鞘氨醇激酶1修飾的脂肪來源間充質干細胞對組織工程化骨成骨效果的影響*

吳景冬,李皓桓

武漢大學人民醫(yī)院骨關節(jié)外科，武漢 430060

鞘氨醇激酶1修飾的脂肪來源間充質干細胞對組織工程化骨成骨效果的影響*

吳景冬,李皓桓△

武漢大學人民醫(yī)院骨關節(jié)外科，武漢 430060

目的 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)修飾的脂肪來源間充質干細胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)對組織工程化骨成骨能力的影響。方法 將從SD大鼠脂肪細胞中分離提取的ADSC分為對照組(CON組)與實驗組(SPK1組)，分別感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒，在感染病毒14 d后，分別使用茜素紅和油紅O染色，檢測A595 nm和A490 nm以判定成骨、成脂能力，檢測兩組成骨細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性變化。構建SD大鼠股骨缺損模型，在CON與SPK1兩組ADSC與β磷酸三鈣陶瓷(β-TCP)結合后，將組織工程骨填壓至缺損處，4、6周后X線檢測大鼠骨缺損修復情況，Western blot檢測SPK1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein，BMP7)表達變化。結果 流式細胞儀檢測CON和SPK1慢病毒感染效率分別為94.4%、94.9%；CON和SPK1組SPK1蛋白相對表達量分別為(0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05；CON和SPK1組A595 nm分別為(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，A490 nm分別為(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，均P<0.05。CON與SPK1的ALP活性分別為(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01。在骨缺損修復中，第4周SPK1組大鼠骨缺損處形成的高密度組織面積顯著大于CON組，在第6周時SPK1組大鼠骨缺損治愈，而CON組則尚有缺損。CON和SPK1組在感染病毒48 h后BMP7相對表達量分別為(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05。結論 SPK1修飾的ADSC體外、體內成骨能力增強，其機制可能與BMP7激活相關。

鞘氨醇激酶1； 脂肪來源間充質干細胞； 組織工程化骨； 成骨能力； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白7

各種形式的骨缺損如骨腫瘤的切除[1]、牙槽骨缺損[2]等在臨床上常見，而相應的修復也一直是臨床亟待解決的問題，機體骨組織的修復是一個多因素作用的復雜過程，主要與骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMP)有關[3]，近年來應用組織工程化骨治療成為一個新的方向。脂肪間充質干細胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)是一種起源于脂肪組織的干細胞，與間充質干細胞相似，ADSC能夠分化為成骨、軟骨與脂肪細胞，與此同時ADSC還具有容易獲取、體外易擴增培養(yǎng)的優(yōu)點[4]，因此ADSC在組織工程骨中得到廣泛的應用。然而ADSC實際應用中依然存在新生血管少、成骨能力不足等缺點[5]，因此運用特定的基因修飾ADSC來達到增強成骨能力成為研究的熱點。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是一種在鞘磷脂代謝通路中發(fā)揮關鍵作用的激酶。多種細胞因子如白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)[6]、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[7]、血管內皮生長因子[8]等能夠通過SPK1調節(jié)鞘氨醇-1-磷酸進而改變骨組織代謝，包括抑制破骨細胞的分化成熟、破骨細胞及其前體細胞遷移[9]，SPK1甚至能夠通過力學刺激直接作用于骨細胞從而誘導骨組織重建[10]。因而，運用SPK1修飾的ADSC對于組織工程化骨成骨的改善具有很好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部，IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗體購自美國eBioscience公司，SPK1、BMP7和GAPDH一抗均購自美國Cell Signal Technology公司，SPK1慢病毒過表達質粒購自美國Vector BioLabs，β-TCP鈣磷陶瓷購自上海組織工程中心，堿性磷酸酶活性檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2 ADSC的分離提取與鑒定

SD大鼠頸椎脫臼處死后，分離腹股溝脂肪組織，并使用剪刀盡量剪碎；加入5 mL 0.1%的Ⅰ型膠原酶，37℃搖床振搖45 min；DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)液清洗3次，細胞種于相應大小的平皿中，48 h后換液；得到的貼壁細胞消化后，PBS洗2次，分別標記IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105流式抗體，冰上孵育30 min，流式檢測熒光陽性細胞比率。

1.3 CON和SPK1慢病毒包裝純化

CON組載體使用空載pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架質粒構建，SPK1組載體使用pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架質粒構建，CON和SPK1過表達慢病毒質粒與PMD2G、psPAX2質粒共轉染至293T細胞中，分別收集培養(yǎng)24、36、48 h病毒上清，PEG沉淀純化得到CON和SPK1慢病毒。

1.4 ADSC感染慢病毒與分組

大鼠ADSC分為CON和SPK1組，分別感染10 MOI(病毒∶細胞=10∶1)CON和SPK1過表達慢病毒，14 d后檢測ADSC成骨、成脂能力的變化。

1.5 蛋白印跡檢測

采用Western blot法，收集感染CON和SPK1慢病毒的ADSC細胞，使用RIPA裂解，并加入蛋白上樣緩沖液得到蛋白樣本，上樣量為20 μg，濃縮膠以80 V電泳50 min，分離膠以100 V電泳2 h，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入SPK1(1∶200)、BMP7(1∶200)和GAPDH(1∶200)一抗，4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)孵育2 h，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白質印跡條帶進行定量測定。目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/ GAPDH，實驗均重復3次，取平均值。

1.6 ADSC成骨與成脂誘導染色

CON和SPK1組ADSC分別培養(yǎng)于成骨、成脂誘導液中，成骨誘導液配方為α-MEM+ 10%FBS、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 nmol/L地塞米松，每3天換液，14 d后使用茜素紅染色確定成骨細胞。成脂誘導液配方為HD-DMEM+10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素、200 μmol/L吲哚美辛和0.5 mmol/L IBMX，14 d后使用油紅O染色確定成脂細胞。所有誘導均設立復孔，在茜素紅和油紅O染色后，使用分光光度計分別檢測595 nm與490 nm波長處的吸光度值以確定成骨、成脂能力的變化。

1.7 ADSC細胞與β-TCP復合

將CON組和SPK1組ADSC取1×106個細胞，懸浮于30 μL完全培養(yǎng)液中，隨后接種于消毒后的β-TCP上，37℃、5% CO2靜置4 h后，待細胞貼附于β-TCP，將材料放置于96孔板中，隔2～3 d換液。

1.8 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測

實驗按照試劑盒說明書進行，細胞感染病毒后14 d裂解取上清，加入到顯色底物溶液中，并設立空白對照，37℃孵育5～10 min，每孔加入100 μL反應終止液終止反應，檢測405 nm波長處吸光度值來判定ALP活性，實驗重復3次，取平均值。

1.9 大鼠骨損傷模型的構建以及ADSC療效評估

60只SD大鼠隨機分為CON、SPK1組、未處理組和單用β-TCP組，每組15只，使用3 mg/kg水合氯醛麻醉后，在股骨處做一縱切口，并分離肌肉以暴露股骨，使用外科錐做一2 mm×2 mm的股骨缺損，深至骨髓可見，并將組織工程骨即CON或SPK1細胞與材料的復合物填充至缺損處，同時設立未做任何處理組以及單用β-TCP組，縫合切口。4、6周后處死大鼠，使用X線檢測骨缺損的改變。

1.10 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0軟件進行分析，兩組間均數(shù)比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SD大鼠ADSC的分離提取及純度測定

SD大鼠ADSC中CD19 0.128%、CD34 0.099%、CD11b 0.031%、CD45 0.132%、HLA-DR 0.017%，均為陰性；而CD73 98.4%、CD90 98.4%、CD105 97.9%，均為陽性，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測ADSC中CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105陽性細胞的比例Fig.1 Percentages of CD19+，CD34+，CD11b+，CD45+，HLA-DR+，CD73+，CD90+，CD105+ ADSC detected by flow cytometry

2.2 CON和SPK1慢病毒的包裝純化與感染復數(shù)測試

流式細胞儀檢測CON和SPK1組紅色熒光蛋白RFP陽性細胞比例以確定感染效率，結果表明，CON組感染效率為94.4%，SPK1為94.9%(圖2A)；Western blot檢測SPK1蛋白水平的變化，結果表明在CON和SPK1組的蛋白相對表達量分別為(0.63±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05(圖2B)。

2.3 SPK1過表達對ADSC成骨、成脂能力的影響

相對于CON組，SPK1組ADSC分化偏向成骨，而成脂則相對變少(圖3A)；CON和SPK1 ADSC成骨能力A595 nm分別為(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，P<0.05，成脂能力A490nm分別為(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，P<0.05(圖3B)；進一步測定成骨細胞標志酶ALP活性的變化，結果表明CON與SPK1 ALP活性分別為(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01(圖3C)。

2.4 SPK1過表達增強組織工程化骨成骨能力

CON和SPK1組ADSC與β-TCP結合后將組織工程化骨填壓到SD大鼠股骨缺損處，在4、6周后處死SD大鼠，X線檢測大鼠骨缺損的修復狀況后發(fā)現(xiàn)，在第4周時，SPK1組大鼠骨缺損處形成的高密度組織面積顯著大于CON組，在第6周時SPK1組大鼠骨缺損基本治愈，而CON組則尚有缺損，未處理組與單用β-TCP組無明顯修復痕跡(圖4A)。同時CON和SPK1感染ADSC 48 h使用Western blot檢測BMP7變化后發(fā)現(xiàn)，CON和SPK1組相對表達量分別為(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05(圖4B)。

ADSC細胞分別感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒48 h后，A：流式細胞儀檢測RFP陽性細胞比例；B：Western blot檢測SPK1的表達圖2 SPK1過表達慢病毒感染效率及表達水平檢測Fig.2 Measurement of infection efficiency and expression of SPK1 over-expression lentivirus

A：使用茜素紅和油紅O染色檢測CON與SPK1組ADSC成骨、成脂的變化;B：在A595 nm和A490 nm波長處檢測CON與SPK1組ADSC成骨成脂能力;C：CON與SPK1組ALP活性比較；*P<0.05 **P<0.01圖3 SPK1過表達對于組織工程化骨細胞成骨、成脂的影響Fig.3 Impact of SPK1 overexpression on osteogenic and adipogenic ability of tissue-engineered bone cells

A：復合物植入到骨缺損的SD大鼠中，分別在4、6周處死大鼠，X線檢測骨缺損的修復情況，箭頭所示為骨缺損處修復情況;B：48 h后Western blot檢測CON與SPK1組ADSC中BMP7的表達圖4 SPK1對ADSC體內成骨的影響Fig.4 Effect of SPK1 on osteogenesis of ADSC in vivo

3 討論

在骨損傷的治療中，應用組織工程化骨已經(jīng)能夠起到很好的效果。組織工程化骨的構建過程為，首先得到分離純化的種子細胞如間充質干細胞，體外誘導成骨并擴大培養(yǎng)后，種植于合適的支架材料中，并將細胞與支架材料的復合物植入到骨缺損部位[11]。影響組織工程化骨的主要因素為種子細胞、生長因子及支架材料[12]，其中種子細胞起到至關重要的作用。組織工程化骨中的細胞可分為分化成熟的細胞及未分化的干細胞兩種，在分化成熟的細胞中，細胞的可用性極其有限，因此，研究主要集中于間充質干細胞的應用[13]。對于組織工程化骨的改進主要集中于通過種子細胞的選擇、支架材料的選擇、運用基因修飾、細胞因子等方法更有效地促進種子細胞的成骨分化[14]。ADSC近年來在組織工程化骨中的作用已被廣泛認可，然而在實際的應用中，依然存在著成骨能力弱、新生血管少等問題。因此，針對特定基因進行修飾，改善種子細胞如ADSC的生物學指標以完善組織工程化骨成為研究的熱點，如在Lieberman等[15]的研究中，BMP-2過表達腺病毒轉染大鼠基質細胞后，能夠修復自體股骨8 mm大小的節(jié)段性缺損。目前對于ADSC的基因修飾主要集中于BMP及其相關蛋白，針對BMP蛋白的修飾盡管能夠改善ADSC的成骨特性[16]，單一BMP的修飾如BMP2、BMP7的修飾并不能夠收到滿意的效果[17]，而聯(lián)合表達BMP2、BMP7則會增加可變因素從而限制臨床的應用，因此尋求新的靶點修飾ADSC成為必要。

在本研究中，首先從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離提取ADSC，在使用流式細胞儀對ADSC常見標志物進行檢測后，確定了分離的ADSC具有很高的純度，同時包裝、純化SPK1過表達慢病毒，在使用10 MOI感染ADSC后，分別通過流式細胞儀、Western blot確定了SPK1慢病毒對于ADSC具有很高的感染效率，且能夠在蛋白水平顯著促進SPK1的表達。ADSC在感染SPK1病毒14 d后分別使用茜素紅和油紅O染色檢測ADSC成骨、成脂能力的變化，結果表明SPK1的表達增高使得ADSC成骨能力增加、成脂能力減弱，ADSC成骨、成脂平衡得到改變，SPK1 ADSC在A595 nm的升高和A490 nm的降低也印證了這一點，而SPK1組成骨細胞標志酶ALP活性也明顯高于CON，進一步證實了ADSC-SPK1組成骨能力的增加，因此，SPK1對ADSC體外成骨能力的促進得到證實。隨后將CON和SPK1 ADSC與β-TCP復合，使用SD大鼠骨缺損模型觀察成骨效果后發(fā)現(xiàn)，從第4周開始，SPK1組大鼠骨缺損修復明顯優(yōu)于CON組，且在第6周SPK1組完全愈合，而CON組骨缺損依然存在，進一步證實了SPK1組骨缺損修復優(yōu)于CON組，在ADSC感染CON和SPK1慢病毒48 h時，使用Western blot檢測BMP7的變化后發(fā)現(xiàn)，BMP7表達顯著上調，提示SPK1對于骨缺損修復的促進可能與BMP7的上調有關。

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(2016-09-23 收稿)

Impact of SPK1 Modified ADSC on Osteogenesis of Tissue Engineered Bone

Wu Jingdong，Li Haohuan△

DepartmentofBoneandJointSurgery，RenmingHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China

Objective To investigate the impact of sphingosine kinase 1(SPK1) modified adipose tissue-derived stromal cells(ADSC)on tissue engineered bone osteogenesis.Methods ADSC cells isolated from SD rat fat cells were divided into CON group and SPK1 group，and then the cells were respectively infected with 10 MOI CON and SPK1 lentivirus for 48 h.The infection efficiency was confirmed by using flow cytometry.Alizarin red and oil red O was used to stain the cells 14 days after ADSC infection，and osteogenic and adipogenic ability was evaluated by detectingA595 nmandA490 nm.In the meantime，the activity change of alkaline phosphatase(ALP)was detected.The SD rat femoral defect model was created，and then after combining ADSC with β-TCP，the tissue engineered bone was pressed to the defect site.The repairment of bone defect was detected by X-ray in 4，6 weeks.After infection of CON and SPK1 virus，bone morphogenetic protein(BMP7)expression in ADSC of these two groups was detected.Results The infection efficiency of CON and SPK1 lentivirus was 94.4%vs.94.9% respectively by flow cytometry.The SPK1 protein expression level in CON group and SPK1 group was (0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)(P<0.05).TheAvalue of CON and SPK1 group at 595 nm was (0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)(P<0.05)，respectively.TheAvalue of CON and SPK1 group at 490 nm was (0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)(P<0.05)，respectively.The expression level of ALP in CON and SPK1 group was (1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)(P<0.01)，respectively.In the repairment of bone defect，high density tissue at rat bone defect was significantly larger in SPK1 group than in CON group in 4 weeks，and in 6 weeks，bone defect of SPK1 group was healed，but CON group still had defect.The expression level of BMP7 in CON and SPK1 group was (1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)(P<0.05)，respectively，48 h after infection.Conclusion SPK1 modified ADSC has an enhanced osteogenesis abilityinvitroandinvivo，which was related to the activation of BMP7.

sphingosine kinase 1； adipose tissue-derived stromal cells； tissue engineered bone； osteogenesis； bone morphogenetic protein 7

*國家自然科學基金資助項目(No.81171760)

吳景冬，男，1976年生，副主任醫(yī)師，E-mail：377181369@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：lihaohuan@139.com

R681.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.011