯下降。Whale等模擬不同CNVs的HER2基因擴(kuò)增，相同試驗(yàn)條件下，dPCR能夠檢測(cè)比qPCR更低的CNVs[19]。由于dPCR準(zhǔn)確度與擴(kuò)增大小和模板濃度是直接相關(guān)性的，他們也建立了用于測(cè)量CNV的dPCR方法。利用泊松和二項(xiàng)分布，得出dPCR的方差表達(dá)式。

3.3 在微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

核酸擴(kuò)增技術(shù)是病原微生物檢測(cè)的一個(gè)重要方法，但可能存在的問題是，有時(shí)候低水平目標(biāo)分子和小分子抑制劑的存在使得檢測(cè)定量的結(jié)果發(fā)生偏移。dPCR則是一種不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線并且對(duì)部分抑制劑不靈敏的檢出方法。因此，研究人員紛紛將其應(yīng)用于一些病毒或致病菌的檢測(cè)研究中，如HBV[20–21]、腸病毒[22]、腺相關(guān)病毒[23]、巨細(xì)胞病毒[24]、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[25]、結(jié)核分支桿菌[26]、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[27]等。Strain等采用ddPCR和qPCR對(duì)HIV 經(jīng)過聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療的病人體內(nèi)殘留的DNA進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，ddPCR具有更高的精確度和更低的拷貝變異系數(shù)[28]。Dong等對(duì)E. coliO157:H7的rfbE基因建立ddPCR，優(yōu)化探針濃度，在20 μL體系中，對(duì)E. coliO157:H7基因組DNA的檢測(cè)范圍為4?1.25×105copies，線性相關(guān)系數(shù)為0.999[29]。同時(shí)用ddPCR和qPCR對(duì)16份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)得到相同結(jié)果。

在環(huán)境檢測(cè)方面，dPCR也得到相應(yīng)的應(yīng)用[30–31]。Josefa等在對(duì)土壤、植物根莖樣品中煙草疫霉菌的低拷貝DNA定性定量的研究發(fā)現(xiàn)，與qPCR相比，dPCR對(duì)反應(yīng)抑制劑更不敏感[32]。由于基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的realtime PCR方法在檢測(cè)方面帶來(lái)的偏差，Cao等利用雙重ddPCR同時(shí)檢測(cè)糞源和水質(zhì)中的腸球菌和人源糞便相關(guān)標(biāo)記HF183[33]。qPCR中雙重的腸球菌和HF183相互競(jìng)爭(zhēng)使得其無(wú)檢出或超出其單重最低檢測(cè)濃度范圍，而ddPCR的單重和雙重檢測(cè)結(jié)果一致。其對(duì)抑制劑的較高耐受性、重復(fù)性、檢測(cè)靈敏度以及準(zhǔn)確度均比qPCR高，但是其定量上限較realtime PCR低。Anja等將ddPCR與qPCR聯(lián)合起來(lái)使用，用ddPCR制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用realtime PCR進(jìn)行定量，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)不同生物膜形成時(shí)期的單增李斯特菌定量檢測(cè)[34]。

3.4 在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方面的應(yīng)用

歐盟國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因食品有著嚴(yán)格的限定，而目前，一般采用實(shí)時(shí)定量PCR用于商品中轉(zhuǎn)基因的分子定量分析。但是在一些復(fù)雜的食物原料和飼料原材料中，目標(biāo)DNA非常少，使得對(duì)其的檢測(cè)和定量受到限制。dPCR為國(guó)內(nèi)外研究人員提供了新的方法。Morisset等用ddPCR對(duì)MON810轉(zhuǎn)基因和hmg玉米參考基因進(jìn)行絕對(duì)定量[35]。研究表明，ddPCR對(duì)低濃度的檢測(cè)具有更高的重復(fù)性，并且對(duì)抑制劑具有更高耐受性。Dobnik等用多重ddPCR檢測(cè)定量12個(gè)歐盟授權(quán)轉(zhuǎn)基因玉米，對(duì)于含轉(zhuǎn)基因組織樣品中，該方法比實(shí)時(shí)定量PCR更高通量、更高效[36]。Damira等建立雙重ddPCR用于檢測(cè)定量轉(zhuǎn)基因玉米中T-nos/hmg基因的拷貝數(shù)比例，通過中心復(fù)合設(shè)計(jì)優(yōu)化，并在體系中加入DNA 消化酶減小檢測(cè)偏差，所建立的方法T-nos檢測(cè)限為11拷貝，T-nos/hmg 比例的動(dòng)態(tài)范圍為 0.08%–100% [37]。

3.5 在下一代測(cè)序方面的應(yīng)用

下一代測(cè)序 (NGS) 又叫高通量測(cè)序，是測(cè)序技術(shù)革命性的進(jìn)步，能一次上百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和全基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為現(xiàn)實(shí)。dPCR平臺(tái)可以與NGS對(duì)接，實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)量控制、提供對(duì)測(cè)序文庫(kù)的定量分析和質(zhì)量評(píng)估信息。一方面，dPCR對(duì)NGS的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)諸如單核苷酸多態(tài)性，突變及拷貝數(shù)變異在內(nèi)的基因組變異進(jìn)行驗(yàn)證，確保測(cè)序結(jié)果的可信度；另一方面，所得到的結(jié)果還包含反映測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量的信息，如接頭與接頭二聚體、錯(cuò)誤連接片段、過長(zhǎng)連接片段等，這是當(dāng)前其他方法所不具備的優(yōu)勢(shì)。Alikian等研究表明，在慢性粒細(xì)胞白血病患者的檢測(cè)中，dPCR比qPCR更準(zhǔn)確，定量分析結(jié)果可靠性高、重復(fù)性好[38]。

4 展望

dPCR與普通PCR、qPCR相比具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了單分子DNA絕對(duì)定量，使其成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，研究者對(duì)其應(yīng)用分析也日益關(guān)注。近期，相應(yīng)的分析軟件有所突破，美國(guó)已推出一款ddpcr軟件可用于使用者分析dPCR數(shù)據(jù)，免費(fèi)在線網(wǎng)址為https://daattali.com/shiny/ddpcr/[39]。軟件及網(wǎng)站的建立為dPCR技術(shù)的推廣和應(yīng)用提供重要支持。

未來(lái)如果能有效解決dPCR耗材成本高、實(shí)驗(yàn)通量少等問題和實(shí)現(xiàn)操作智能化，dPCR將在臨床診斷與治療、微生物檢測(cè)和食品安全檢測(cè)等方面擁有更廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in digital PCR technology and application

Jiaqi Lin1, Guocheng Su1,2, Wenjin Su1,2, and Changyi Zhou1,2
1College of Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen361021,Fujian,China
2Xiamen Food Research and Inspection Centre,Xiamen361021,Fujian,China

Digital PCR is an emerging analysis technology for absolute quantification after realtime-PCR. Through digital PCR, single DNA molecules are distributed into isolated reactions, and the product with fluorescence signal can be detected and analyzed after amplification. With the advantages of higher sensitivity and accuracy, digital PCR, independent of a standard curve, is developing rapidly and applied widely to the next generation sequencing and detection fields, such as gene mutation, copy number variation, microorganism, and genetically modified food. In this article, we reviewed the quantitative method and research progress of digital PCR technology in the main application fields.

digital PCR, absolute quantification, poisson distribution, mutation detection, copy number variationdetection, microbial detection, genetically modified food detection

Changyi Zhou. Tel: +86-592-6181487; E-mail: chyizhou@163.com

Received:July 15, 2016;Accepted:November 7, 2016

Supported by:Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2015J01614), Science and Technology Project of Xiamen (No. 3502Z20133012).

福建省自然科學(xué)基金 (No. 2015J01614)，廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 3502Z20133012) 資助。

時(shí)間：2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1638.006.html