PP2A對轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響*

趙 哲，劉 莉，劉 琨，姚 平，汪茂榮

湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院血液內(nèi)科，恩施 445000

PP2A對轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響*

趙 哲，劉 莉，劉 琨，姚 平△，汪茂榮

湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院血液內(nèi)科，恩施 445000

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞凋亡的效應(yīng)及機制。方法 采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激Raji細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測0、24、48、72 h細(xì)胞凋亡情況；定量PCR法檢測Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3 mRNA表達(dá)；Western blot法檢測Bcl-2，Bcl-xl以及Caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2磷酸化情況；蛋白磷酸酶活性測定體系檢測TGF-β1刺激下蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性變化；觀察不同濃度PP2A抑制劑岡田酸(okadaic acid，OA)對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果 5 ng/mL TGF-β1刺激24、48、72 h后細(xì)胞凋亡率分別為(29±3)%、(47±4)%、(60±5)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時，隨著刺激時間延長，Bcl-2、Bcl-xl mRNA和蛋白表達(dá)逐漸降低，Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；ERK1/2總蛋白表達(dá)無顯著差異，其磷酸化狀態(tài)p-ERK1/2隨TGF-β1刺激時間的延長逐漸減少；PP2A活性在TGF-β1干預(yù)15 min后開始升高，1 h達(dá)峰值；100、200 nmol/L的OA分別預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率明顯下降，TGF-β1組為(60±5)%，干預(yù)組分別為(32±4)%、(24±3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論 TGF-β1可能通過活化PP2A、抑制ERK1/2通路相關(guān)基因的表達(dá)而誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡。

轉(zhuǎn)化生長因子β1； 伯基特淋巴瘤； 細(xì)胞凋亡； 蛋白磷酸酶2A

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種廣泛參與并調(diào)節(jié)機體細(xì)胞增殖、分化和凋亡等功能的重要細(xì)胞因子[1-2]。在腫瘤中，TGF-β1具有雙向調(diào)控作用，既能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，又能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。關(guān)于TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡和生長抑制作用已經(jīng)在多種細(xì)胞中得到驗證，包括人和小鼠淋巴細(xì)胞以及多種淋巴瘤細(xì)胞系[4]。由于淋巴瘤細(xì)胞本身可以產(chǎn)生TGF-β1，因此，多種淋巴惡性腫瘤細(xì)胞對內(nèi)源性TGF-β1敏感性降低。但是，通過外源性增加TGF-β1劑量仍然可以誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡[5]。然而，目前對于TGF-β1誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的機制仍不十分清楚。本研究以Raji細(xì)胞為研究對象，觀察TGF-β1誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡并探索其可能的誘導(dǎo)機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS，美國Gibco)，RT-PCR試劑盒(美國Fermentas)，PP2A磷酸酶活性檢測試劑盒(美國Promega)，人重組TGF-β1(美國Peprotech)，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，兔抗人Bcl-2(美國Abcam)、兔抗人Bcl-xl(美國BD)、兔抗人Caspase-3(美國R&D)、小鼠抗人GAPDH(美國Epitomic)、兔抗人磷酸化p-ERK1/2(美國CST)、兔抗人ERK1/2(美國CST)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG(美國Abcam),岡田酸(okadaic acid，OA，美國Sigma)。流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(美國Alpha FlurochemTM公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

Raji細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2、95%空氣濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液，每3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。在給予TGF-β1刺激前換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h使同步化。實驗分組：對照組(Control)、TGF-β1刺激組(24、48、72 h)、100 nmol/L OA+ TGF-β1刺激組、200 nmol/L OA+ TGF-β1刺激組。無血清培養(yǎng)同步化后，OA預(yù)處理1 h后再給予TGF-β1刺激。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

根據(jù)BD公司提供的Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心；然后用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并使其密度為(4～5)×105/mL，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC及2 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min，離心收集細(xì)胞，用500 μL結(jié)合緩沖液沖洗細(xì)胞1次，再次離心后用500 μL緩沖液重懸，以流式細(xì)胞儀檢測分析。每次實驗設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3mRNA表達(dá)

按照Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按以下條件進(jìn)行PCR。Bcl-2引物：上游5′-TCGCCCTGTGGATGACTGA-3′，下游5′-GCATCCCAGCCTCCGTTATC-3′，片段長度189 bp；Bcl-xl引物：上游5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，下游5′-TCCATCTCCGATTCAGTCCCT-3′，片段長度119 bp；Caspase-3引物：上游5′-GATTATCCTGA-GATGGGTTTATGTAT-3′，下游5′-ATCACGC-ATCAATTCCACAAT-3′，片段長度124 bp；β-actin引物：上游5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTA-CTCT-3′，下游5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCT-AGAA-3′，片段長度153 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、55℃30 s、72℃30 s，共32個循環(huán)，72℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用相對定量法2-ΔΔCt進(jìn)行定量分析。每次實驗設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)4次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

RIPA裂解并收集各組細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白20 g/孔，在含SDS-PAGE中電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶(1×TBST緩沖液配制)室溫封閉1 h，與一抗(Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、GAPDH、p-ERK1/2、ERK1/2)4℃孵育過夜。1×TBST洗膜(10 min×3次)，與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗37℃搖床孵育1 h。經(jīng)1×TBST洗滌3次后用ECL顯色曝光。

1.6 PP2A磷酸酶活性測定

采用Promega磷酸酶活性測定標(biāo)準(zhǔn)程序，Raji細(xì)胞經(jīng)TGF-β10、15、30、60 min，2、24、48、72 h刺激后采用磷酸酶存儲緩沖區(qū)收集蛋白，離心(100 000 g，4℃，1 h)；向核酸純化柱中加入10 mL G-25，自身重力排干，加入10 mL 冷磷酸酶存儲緩沖區(qū)洗滌核酸純化柱，自身重力排干，600 g、4℃、離心5 min；加250 μL蛋白樣品入核酸純化柱，用50 mL離心管接住，600 g、4℃、離心5 min；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取原液20 μL(濃度1 mmol/L)，用無磷水稀釋至200 μL，使磷酸鹽濃度50 μmol/L，共6個點，每孔加0、2、4、10、20、40 μL，用1×反應(yīng)緩沖液補齊至50 μL，每樣品孔加入5 μL磷酸肽+10 μL 5×反應(yīng)緩沖液+35 μL上清，37℃孵育30 min，每孔加50 μL鉬酸染料，加色法混合終止反應(yīng)，室溫孵育15 min后于630 nm波長處測吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和t檢驗。所有實驗均重復(fù)至少3次。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對Raji細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TGF-β1不同濃度及不同刺激時間下Raji細(xì)胞凋亡情況。1、5、10 ng/mL TGF-β1均能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡(均P<0.05)。和5 ng/mL濃度相比，10 ng/mL濃度的TGF-β1作用后凋亡細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，選擇5 ng/mL TGF-β1為凋亡誘導(dǎo)劑量(圖1A)。圖1B顯示，Raji細(xì)胞的凋亡率隨著TGF-β1作用時間的延長而增加，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

無TGF-β1刺激為對照組；與對照組比較，*P<0.05圖1 TGF-β1不同濃度和不同時間刺激下細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Cell apoptosis under stimulation with TGF-β1 of different concentrations and different time

2.2 TGF-β1對Raji細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3表達(dá)的影響

為了明確TGF-β1誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡效應(yīng)，我們檢測了TGF-β1處理前后細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-xl以及Caspase-3基因表達(dá)的變化趨勢。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，5 ng/mL TGF-β1作用于Raji細(xì)胞，Bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)水平隨著作用時間的延長而降低，具有時間依賴性(圖2A、2B)；而Caspase-3基因表達(dá)水平隨著作用時間的延長逐漸增加(圖2C)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果也表明，TGF-β1刺激后Raji細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl蛋白隨著刺激時間的延長表達(dá)逐漸下降，Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸增多(圖3)。

2.3 TGF-β1對Raji細(xì)胞ERK1/2總蛋白及其磷酸化水平的影響

Western blot檢測各組ERK1/2總蛋白水平，結(jié)果顯示，和對照組比較，TGF-β1刺激對ERK1/2總蛋白表達(dá)水平無明顯影響，而其磷酸化蛋白p-ERK1/2隨著刺激時間的延長表達(dá)逐漸下降(圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

與control組比較，*P<0.05圖2 TGF-β1對Raji細(xì)胞Bcl-2(A)、Bcl-xl(B)以及Caspase-3(C) mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of TGF-β1 on mRNA expression of Bcl-2(A)，Bcl-xl(B) and Caspase-3(C)

圖3 Western blot法檢測TGF-β1對Raji細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3以及ERK1/2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of TGF-β1 on protein expression of Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3 and ERK1/2 detected by Western blotting

2.4 TGF-β1誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過程中PP2A活性變化

TGF-β1刺激Raji細(xì)胞后，于不同刺激時間點收集細(xì)胞蛋白，觀察細(xì)胞總蛋白磷酸酶活性的改變。結(jié)果顯示，絲/蘇氨酸磷酸酶活性于刺激后15 min開始上升，1 h時達(dá)到峰值，隨后逐漸下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖4A)。采用PP2A特異性活性抑制劑OA預(yù)處理Raji細(xì)胞1 h后，給予TGF-β1刺激72 h，采用Western blot法檢測不同濃度OA干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bcl-xl以及Caspase-3蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，OA干預(yù)組與TGF-β1組相比，Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)顯著上調(diào)，而Caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)(圖4B)，并且隨著OA濃度的增加，干預(yù)效應(yīng)有增強趨勢。為進(jìn)一步明確OA的干預(yù)效應(yīng)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞百分率。如表1所示，Raji細(xì)胞自然凋亡率為(10±3)%，單純使用OA對細(xì)胞凋亡率無顯著影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；TGF-β1刺激可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其凋亡率為(60±5)%，和對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；采用100、200 nmol/L濃度OA預(yù)處理1 h后，可顯著抑制TGF-β1對Raji細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用，其凋亡率分別降至(32±4)%、(25±3)%，和TGF-β1組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

A:PP2A活性隨TGF-β1刺激時間變化；B:OA干預(yù)對TGF-β1刺激蛋白表達(dá)的影響；OA-1:100 nmol/L預(yù)處理1 h；OA-2:200 nmol/L預(yù)處理1 h；與刺激0min比較，*P<0.05圖4 PP2A在TGF-β1誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過程中的活性變化及作用Fig.4 Activity change and the role of PP2A in Raji cell apoptosis induced by TGF-β1

分組 72h細(xì)胞凋亡比例(%)control10±3100nmol/LOA8±2200nmol/LOA11±35ng/mLTGF-β160±5100nmol/LOA+5ng/mLTGF-β132±4200nmol/LOA+5ng/mLTGF-β125±3

3 討論

TGF-β作為一種重要的細(xì)胞因子，廣泛參與胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及炎癥反應(yīng)等一系列生理或病理生理過程。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包含多種配體與受體的結(jié)合。在哺乳動物體內(nèi)，存在TGF-β1、TGF-β2與TGF-β3等3種配體。而TGF-β受體為受體絲氨酸/蘇氨酸激酶兩者形成的異源二聚體，包括TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ等3種[6]。研究表明，TGF-β信號通路與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，它既可以作為腫瘤促進(jìn)因子，通過增強侵襲性質(zhì)、影響腫瘤微環(huán)境及抑制免疫功能等促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]，也可以作為腫瘤抑制因子，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。因此，TGF-β信號通路在不同腫瘤、同種腫瘤不同亞型及腫瘤的不同階段均可產(chǎn)生不同反應(yīng)，并呈現(xiàn)不同調(diào)控機制[9]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性淋巴腫瘤細(xì)胞對內(nèi)源性TGF-β敏感性降低，但是，通過外源性增加TGF-β劑量仍然可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5，10]。TGF-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制根據(jù)細(xì)胞類型的不同而變化。除TGF-β-Smad這一經(jīng)典的誘導(dǎo)凋亡途徑之外[11-12]，非Smad途徑，如Daxx-JNK的活化也可能參與其中[13]。通過上調(diào)促凋亡因子的表達(dá)(如Bax)和下調(diào)抑制凋亡因子的表達(dá)(如Bcl-2、Bcl-xl)，誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號并激活Caspase家族[14]。Caspase-3被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免。

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核生物體內(nèi)最為重要的蛋白磷酸酶之一，占細(xì)胞總蛋白的1%，在多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞凋亡[15]。同時，PP2A作為一種重要的腫瘤抑制因子，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。大量研究表明，在多種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤性疾病中，存在磷酸酶和磷酸激酶的不平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為PP2A磷酸酶活性受到抑制，腫瘤性激酶異?；罨?，最終引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。越來越多的研究證實PP2A在腫瘤中的作用，并且研發(fā)出以PP2A為作用靶點的抗腫瘤藥物。例如，F(xiàn)TY720是近年來研制出的一種PP2A激活劑，通過激活PP2A，保留其磷酸酶活性，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有有效的拮抗作用[17]。相反，采用PP2A特異性抑制劑OA抑制PP2A活性后，能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[18]。

PP2A通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和凋亡信號來發(fā)揮腫瘤抑制功能。PP2A的凋亡功能可通過直接去磷酸化一些特異的蛋白來發(fā)揮作用，可以同時使抗凋亡蛋白Bcl-2失活而激活凋亡誘導(dǎo)因子Bad；另外，PP2A還可以直接去磷酸化AKT來影響FOX的轉(zhuǎn)錄和凋亡活性[19]。在本研究中，我們以B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)PP2A還能通過去磷酸化ERK1/2發(fā)揮促凋亡作用。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，受活化的MEK蛋白激酶磷酸化和蛋白磷酸酶去磷酸化作用，前者通過磷酸化激活ER，后者則去磷酸化使其失活。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的ERK(p-ERK)具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)p-ERK蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核后，可促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)(如Bad、Bim)和抑制抗凋亡基因的表達(dá)(如Bcl-2、Bcl-x1)，最終可激活與凋亡相關(guān)的信號途徑，如Caspase-3表達(dá)上調(diào)[20]。因此，PP2A通過去磷酸化ERK，降低p-ERK在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，最終達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

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(2016-09-05 收稿)

PP2A-dependent Apoptotic Effect of Exogenous Transforming Growth Factor-β1on Human Burkitt’s Lymphoma Cell Line Raji Cells and Its Mechanism

Zhao Zhe，Liu Li，Liu Kunetal

DepartmentofHematology，MindaHospitalofHubeiUniversityforNationalities，Enshi445000，China

Objective To study the apoptotic effect of exogenous TGF-β1on human Burkitt’s lymphoma cell line Raji cells and its mechanism.Methods Raji cells were treated with recombinant TGF-β1at different concentrations(0，1，5，10 ng/mL)or stimulated by TGF-β1for different time(0，24，48，72 h).The apoptosis rate of Raji cells was detected by flow cytometry.Gene expression levels of Bcl-2，Bcl-xl and Caspase-3 were assayed by real-time PCR.Western blot analysis was used to assay the protein expression level of Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3，ERK1/2 and p-ERK1/2.Protein Ser/Thr phosphatase activity was assayed photometrically using the Serine/Threonine Phosphatase Assay System according to the manufacturer’s directions.Results Cell apoptosis rate was (29±3)%，(47±4)% and (60±5)%，24，48 and 72 h after stimulation of 5 ng/mL TGF-β1(allP<0.05).Simultaneously，mRNA and protein expression levels of Bcl-2 and Bcl-xl were decreased，and those of Casepase-3 were increased with time.Total protein expression of ERK1/2 was not significantly different，but p-ERK1/2 was decreased with TGF-β1stimulation.After pretreatment of 100 and 200 nmol/L okadaic acid(OA)，cell apoptosis rate was significantly decreased [(60±5)%vs.(32±4)% and (24±3)%；bothP<0.05].Conclusion TGF-β1induces Raji cell apoptosis by the activation of PP2A and down-regulation of ERK1/2 signal pathway related genes.

transforming growth factor β1； Burkitt’s lymphoma； apoptosis； PP2A

*湖北省教育廳科研項目(No.B2015101)

趙 哲，男，1979年生，主治醫(yī)師，碩士研究生，E-mail：1047687209@qq.com

△通訊作者,Corresponding author，E-mail：：yaoping0564@126.com

R733.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.012