漆酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展

李晨歌

(隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽745000)

漆酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展

李晨歌

(隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽745000)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在造紙、食品、環(huán)境治理以及生物能源等方面有廣泛的應(yīng)用。介紹了漆酶的結(jié)構(gòu)特征、催化機(jī)制、活性影響等因素，討論了其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用狀況，并展望了漆酶的應(yīng)用前景。

微生物漆酶；異源表達(dá)；工業(yè)化生產(chǎn)；細(xì)菌漆酶

漆酶(laccase，ECl．10．3．2)是一種含銅的多酚氧化酶(polyphenol oxidases，PPO)，被抗壞血酸、胺類、O2催化酚類等物質(zhì)氧化后，最終生成相應(yīng)的產(chǎn)物與水。過氧化物酶、酪氨酸酶等與漆酶協(xié)同組成了酚類氧化酶群體，廣泛存在于自然界中。同時(shí)，血漿銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin)、抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)、漆酶(Laccase)等多種類型的酶，均是藍(lán)色多銅氧化酶家族的成員之一[1]。

人們在研究中發(fā)現(xiàn)漆酶不僅存在于高等植物中[2]，同時(shí)在微生物中也廣泛地存在?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌中的白腐菌[3]是最重要的生產(chǎn)者。Alexandre[4]等人對細(xì)菌基因組和蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同質(zhì)性研究分析，發(fā)現(xiàn)原核生物中也有漆酶的存在。

1 微生物漆酶的分布及其生理功能

微生物漆酶在自然界中大量存在，大量落葉覆蓋的林區(qū)土壤中，污水處理廠周圍的活性泥污中，河流及葡萄酒酒廠中的污水，水稻等作物的根部，被有機(jī)物垃圾、有機(jī)染料、石油污染的土壤、海洋，紡織廠的工業(yè)廢水和造紙廠的木質(zhì)纖維廢水等等。

目前，真菌漆酶中的擔(dān)子菌和子囊菌是人們集中研究的熱點(diǎn)，而擔(dān)子菌中的白腐菌是目前原核和真核微生物中所知的唯一能夠自身利用氧化酶系統(tǒng)將纖維木質(zhì)素降解為二氧化碳的一種真菌。此外，真菌漆酶也是部分致病真菌的毒性成分之一，在真菌的分化、色素的形成中發(fā)揮著重要的作用。與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶反應(yīng)條件及動(dòng)力學(xué)特征截然不同，其反應(yīng)速度相比會(huì)變得很慢，銅離子被認(rèn)為是一個(gè)必要因素，因此細(xì)菌漆酶通常被稱為“多銅氧化酶”或“多酚氧化酶”，時(shí)常也被定義為漆酶類似物(1accase-like)。

2 漆酶的結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)制

大量的研究表明，真菌漆酶和細(xì)菌漆酶均是以單蛋白體形式存在的糖蛋白，通常情況下這些蛋白的分子量相差較大，而且糖基化的程度也存在差異，可是真菌漆酶與細(xì)菌漆酶的蛋白結(jié)構(gòu)大體相似，均為球狀結(jié)構(gòu)，分別由三個(gè)杯狀(cupredoxin-like)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，且每個(gè)結(jié)構(gòu)域中都含有β的圓桶狀結(jié)構(gòu)。

鈔亞鵬，錢世鈞[5]等人依據(jù)對漆酶晶體衍射、動(dòng)力學(xué)和光譜學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，一般漆酶蛋白結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)銅原子(圖1)，這4個(gè)Cu2+共同構(gòu)成了漆酶催化反應(yīng)中的活性中心。這4個(gè)銅離子有三種形式存在，即T1Cu銅原子，T2Cu銅原子和T3Cu銅原子。T1Cu銅原子的周圍由一個(gè)半胱氨酸和組氨酸構(gòu)成，T1Cu銅電子在順磁共振光譜(Electronic Paramagnet Resonance，EPR)的可見光區(qū)顯示4條電子轉(zhuǎn)移條帶，其中由Cys→T1Cu出現(xiàn)的條帶亮度最大，這是漆酶顯示藍(lán)色的主要原因。T2Cu是由兩分子的咪唑和一分子的水配位形成的一種四面體幾何構(gòu)型。人們發(fā)現(xiàn)EPR光譜中含有極寬的超精細(xì)裂分。TCu3a，TCu3b與一個(gè)氫氧化物分子和三個(gè)組氨酸分子一起共同構(gòu)成一種受阻的四面體幾何構(gòu)型，氫氧化物做為橋?qū)蓚€(gè)Cu2+連在一起。由于Cu-Cu共價(jià)體可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的反鐵磁性的特性，因此很難檢測到EPR光譜信號。

圖1 漆酶13H9的結(jié)構(gòu)

漆酶催化各種底物的反應(yīng)方式可能如下：首先，反應(yīng)底物與處于酶活性中心的T1Cu銅原子位點(diǎn)相結(jié)合，且經(jīng)過Cys-His途徑將底物-T1Cu銅原子傳遞到由T2Cu和T3Cu結(jié)合構(gòu)成的三核位點(diǎn)上，該三核位點(diǎn)接著將電子傳遞給已結(jié)合在活性中心的第二底物氧分子上，最終還原產(chǎn)生水。在整個(gè)反應(yīng)過程中，漆酶的充分還原需要有連續(xù)不斷的單電子氧化作用來滿足。此時(shí)，處于還原態(tài)的酶分子再通過將四個(gè)電子轉(zhuǎn)移傳遞給分子氧，最終氧化反應(yīng)生成水。因此漆酶又被稱為分子電池。

3 微生物漆酶活性的影響因素

3.1 pH值

一般情況下，每種漆酶氧化底物的時(shí)侯，都會(huì)有一個(gè)特定的pH值區(qū)間。且不同的氧化底物則所測到的pH值區(qū)間也不同，這可能是不同的底物參與了改變漆酶活性中心周圍酸堿基團(tuán)離解狀態(tài)的原因。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)pH值的浮動(dòng)變化會(huì)不同程度地影響漆酶的可逆變性，一旦超過一定的pH值區(qū)間范圍，漆酶則會(huì)不可逆地失活，使漆酶的催化活性受到影響。一般情況，真菌漆酶與細(xì)菌漆酶的pH值范圍存在差異，且真菌漆酶的pH值范圍偏向酸性，細(xì)菌漆酶則偏向中性和堿性，從而細(xì)菌漆酶更偏向應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)。同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)不同種屬的漆酶其pH值范圍也不同，且漆酶反應(yīng)中，作用底物不同其最適pH值也不同。Chunjuan Gu[6]等人從Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，通過不同的底物ABTS，愈創(chuàng)木酚，2，6-二甲氧基苯酚，丁香醛連氮，分別測得最適反應(yīng)pH值分別為3.0、5.0、5.0、6.0和3.0、5.0、5.0、6.2。

3.2 溫度

漆酶的酶促反應(yīng)中，溫度是影響漆酶活性的關(guān)鍵因子之一。一般情況下，剛開始反應(yīng)時(shí)，酶促反應(yīng)的速率會(huì)隨溫度的升高而增大，當(dāng)達(dá)到一定值后則會(huì)隨溫度升高而逐漸降低，甚至失活。通常，真菌漆酶的熱穩(wěn)定性不強(qiáng)，50℃下反應(yīng)數(shù)分鐘后其活性喪失。學(xué)者Jordan等人從嗜熱白腐菌菌株中獲得一株在60℃的條件下反應(yīng)9h仍保持完整酶活的耐高溫漆酶菌株。然而，細(xì)菌漆酶的熱穩(wěn)定性則顯著高于真菌漆酶，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的余小霞[7]等人發(fā)現(xiàn)漆酶CotA在60℃保溫90min后仍有71.70%的剩余酶活。

3.3 金屬離子

大多數(shù)金屬離子(Cu2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Hg+、Zn2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、AI3+、Fe3+、Pt4+)不同程度地影響漆酶的活性。大量報(bào)道稱，一定濃度的Cu2+可以促進(jìn)漆酶的活性，而裴佐蒂[8]通過對灰蓋鬼傘漆酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Cu2+不能促進(jìn)重組漆酶，反而在10mM時(shí)抑制重組漆酶的活性。我們在研究漆酶Lac13H9的酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同終濃度的銅離子(0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)，對漆酶的剩余酶活分別為110%、200%、100%、42%、38%、35%、30%，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。這也可能是因?yàn)椴煌钠崦附Y(jié)構(gòu)所需要Cu2+的濃度閾值有關(guān)。Matthias Gunne[9]等人研究不同的漆酶自身所含有的銅離子個(gè)數(shù)不一樣，從1～9不等，當(dāng)外源銅離子在一定的閾值范圍內(nèi)，則促進(jìn)酶的活力，超過一定的范圍則對漆酶的反應(yīng)不敏感，甚至起抑制作用。

也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，由于漆酶自身構(gòu)造上的差異，同一種金屬離子對不同的漆酶表現(xiàn)不同的作用，如K+對大多數(shù)漆酶有激活作用，但對漆酶CotA有較強(qiáng)的抑制作用；Cu2+是大多數(shù)漆酶的激活劑，但對灰蓋傘菌漆酶(Coprinopsiscinerea)則表現(xiàn)出了一定的抑制作用。

4 微生物漆酶基因的克隆

目前，報(bào)道克隆得到的漆酶基因有60余種，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些漆酶得到了表達(dá)，部分已經(jīng)克隆到的漆酶基因如表1所示。

5 漆酶基因的重組表達(dá)

由于漆酶的本身性質(zhì)，很難實(shí)現(xiàn)表達(dá)，且表達(dá)量很低。近年來，漆酶在不同的宿主菌中通過異源表達(dá)來提高表達(dá)量，部分有關(guān)原菌株和表達(dá)宿主的相關(guān)數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 已克隆到的漆酶基因

表2 漆酶基因的重組表達(dá)

6 漆酶的工業(yè)化應(yīng)用

6.1 環(huán)境保護(hù)

目前，有機(jī)農(nóng)藥的使用和大量印刷廠的廢水已成為當(dāng)前工業(yè)領(lǐng)域最重要的水體污染之一。有報(bào)道稱漆酶可以在一定程度上對染料進(jìn)行脫色降解。北京大學(xué)陳輝[10]等人在對漆酶催化氯酚類有機(jī)物的降解研究結(jié)果表明，漆酶可以不同程度地對三種氯酚類有機(jī)物(2，4-二氯酚、4-氯酚和2-氯酚)進(jìn)行降解，降解率分別為94%、75%和69%，由此可見漆酶的確對氯酚類有機(jī)物有不同程度的降解作用。武漢科技大學(xué)任大軍等人對漆酶在共基質(zhì)體系下吲哚的去除進(jìn)行了大量研究后發(fā)現(xiàn)，在含有苯酚的反應(yīng)體系中，漆酶去除吲哚的效果更加顯著，并且發(fā)現(xiàn)漆酶在去除共基質(zhì)中的吲哚和苯酚的同時(shí)，苯酚的存在也進(jìn)一步促進(jìn)漆酶對吲哚的去除，兩者相互協(xié)調(diào)共同作用。Chunjuan Gu[11]等人從Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，發(fā)現(xiàn)對13種不同的有機(jī)染料均有不同程度的降解，且Lac3的降解率均略高于Lac4。同時(shí)，我們又在降解體系中加入中介體HBT與未加中介體的對照，發(fā)現(xiàn)加入中介體HBT的降解率均明顯高于未加中介體的，甚至有些降解率提高到了98%；將細(xì)菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac 3協(xié)同作用一起研究對染料孔雀石綠(MG)的降解作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)僅有細(xì)菌漆酶Lac13H9參與降解染料12h后，降解率幾乎僅有5%左右；而在細(xì)菌漆酶Lac13H9的基礎(chǔ)上加入中介體HBT時(shí)，降解率為40%；將細(xì)菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac3混合不加中介體，12 h的染料降解率為70%，而在兩種漆酶混合的基礎(chǔ)上加入中介體HBT時(shí)，其降解率在12h后為94%，因此將細(xì)菌漆酶和真菌漆酶一起協(xié)同作用的基礎(chǔ)上，添加中介體是高效降解染料的一種新的研究趨勢。

6.2 造紙工業(yè)

通過漆酶參與的生物制漿工藝與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，在降低能耗大和節(jié)約設(shè)備的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步避免了傳統(tǒng)化學(xué)方法降解木質(zhì)素時(shí)不夠徹底的問題。與此同時(shí)用漆酶進(jìn)行的生物制漿也避免了傳統(tǒng)的氯法漂白產(chǎn)生廢水污染和漂白后的紙張極易反彈等一系列的弊端現(xiàn)象，顯著調(diào)高了紙張的質(zhì)量和強(qiáng)度。

由于漆酶自身含有可以通過氧化作用降解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)域，因此在生物制漿、木質(zhì)纖維素污染的環(huán)境治理等方面均有潛在的商業(yè)價(jià)值。在整個(gè)木質(zhì)素的降解中，細(xì)菌和真菌相互協(xié)同作用發(fā)揮降解作用。首先，細(xì)菌介入初期的降解反應(yīng)，在木質(zhì)素降解早期，經(jīng)過自身初級代謝產(chǎn)物作用于木質(zhì)纖維物質(zhì)，從而使其發(fā)生改性，接著真菌漆酶參與后續(xù)的降解工作，通過自身的高氧化還原電勢的作用，開始高效地分解木質(zhì)纖維素。由于漆酶的氧化還原電勢一般較低的原因，一方面Jausovec[12]等人通過在漆酶的結(jié)構(gòu)中引入羧基和醛基基團(tuán)來改善漆酶的電勢，為更好地氧化纖維素做了基礎(chǔ)的研究；另外，在反應(yīng)體系中常常需要加入少許低分子質(zhì)量的化合物作為中介體參與反應(yīng)，常見的有ABTS、HBT等。這些中介體在氧化還原過程中起到傳遞電子的作用，從而使木質(zhì)素聚合或降解。在當(dāng)前的研究中發(fā)現(xiàn)，漆酶有效介體中除典型的HBT和ABTS外，鹽酸異丙嗪(PTC)、2-亞硝基-1-萘酚-4-磺酸(HNNS)、N-羥基乙酰苯胺(NHA)等含有-NO、-NOH基團(tuán)的化合物也是漆酶的有效介體[13,14]，可是中介體的價(jià)格問題一直是困擾工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，今后還需要尋找價(jià)格低廉的中介體以利于大量的工業(yè)化生產(chǎn)。Fernandez[15]等人通過商業(yè)漆酶的治療，實(shí)現(xiàn)了漆酶在商業(yè)貼面板方面的應(yīng)用。疏水化合物(沒食子酸月桂醇酯)通過一個(gè)商業(yè)漆酶酶治療，只有當(dāng)漆酶存在于木材治療時(shí)可以更好地增加木材的疏水化作用，從而增加木材表面的疏水性，實(shí)現(xiàn)了與疏水化合物沒食子酸月桂醇酯更好的結(jié)合，有助于改善木材表面疏水性的永久性。

6.3 食品工業(yè)

在食品工業(yè)中，漆酶的研究涉及到各種果汁、葡萄酒、啤酒等的生產(chǎn)、釀造等多個(gè)領(lǐng)域。因?yàn)楣?、酒類中含有芳胺類或酚物質(zhì)，因此在其儲(chǔ)存期通常會(huì)出現(xiàn)渾濁、沉淀的現(xiàn)象。由于漆酶具有降解酚類有機(jī)物的特性，麥芽汁經(jīng)過漆酶適當(dāng)?shù)奶幚砗?，其中的酚被氧化，則有助于提高果汁及酒類的透明度和口感質(zhì)量。啤酒和葡萄酒通過經(jīng)固定化酶的處理，將酚類等物質(zhì)除去，從而能夠長期地儲(chǔ)存并長久保持澄清狀態(tài)。同時(shí)王歲樓[16]等研究發(fā)現(xiàn)，漆酶在加速食藥用菌制種過程中的木質(zhì)素的分解方面也有應(yīng)用。

6.4 紡織工業(yè)

在紡織工業(yè)中，漆酶已經(jīng)顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Α８鶕?jù)漆酶對染料降解的原理,在紡織染整方面主要用于染色織物上浮色的生物酶洗、牛仔服裝的仿舊整理、印染廢水的脫色和棉織物的生物漂白。固定化的漆酶酶洗工藝可以替代傳統(tǒng)的皂洗工藝,有效去除純棉針織染色后表面浮色，從而提高織物的濕處理牢度，并進(jìn)一步降低后處理殘液的色度，大大減輕印染廢水處理的負(fù)擔(dān)，有利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)[17]。

6.4 生物技術(shù)領(lǐng)域

在生物監(jiān)測方面，主要體現(xiàn)在免疫檢測和生物傳感器兩個(gè)方面。免疫檢測過程中，漆酶可能將替代辣根過氧化物作為新的標(biāo)記酶。Ghindilis[18]等人依據(jù)漆酶在催化反應(yīng)過程中能夠消耗O2轉(zhuǎn)化產(chǎn)生電信號，而該信號又容易被高靈敏檢測的機(jī)理，通過運(yùn)用DEAE-纖維素固定漆酶，制成不同類型的高活力的穩(wěn)定器，用來監(jiān)測監(jiān)視茶葉中茶酚的情況，并且這種類型的高靈敏度傳感器可以被用來對來自石油、煤炭、天然氣，頁巖氣等工業(yè)中酚類等物質(zhì)的監(jiān)測。Babadostu[19]等人對漆酶的固定化作用進(jìn)行大量的分析研究，通過利用漆酶的固定化與納米磁石的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了精確檢測酚類化合物的前景。

在指示劑方面，由于漆酶在催化反應(yīng)的過程當(dāng)中可以形成有色產(chǎn)物，如ABTS氧化時(shí)可產(chǎn)生從淺綠到深綠的不同有色產(chǎn)物，因此可以制造滲漏指示劑和保鮮指示劑。

在生物能源方面，主要利用漆酶作為催化劑，將燃料的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能從而制造生物燃料電池。目前生物燃料電池仍然存在著工作壽命短的問題，還需大量細(xì)致地研究。Schubert[20]等人通過設(shè)計(jì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)和遺傳算法(GA)獲得更精確的的各項(xiàng)指標(biāo)來預(yù)測和改造以漆酶為中介體的氧化還原系統(tǒng)，這種系統(tǒng)可以在氧化生成碘方面進(jìn)行應(yīng)用，在工業(yè)化應(yīng)用方面具有潛在的價(jià)值。

漆酶還在有機(jī)物的合成，非抗體淄醇類藥物和抗癌藥物的生產(chǎn)，樹脂材料[21]等方面均有著廣闊的潛在應(yīng)用前景。

7 結(jié)語

迄今為止，漆酶的發(fā)現(xiàn)歷史已有140多年，經(jīng)過各國科學(xué)家的不懈努力，漆酶的研究工作已取得重要的進(jìn)展，生化研究、三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等都有了進(jìn)一步的研究。目前已有60余種漆酶的基因被克隆并獲得進(jìn)一步分析，其中一些已實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。但是依舊存在很多的難題亟待解決，一方面漆酶異源表達(dá)調(diào)控的相關(guān)機(jī)理研究還未突破，另一方面，距離漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還需要時(shí)間?？梢灶A(yù)見，今后一段時(shí)期的工作主要集中在探索研究漆酶新的表達(dá)途徑以及選擇新的表達(dá)宿主，并且通過基因敲除、誘變等基因工程技術(shù)尋找高表達(dá)，并且能夠應(yīng)用于大量工業(yè)化生產(chǎn)的漆酶菌株上。

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【責(zé)任編輯 趙建萍】

Research Progress in Laccase and Its Application

LI Chen-ge

(CollegeofAgricultureandForestry,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu)

Laccase is a kind of polyphenol oxidase containing copper, which is widely used in paper making, food, environmental management, biological energy and other industries. The present paper introduces the structural characteristics, catalytic mechanism, active influence and other factors of laccase, discusses its application of industrial production and forecasts its future applications.

microbial laccase; recombinant expression; industrialized production; bacterial laccase

1674-1730(2017)01-0062-05

2016-02-23

李晨歌(1989—)，女，甘肅慶陽人，助教，碩士，主要從事植物保護(hù)及生物方向研究。

Q814

A