種子老化的分子生物學(xué)研究

程 航，陳玲玲，夏方山，閆慧芳，毛培勝

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，草業(yè)科學(xué)北京市重點實驗室，北京 100193)

種子老化的分子生物學(xué)研究

程 航，陳玲玲，夏方山，閆慧芳，毛培勝

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，草業(yè)科學(xué)北京市重點實驗室，北京 100193)

種子作為最基本的生產(chǎn)資料，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)得以發(fā)展的必要條件。老化將導(dǎo)致種子質(zhì)量下降，最終失去生命力，給生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究種子老化機制對尋找應(yīng)對種子老化的辦法具有重要的意義。目前，關(guān)于種子老化的研究大多集中在生理生化變化方面，而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，合理運用這些技術(shù)，必將使從更深層次解釋種子老化機制成為可能。本文對近年來種子老化分子生物學(xué)方面研究取得的成果進(jìn)行了綜述，發(fā)現(xiàn)種子老化后其遺傳完整性降低，與能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激響應(yīng)、衰老死亡以及糖酵解途徑等相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，一些與脂質(zhì)過氧化及DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因功能已得到驗證。最后對種子老化機理的研究前景做出展望，指出蛋白和mRNA定位、基因功能研究以及完善信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要性。

種子老化；分子標(biāo)記；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；蛋白質(zhì)組學(xué)；基因功能驗證；活性氧；脂質(zhì)過氧化

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子是最基本的生產(chǎn)資料，其涵義非常廣泛，凡可以直接用作播種材料的植物器官都稱之為種子[1]。種子生理成熟時，活力達(dá)到最高，進(jìn)入儲藏或休眠階段后，活力開始下降，不可避免地發(fā)生老化，進(jìn)而種子質(zhì)量降低，影響生產(chǎn)。一直以來，很多學(xué)者致力于研究種子老化的機理，以期找到應(yīng)對儲藏過程中種子老化的辦法。由McDonald[2]總結(jié)提出的脂質(zhì)過氧化是目前接受度最高的一種解釋種子老化的模型，該模型指出，種子內(nèi)部發(fā)生的自動氧化或者是在氧化酶的作用下產(chǎn)生的自由基，會攻擊脂類物質(zhì)，造成脂類物質(zhì)過氧化，促使種子老化。以往關(guān)于種子老化的研究多集中在老化過程中種子生理生化的變化[3]和引發(fā)對種子老化的影響[4]等方面，從分子生物學(xué)的角度解釋種子老化機理的報道并不多見，但結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)研究種子老化機理是必然趨勢。為此，就近年來種子老化相關(guān)的分子標(biāo)記、組學(xué)研究和基因功能驗證等研究情況進(jìn)行闡述，并對種子老化的研究趨勢和熱點提出個人見解，以期為種子老化機理的研究提供理論依據(jù)。

1 種子老化分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是以生物個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列差異為基礎(chǔ)的，是DNA水平遺傳變異的直接反應(yīng)。目前已建立了多種分子標(biāo)記，如以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase Chain Reaction，PCR)為基礎(chǔ)的簡單重復(fù)序列技術(shù)(simple sequence rRepeat,SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間DNA標(biāo)記技術(shù)(inter-simple sequence repeats,ISSR)、隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)(表1)，以及以分子雜交為基礎(chǔ)的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和以DNA序列為基礎(chǔ)的序列特異性擴增區(qū)技術(shù)(sequence-characterized amplified regions,SCAR)。由于直接以DNA形式表現(xiàn)，不受時間空間的限制，所以不存在表達(dá)與否的問題，而且數(shù)量極多，遍及整個基因組，檢測手段簡單快速[5]，因此得到了廣泛的應(yīng)用。遺傳完整性指種質(zhì)原始的遺傳組成狀態(tài)得到完全的保存[6]，而在種子儲藏的過程中，老化不可避免，進(jìn)而導(dǎo)致DNA水平的變化，遺傳完整性會有不同程度的喪失，因此分子標(biāo)記技術(shù)在種子老化方面的應(yīng)用主要集中在老化對遺傳完整性的影響方面。

1.1 簡單重復(fù)序列技術(shù)

簡單重復(fù)序列又稱微衛(wèi)星，它是一段1～6 bp的DNA[7-8]。該技術(shù)的優(yōu)點是重復(fù)性好，在基因組中隨機分布，標(biāo)記數(shù)量多，所需DNA 量少[9]。SSR分子標(biāo)記多用于分析種子老化對遺傳完整性的影響。使用SSR分析老化處理后的玉米(Zeamays)種子，與未老化組相比，其多態(tài)性條帶百分率、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、Shannon指數(shù)等遺傳參數(shù)均有所下降[10]，表明老化降低了玉米種子遺傳完整性。這與在大豆(Glycinemax)[11]和扁蓿豆(Melissitusruthenica)[12]種子中的研究結(jié)果一致。另外，SSR技術(shù)在一些物種的遺傳圖譜構(gòu)建和老化相關(guān)QTL分析上也有應(yīng)用，如玉米[13]和大豆[14]。但是SSR分子標(biāo)記技術(shù)也存在一些缺點，如種屬特異性強，需要測序，所需費用較多[15]。

表1 主要分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)缺點Table 1 Merits and defects of the main molecular marker technologies

1.2 簡單重復(fù)序列區(qū)間DNA標(biāo)記技術(shù)

ISSR最早是由Zietkeiwitcz 等[16]在SSR的基礎(chǔ)上建立起來的，ISSR引物設(shè)計較SSR簡單，不需要預(yù)先知道基因序列，所需DNA量較少、成本低、技術(shù)要求低、操作簡單[17]。這些優(yōu)點使其廣泛應(yīng)用于多個物種的種子老化后遺傳物質(zhì)完整性的研究。利用ISSR分子標(biāo)記檢測不同老化程度扁蓿豆的種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性的研究[18]，與未老化組相比，老化扁蓿豆種子的多態(tài)性位點百分率(PPB)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon指數(shù)(I)等遺傳參數(shù)均較低，且隨老化程度的加重，各參數(shù)呈下降的趨勢，表明老化處理能夠降低扁蓿豆的遺傳穩(wěn)定性；SSR分子標(biāo)記也驗證了以上結(jié)果，但SSR標(biāo)記檢測的多態(tài)性位點低于ISSR標(biāo)記，說明ISSR分子標(biāo)記更適用于扁蓿豆種質(zhì)遺傳完整性變化的分析研究[19]。采用ISSR分子標(biāo)記對老芒麥(Elymussibiricus)老化種子遺傳完整性的研究[20]，也獲得了類似的結(jié)果，隨著老化程度的加重，老芒麥種子發(fā)芽率逐漸降低，各遺傳參數(shù)也下降，基因組DNA片段消失或顏色變淺，并出現(xiàn)特異的DNA片段，這些變化多集中在750-2 000 bp和250-500 bp的范圍。其它物種，如芥菜(Brassicajuncea)[21]、水稻(Oryzasativa)[22]和錦雞兒(Caraganaarborescens)[23]，其人工老化種子的ISSR標(biāo)記分析也證實了老化使基因組DNA受損，其中芥菜種子DNA片段損傷的區(qū)域為100-250和750-2 000 bp，水稻種子為350-400和600-700 bp。但是，ISSR分子標(biāo)記也具有一些缺點，例如它在多數(shù)情況下不能區(qū)別一個位點擴增的DNA片段，引物在篩選上具有相對的不隨機性[24]。

1.3 隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)

RAPD技術(shù)具有很多優(yōu)點，如DNA用量很少、所用引物沒有嚴(yán)格的種屬界限、不需要使用同位素等[25-26]，也是多用于種子老化的遺傳完整性分析。對大豆種子進(jìn)行老化處理后利用RAPD分析發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物中弱帶增多，而且對比老化的大豆種胚和子葉中DNA的RAPD擴增條帶發(fā)現(xiàn)，隨著老化程度的加深，遺傳變異會增加[27]。黃瓜(Cucumissativus)種子[28]和甘藍(lán)(Brassicaoleracea)種子老化后的RAPD擴增條帶也出現(xiàn)了強帶變?nèi)趸蛳?、弱帶增多的現(xiàn)象，并且使用PEG滲調(diào)后，DNA帶與未老化對照基本相同[29-30]。但是，也有報道稱大豆種子[31]和紅麻(Hibiscuscannabinus)種子[32]進(jìn)行老化處理后，RAPD分析發(fā)現(xiàn)其遺傳完整性沒有受到影響。

1.4 甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)

MSAP優(yōu)點是不需要知道被測DNA的序列信息，可快速檢測出基因組DNA中的甲基化位點，所以該技術(shù)被應(yīng)用于老化種子基因組DNA甲基化變異的研究，以期從表觀遺傳學(xué)的角度分析老化種子的活力。將玉米單交種鄭單958和先玉335進(jìn)行人工老化，MSAP分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，玉米種子活力降低的主要原因是CG+CHG甲基化水平升高，而且種子的活力指標(biāo)、生理指標(biāo)與CG甲基化程度相關(guān)性較高，但不同的是，鄭單958的 CG甲基化程度與電導(dǎo)率、丙二醛含量呈負(fù)相關(guān)，與過氧化物酶和過氧化氫酶活性呈正相關(guān)，而先玉 335的CG甲基化與電導(dǎo)率、丙二醛呈正相關(guān)，與過氧化物酶和過氧化氫酶活性呈負(fù)相關(guān)，因此，鄭單958和先玉335種子老化的 DNA 甲基化調(diào)控機制不同[33]。使用MSAP分子標(biāo)記研究花生(Arachishypogaea)和水稻種子老化與DNA甲基化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨種子老化程度的加深，種子活力不斷下降，不同組織的DNA甲基化狀態(tài)和水平是不同的，表明老化種子的DNA甲基化在時間和空間上具有差異性[34]。

2 種子老化的組學(xué)研究

在種子老化領(lǐng)域，組學(xué)研究多集中在使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)的手段尋找種子老化相關(guān)基因、蛋白或生物學(xué)過程。

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的第一步，同時受內(nèi)源和外源因子的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，反映的是生物的特定器官、組織在特定的發(fā)育、生理狀態(tài)下所有基因的表達(dá)水平，因此，可以用轉(zhuǎn)錄組來比較不同組織或不同生理條件下基因水平的表達(dá)差異，從而研究生理功能相關(guān)的基因。然而，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也有一定的局限性，轉(zhuǎn)錄豐度與基因表達(dá)的最終產(chǎn)物的含量或者活性之間沒有必然的關(guān)聯(lián)，還存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程。目前，各種轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)已應(yīng)用到生命科學(xué)研究的很多領(lǐng)域，種子老化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也有報道。對豌豆(Pisumsativum)種子進(jìn)行人工老化，使用基因芯片技術(shù)比較正常種子與不同老化時間(8，12，15 d)種子的轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)差異，結(jié)果表明，在種子老化的過程中，共有717個差異表達(dá)的基因，其中330個上調(diào)，387個下調(diào)，并且在15 d時差異表達(dá)的基因相對較多，這些基因多與蛋白翻譯后加工、翻轉(zhuǎn)，核糖體結(jié)構(gòu)等相關(guān)，分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組重編程能夠影響細(xì)胞程序性死亡的進(jìn)程，并降低抗氧化能力，最終種子生活力下降[35]。將玉米種子人工劣變處理72 h，利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)共篩選出人工劣變玉米種胚差異表達(dá)的基因4 713個，其中上調(diào)表達(dá)2 874個，下調(diào)表達(dá)1 839個，這些基因多涉及能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激響應(yīng)和衰老死亡等過程，分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化的基因主要是糖酵解途徑受到抑制，導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生和積累，最終使種子喪失活力[36]。同時，采用cDNA-AFLP分析玉米種子老化相關(guān)基因也獲得了類似的結(jié)果[37]。低溫儲藏通常有利于正常種子壽命的延長，但是對于頑拗型種子，研究結(jié)果很不一致，采用cDNA-AFLP對茶樹(Camelliasinensis)種子在低溫儲藏過程差異表達(dá)基因研究中，獲得了132條差異基因片段，對其中15條克隆測序，獲得8條差異片段，有6條基因與已知功能基因相關(guān)，分別是金屬蛋白、老化蛋白、蛋白激酶、人類表皮生長因子、核酸和蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、水稻編碼假設(shè)蛋白[38]。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組(proteome)為一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，即某個生物個體、器官、組織或細(xì)胞在特定條件下所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[39]。根據(jù)不同的研究目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(expression proteomics)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(structural proteomics)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functional proteomics)[40]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在種子老化領(lǐng)域的應(yīng)用還處于起步階段，但其重要性不容忽視，現(xiàn)階段已有一些研究人員涉及該領(lǐng)域。如，使用2-DE和iTRAQ兩種方法比較耐貯藏品種和不耐貯藏品種水稻種胚的差異蛋白，同時將兩種水稻進(jìn)行貯藏，比較貯藏前后的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)了與水稻種子貯藏相關(guān)的蛋白，包括LEA蛋白、DNA損傷修復(fù)蛋白、Cupin家族蛋白、谷氧還蛋白和類萌發(fā)素蛋白[41]。而另有報道稱，含有VHS、ENTH和ANTH結(jié)構(gòu)域蛋白的上調(diào)表達(dá)與異戊烯轉(zhuǎn)移酶蛋白的下調(diào)表達(dá)可能同水稻種子的快速老化有關(guān)[42]。對人工老化玉米種子的種胚進(jìn)行差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)有差異的蛋白分別與防御、蛋白質(zhì)定位和貯藏、轉(zhuǎn)錄、合成代謝、能量、細(xì)胞生長和分裂相關(guān)[43]。白楊(Populustomentosa)種子老化后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析也取得了類似的結(jié)果，表達(dá)有顯著性差異的蛋白多與代謝、蛋白合成、能量、細(xì)胞防御、儲藏蛋白相關(guān)[44]。從細(xì)胞器水平上看，線粒體是種子老化過程中產(chǎn)生ROS的主要場所，種子老化時首先出現(xiàn)線粒體的損傷[45-46]，也有研究認(rèn)為，可以利用線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究種子線粒體與老化的關(guān)系[47]。

3 種子老化相關(guān)基因功能鑒定

現(xiàn)階段對基因功能的鑒定，通常采取過量、減弱或終止某一基因的表達(dá)，觀察生物體的功能變化，推測該基因的功能?；蚬δ荑b定技術(shù)一般可以分為轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technology)、基因敲除技術(shù)(gene knockout technology)和基因沉默技術(shù)(gene silencing technology)，基因沉默技術(shù)主要包括反義技術(shù)(antisense technology)和RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)。

脂質(zhì)過氧化是種子老化劣變的主要原因，脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是脂類氧化過程中的關(guān)鍵酶，催化膜脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，主要底物是亞油酸和亞麻酸，導(dǎo)致膜脂過氧化。LOX有很多種同工酶，是一個龐大的基因家族，不同的基因亞型在植物組織中的分布和作用也不相同，近年來，許多研究致力于尋找與種子老化相關(guān)的基因亞型。Dipak等[48]首先利用RNAi技術(shù)證明了OsLOX1基因表達(dá)減少可以使人工老化的水稻種子保持活性，在一定程度上抑制了老化進(jìn)程，之后又發(fā)現(xiàn)OsLOX1基因表達(dá)降低可以抑制種子儲藏過程中類胡蘿卜素的降解[49]。黃浩雪[50]從水稻中克隆了OsLOX2基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了OsLOX2基因過表達(dá)水稻及兩種干擾的轉(zhuǎn)基因水稻(hpRNAi20-1和hpRNAi25-4)，過表達(dá)株系OsLOX2的表達(dá)量大約是野生型的2倍，hpRNAi20-1中OsLOX2的表達(dá)量是野生型的29%，hpRNAi25-4中OsLOX2的表達(dá)量是野生型的5%，將這些轉(zhuǎn)基因水稻的種子進(jìn)行人工加速老化，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株的種子發(fā)芽率比野生型顯著降低，而在干擾株系中，hpRNAi20-1的發(fā)芽率比野生型高，hpRNAi25-4的發(fā)芽率比野生型低，說明一定程度降低OsLOX2的表達(dá)可以抑制種子老化，延長種子的壽命。Bai等[51]利用RNAi技術(shù)得到的OsLOX3基因敲減的轉(zhuǎn)基因水稻株系，人工老化后，其種子的發(fā)芽率比野生型高，但表型沒有明顯差異，說明OsLOX3基因表達(dá)降低可以有效抑制種子老化。磷脂酶D(phospholipase D, PLD)能夠?qū)⒛ぶ械牧字到?，參與種子儲藏過程中膜的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除或敲減擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPLDa1基因，抑制PLD的表達(dá)，可以有效提高儲藏后的種子的發(fā)芽率和油脂穩(wěn)定性，且AtPLDa1基因敲減的種子比AtPLDa1基因敲除的種子更耐儲藏，表明適當(dāng)降低AtPLDa1的表達(dá)可以提高種子的耐貯藏能力[52]。

種子貯藏過程中產(chǎn)生的活性氧ROS對基因組的損傷是導(dǎo)致種子老化劣變的重要原因之一，其中一個顯著的DNA損傷是產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤核苷(7,8-dihydro-8-oxoguanine, 8-oxo-G)，8-oxo-G可以在DNA復(fù)制過程中將胞嘧啶替換為腺嘌呤，使GC堿基對轉(zhuǎn)變?yōu)锳T堿基對，而擬南芥中的DNA糖苷酶基因AOGG1能夠參與堿基對修復(fù)，清除8-oxo-G。AtOGG1定位于細(xì)胞核，過量表達(dá)AtOGG1的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中，8-oxo-G含量較野生型少，人工控制劣變后轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率較野生型高，說明AtOGG1通過清除8-oxo-G參與堿基對修復(fù)(圖1)，提高了種子壽命[53]。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]是參與DNA修復(fù)的核蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中存在3種PARP基因亞型，其中AtPARP3在種子中表達(dá)最多，他們通過T-DNA插入的方法得到了缺乏AtPARP3的擬南芥突變體植株，進(jìn)行人工控制劣變后，突變體植株的種子較野生型種子發(fā)芽延遲，對不利的儲藏條件更敏感[54]，說明AtPARP3對種子貯藏和活力非常重要。

ROS主要包括O2-和H2O2，其清除機制是種子老化研究的熱點領(lǐng)域。細(xì)胞內(nèi)清除ROS的系統(tǒng)包括酶促系統(tǒng)[過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等]以及一些生物抗氧化劑(類胡蘿卜素家族、維生素E類、抗壞血酸、谷胱甘肽和硫氧還蛋白Trx等)。SOD和APX是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(圖2)中的關(guān)鍵酶，SOD可以催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2[55]；隨后，H2O2在APX的催化作用下，與細(xì)胞內(nèi)的一種重要自由基清除劑抗壞血酸AsA相互作用，生成H2O[56-57]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到過表達(dá)CuZnSOD和APX的煙草(Nicotianatabacum)種子，將其與非轉(zhuǎn)基因煙草種子在室溫、干燥的條件下儲藏兩年后發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)基因種子相比，轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率較高，相對電導(dǎo)率較低[58]，說明過表達(dá)CuZnSOD和APX有利于煙草種子長期儲藏。Trx是參與植物抗氧化脅迫的關(guān)鍵蛋白[59]，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將源自藍(lán)色黑鴨草(Phalariscoerulescens)的硫氧還蛋白S基因TrxS導(dǎo)入啤酒大麥(Hordeumvulgare)，得到過表達(dá)TrxS的轉(zhuǎn)基因株系[60]。將優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品系Y002和非轉(zhuǎn)基因大麥種子進(jìn)行人工老化，與非轉(zhuǎn)基因種子相比，轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的降低速率較慢，丙二醛、羰基含量和相對電導(dǎo)率等較低，抗氧化酶CAT和POD活性高[61]，說明TrxS過表達(dá)能增強轉(zhuǎn)基因大麥種子的抗老化能力。

圖1 AtOGG1參與DNA損傷修復(fù)的途徑Fig. 1 Pathway of AtOGG1 participating in DNA damage repair

注：ROS,活性氧;8-oxo-G,8氧鳥嘌呤核苷;A,腺嘌呤;T,胸腺嘧啶;C,胞嘧啶;G,鳥嘌呤。

Note：ROS, reactive oxygen species; 8-oxo-G, 7,8-dihydro-8-oxoguanine; A, adenine; T, thymine; C, cytosine; G, guanine.

圖2 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)Fig. 2 The ascorbic acid-glutathione cycle

注：SOD,超氧化物歧化酶;APX,抗壞血酸過氧化物酶; MDHAR,單脫氫抗壞血酸還原酶; DHAR,脫氫抗壞血酸還原酶; GR,谷胱甘肽還原酶;AsA,抗壞血酸;MDHA,單脫氫抗壞血酸; DHA,脫氫抗壞血酸; GSH,還原型谷胱甘肽;GSSG,氧化性型谷胱甘肽;NADPH,還原型輔酶Ⅱ;NADP+,氧化型輔酶Ⅱ.

Note：SOD,superoxide dismutase;APX,ascorbate peroxidase;MDHAR,monodehydroascorbate reductase; DHAR, dehydroascorbate reductase; GR, glutathione reductase; AsA, ascorbic acid; MDHA, monodehydroascorbic acid; DHA, dehydroascorbic acid; GSH, glutathione; GSSG, glutathione oxidized; NADPH, reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NADP+, nicotinamideadeninedinucleotide phosphate.

熱激蛋白(heat shock proteins,HSP)是植物在高于其正常生長溫度的條件下合成的新蛋白質(zhì)，與植物的高溫等非生物脅迫關(guān)系密切，近年來有研究涉及熱激蛋白與種子老化的關(guān)系。分離自蓮(Nelumbonucifera)的一個小熱激蛋白基因NnHSP17.5在擬南芥中異源過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人工加速老化后，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子較野生型發(fā)芽率高，且SOD活性較高，證明了NnHSP17.5過表達(dá)有利于提高種子的抗老化能力，在種子老化過程中起到了一定程度的抑制作用[62]。還有研究利用轉(zhuǎn)基因煙草證明了向日葵(Helianthusannuus)熱激轉(zhuǎn)錄因子HaHSFA9能夠提高小熱激蛋白的含量，提高種子活力[63]。

4 展望

種子在貯藏過程中發(fā)生老化是不可避免的，引起種子老化的原因有很多，國內(nèi)外學(xué)者就此開展了大量的研究工作，但仍舊沒有從根本上揭示種子老化的機理。雖然分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于種子老化研究領(lǐng)域的時間較晚，但已經(jīng)十分活躍，也取得了不小的進(jìn)展，其中有關(guān)于遺傳完整性的研究，也尋找到了一些老化相關(guān)基因，有待于進(jìn)一步的鑒定和性狀改良?；诂F(xiàn)有的研究情況和存在的問題，關(guān)于種子老化機制的研究，可關(guān)注以下幾個方面。

1)以往的研究多集中在活性氧自由基和一些老化相關(guān)酶的含量變化上，以后可以加強對相關(guān)蛋白或mRNA定位的研究，在組織水平或亞細(xì)胞水平研究種子老化的部位和軌跡。

2)已有一些組學(xué)研究初步找出了種子老化相關(guān)基因，其中僅有小部分基因的功能已經(jīng)得到驗證，但大多數(shù)基因仍有待于深入研究，利用轉(zhuǎn)基因等手段不僅可以在更深層次探究種子老化的機理，而且有可能延長種子壽命。

3) 種子老化相關(guān)基因的功能得到驗證后，需要進(jìn)一步研究其調(diào)控機理以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，整合形成一個完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解釋種子老化的機制，并找出更多解決種子老化的辦法。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Advances in the molecular biology study of seed aging

Cheng Hang, Chen Ling-ling, Xia Fang-shan, Yan Hui-fang, Mao Pei-sheng

(College of Animal Science and Technology, China Agricultural University;Beijing Key Laboratory of Grassland Science, Beijing 100193, China)

It is necessary to develop the agricultural production of seeds which are considered as basic materials. However, seed aging leads to a decline in seed quality and ultimately to the loss of seed vitality, which causes huge economic losses in agricultural production. Thus, it is very important to conduct research on the aging mechanism, in order to identify suitable methods to control seed aging. Currently, most studies on seed aging focus on physiological and biochemical changes. It is possible to accurately determine the aging mechanism by using the techniques of molecular biotechnology, which are rapidly developing. This paper summarizes the achievements of molecular biology studies on seed aging. The genetic integrity of seeds was found to be lower after aging. Genes related to energy metabolism, signal transduction, stimulus-response, and the glycolytic pathway, among others, were differentially expressed after seed aging. Some genes that participate in lipid peroxidation and repair of DNA damage were identified. Developing trends in the study of the seed aging mechanism are also discussed. Localization of proteins and mRNAs, gene function analysis, and characterization of the signal transduction pathways will be important areas of focus in the future.

seed aging; molecular marker; transcriptomics; proteomics; gene function identification; reactive oxygen species; lipid peroxidation

Mao Pei-sheng E-mail:maops@cau.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0148

2016-03-24 接受日期：2016-06-28

國家自然科學(xué)基金項目——燕麥劣變種子線粒體AsA-GSH循環(huán)抗氧化機制與差異蛋白表達(dá)(31572454)；草業(yè)科學(xué)北京市重點實驗室北京市共建項目“老芒麥種子劣變的氧化生理及熱激蛋白的差異表達(dá)”

程航(1992-)，女，河南新縣人，在讀博士生，研究方向為牧草育種與良種繁育。E-mail:chenghang0522@126.com

毛培勝(1970-)，男，內(nèi)蒙古錫林浩特人，教授，博士，研究方向為牧草種子生理與良種繁育。E-mail:maops@cau.edu.cn

S330.2;Q943.2

A

1001-0629(2017)1-0129-09*

程航，陳玲玲，夏方山，閆慧芳，毛培勝.種子老化的分子生物學(xué)研究.草業(yè)科學(xué),2017,34(1)：129-137.

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