乳汁免疫和豬流行性腹瀉病毒病疫苗：歷史和現(xiàn)狀(譯文)

譯者：呂茂杰 校者：楊保收

仔豬生產(chǎn)

乳汁免疫和豬流行性腹瀉病毒病疫苗：歷史和現(xiàn)狀(譯文)

原文出處：Langel Stephanie N,Paim Francine Chimelo,Lager Kelly M,Vlasova Anastasia N,Saif Linda J. Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV):Historical And Current Concepts[J].Virus Research,2016,226(11):93-107.

譯者：呂茂杰 校者：楊保收

由于腸道病毒感染導(dǎo)致仔豬在發(fā)病率、死亡率和生產(chǎn)能力喪失方面的影響，每年給養(yǎng)豬者帶來數(shù)百萬美元的損失。2013—2014年間，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）病的暴發(fā)給美國養(yǎng)豬業(yè)帶來了9億～18億美元的經(jīng)濟(jì)損失。被動(dòng)乳汁免疫被認(rèn)為是保護(hù)新生哺乳仔豬免受PED等腸道疾病危害的最有希望和有效的方法。通過乳汁免疫被動(dòng)保護(hù)哺乳仔豬的效果依賴于病原特異性IgA漿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至乳腺的數(shù)量和乳汁中分泌型IgA的積累程度，這種免疫途徑被定義為“腸-乳腺-sIgA軸”。由于胎盤的不可穿透性，新生仔豬處于無免疫球蛋白的狀態(tài)，對(duì)很多的傳染性病原體極易感。它們僅依靠來源于母源的初乳和乳汁抗體獲得被動(dòng)保護(hù)。先前開發(fā)的關(guān)于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）病的活疫苗和滅活疫苗，提供了對(duì)母源性免疫和仔豬被動(dòng)保護(hù)機(jī)制的理解。在這篇文章中，綜述了豬傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)乳汁免疫的研究進(jìn)展，并指出對(duì)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)正努力控制的豬流行性腹瀉病毒感染和相關(guān)疫苗的研究方向。同時(shí)研究和鑒別出影響乳汁免疫和“腸-乳腺-sIgA軸”的各種因素，有助于改善妊娠母豬預(yù)防豬流行性腹瀉病毒感染以及改進(jìn)其它腸道病原用疫苗方案，從而達(dá)到提升整個(gè)豬群的免疫力、豬群健康和企業(yè)生產(chǎn)力的目的。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；乳汁免疫；母源抗體；“腸-乳腺-sIgA軸”；豬

1 前言

20世紀(jì)70年代，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）作為一個(gè)新的α冠狀病毒，首次出現(xiàn)在歐洲肥育豬群中。隨后廣泛流行，哺乳仔豬最為嚴(yán)重。然而，從2014年至今，PEDV在歐洲多個(gè)國家暴發(fā)（Boniotti et al.,2016;Dastjerdi et al.,2015;Grasland et al.,2015; Stadler et al.,2015;Theuns et al.,2015）。在20世紀(jì)80年代，由于PEDV在亞洲豬群的暴發(fā)，疫病普遍存在，最后成為地方流行性疫?。⊿ong and Park, 2012）。隨后，開發(fā)出相應(yīng)的弱毒疫苗和滅活疫苗，并得到廣泛應(yīng)用。然而，從2011年之后，由PEDV強(qiáng)毒株引起遍及整個(gè)亞洲的嚴(yán)重的豬流行性腹瀉病。在亞洲，來源于歐洲和其它經(jīng)典PEDV毒株的疫苗無法控制新毒株的致病性（Song and Park,2012）。2013年，PEDV作為一個(gè)新的、引起豬群嚴(yán)重腹瀉疫病的病原在美國出現(xiàn)。PEDV很快遍及整個(gè)美國，感染所有日齡豬只，給養(yǎng)豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Stevenson et al.,2013）。隨后，該病傳播至加拿大和墨西哥（Jung and Saif,2015;Ojkic et al.,2015）。從遺傳學(xué)角度分析，美國PEDV毒株與來自于中國的高致病性毒株極其相似（China AH2012 and CH/ ZMZDY/11），但是美國PEDV的起源仍然不清楚（Huang et al.,2013;Marthaler et al.,2013;Vlasova et al.,2014）。PEDV的發(fā)生與病程和在20世紀(jì)60至80年代引起哺乳仔豬嚴(yán)重流行性腹瀉的TGEV相似（Saif et al.,2012）[Saif L J,Proceedings of the 2015 American Association of Swine Veterinarians(AASV) Annual Meeting,page 403-406]。雖然，弱毒豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）疫苗的開發(fā)，提供給仔豬一定的保護(hù)效應(yīng)，在1983—1984年TGEV噬呼吸系統(tǒng)型變異株—豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）的出現(xiàn)極大地影響了TGEV的流行性和嚴(yán)重性（Pensaert et al.,1986; Saif et al.,2012）。PRCV在美國、歐洲和亞洲的廣泛流行，普遍地減弱了TGEV的致病性，TGEV在西歐地區(qū)明顯減少并消除了其發(fā)病率。由于PEDV的高毒力和新生哺乳仔豬不成熟的免疫系統(tǒng)，被動(dòng)的乳汁免疫對(duì)哺乳仔豬的保護(hù)是最關(guān)鍵的。其被動(dòng)免疫作用發(fā)生類似于TGEV的乳汁免疫，其中“腸-乳腺-sIgA軸”在針對(duì)PEDV的乳汁免疫中扮演關(guān)鍵角色（Bohl et al.,1972）。弄清楚“腸-乳腺-sIgA軸”循環(huán)對(duì)于保障PEDV暴發(fā)期間的豬群健康至關(guān)重要，便于設(shè)計(jì)開發(fā)預(yù)防性疫苗。在這篇綜述中，我們主要關(guān)注引起哺乳仔豬致命的PEDV病原的乳汁免疫和疫苗的設(shè)計(jì)。了解TGEV的乳汁免疫的誘導(dǎo)機(jī)理，將給PEDV疫苗的開發(fā)提供歷史性的見解。

2 乳汁被動(dòng)免疫和“腸-乳腺-sIgA軸”

PEDV和TGEV主要感染部位為小腸，通過血清病毒核酸的檢測(cè)表明病毒感染幼齡仔豬存在短暫的病毒血癥（Jung et al.,2014）。對(duì)新生仔豬的感染尤為嚴(yán)重。對(duì)兩種病的免疫策略必須通過誘導(dǎo)黏膜免疫來達(dá)到阻止豬小腸上皮細(xì)胞靶向病毒的感染。對(duì)于新生和哺乳期仔豬來說，黏膜免疫的保護(hù)水平是必要的。對(duì)新生仔豬感染豬流行性腹瀉病毒的預(yù)防存在兩種主要問題：1）在陽性母豬群，母源抗體干擾口服活疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)；2）對(duì)于仔豬，需要3周的時(shí)間產(chǎn)生抗體。因此，在懷孕母豬黏膜部位誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，通過初乳和乳汁被動(dòng)轉(zhuǎn)移給仔豬，提供給仔豬腸道感染的直接保護(hù)作用至關(guān)重要。先前對(duì)于TGEV被動(dòng)免疫的研究表明，感染TGEV康復(fù)的母豬能夠提供給其后代豬群針對(duì)TGEV感染的保護(hù)。這種保護(hù)與乳汁中高水平的抗體息息相關(guān)，而不是血清中抗體（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif, 1975;Saif et al.,1972）。然而，對(duì)于乳汁免疫和誘導(dǎo)乳汁抗體保護(hù)水平的機(jī)制還不清楚，這也阻礙了有效TGEV母源抗體疫苗的開發(fā)。同時(shí)，腸道病原的乳汁免疫誘導(dǎo)作用機(jī)制相關(guān)問題的不清楚，也影響了PEDV疫苗的效果。早期對(duì)TGEV疫苗的研究發(fā)現(xiàn)了幾種關(guān)鍵的免疫學(xué)想象（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。由于母豬胎盤的不可通透性，仔豬天生無免疫球蛋白，僅依靠初乳和乳汁抗體來獲得被動(dòng)免疫保護(hù)（Saif and Jackwood,1990）。這也使得仔豬對(duì)過多的病原感染表現(xiàn)出高的易感性。對(duì)于母豬，在初乳中IgG為優(yōu)勢(shì)抗體，主要從血清中滲出（Klobasa et al.,1987），新生仔豬通過哺乳獲得初乳抗體（主要為IgG）。這些免疫球蛋白僅能在仔豬出生后的24～48 h時(shí)間內(nèi)通過小腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，在接下來的2～3 d，初乳過渡至乳汁階段，起主導(dǎo)作用的sIgA通過泌乳持續(xù)存在于乳汁中。因此，從母豬初乳中獲得的IgG抗體提供給仔豬的血清抗體反映了母豬血清抗體的特異性，用于預(yù)防仔豬的系統(tǒng)性感染；IgA抗體在乳汁中占優(yōu)，提供給仔豬針對(duì)腸道病毒感染的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。揭示乳腺中分泌sIgA抗體至乳汁的IgA免疫細(xì)胞的來源，對(duì)于誘導(dǎo)被動(dòng)乳汁sIgA抗體保護(hù)的腸道相關(guān)疫苗的設(shè)計(jì)尤為重要。除了乳汁，在黏膜表面和大多數(shù)黏膜分泌物中，sIgA是主導(dǎo)的免疫球蛋白（Macpherson et al., 2008;Mantis et al.,2011）。sIgA對(duì)蛋白酶的抵抗力保障了其在胃腸道的高穩(wěn)定性。對(duì)于TGEV免疫的研究，提供了對(duì)懷孕豬乳汁免疫策略的基本理解。1972年，Bohl等在豬中發(fā)現(xiàn)的“腸-乳腺-sIgA軸”（IgA免疫效應(yīng)細(xì)胞從腸道向乳腺穿梭）是關(guān)于黏膜免疫系統(tǒng)概念的最早定義（Bohl et al.,1972;Saif, 1999;Saif and Bohl,1983;Saif et al.,1972;Weisz-Carrington et al.,1978）。研究結(jié)果揭示了自然感染或者口服接種TGEV母豬和感染后康復(fù)母豬，乳汁中含有持續(xù)高水平的sIgA抗體，保護(hù)仔豬免受TGEV的感染。然而，使用滅活疫苗免疫母豬在血清和初乳中主要是IgG抗體，在乳汁中迅速下降，提供給仔豬很少的乳汁免疫。這種發(fā)現(xiàn)也使得誘導(dǎo)黏膜被動(dòng)免疫的母源的免疫策略適用于多個(gè)物種和腸道病原，包括PEDV。

2.1 豬群中淋巴細(xì)胞黏膜歸巢的基本要素

淋巴細(xì)胞在血液和淋巴組織之間不斷循環(huán)至全身各系統(tǒng)，發(fā)揮對(duì)入侵病原的免疫監(jiān)視和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用（Butcher and Picker,1996;Gowans, 1959）。淋巴細(xì)胞通過毛細(xì)血管后微靜脈血管在二級(jí)淋巴器官中遷移，從而出入二級(jí)淋巴器官。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞經(jīng)高內(nèi)皮小靜脈血管滲出，經(jīng)過多步加工，包括滾動(dòng)、黏附、遷移和定位至各自的淋巴結(jié)（Kunkel et al.,2003;Springer,1995）。淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞差異化表達(dá)表面配體和受體，趨化因子和細(xì)胞因子可辨別來自黏膜歸巢位點(diǎn)的外周淋巴細(xì)胞。系統(tǒng)性的淋巴細(xì)胞歸巢和黏膜部位的淋巴細(xì)胞歸巢的不同有助于對(duì)黏膜免疫反應(yīng)和針對(duì)系統(tǒng)性病原或黏膜性病原疫苗設(shè)計(jì)的理解。比如，淋巴細(xì)胞配體α4β1，L-選擇素（L-selectin）和細(xì)胞因子受體（CCR）7分別與血管細(xì)胞黏附因子1（VCAM-1），外周淋巴結(jié)黏附素（PNAd）和細(xì)胞因子配體（CCL）21相互作用來控制淋巴細(xì)胞的外周遷移（Miyasaka and Tanaka,2004）。然而，淋巴細(xì)胞穿梭定位至黏膜組織，尤其是小腸，大多是通過α4β7與黏膜黏附細(xì)胞黏附分子1（MAdCAM-1）相互作用來調(diào)控的（Briskin et al.,1997;Marui et al.,1993）。由高毛細(xì)血管后微靜脈和其它組織分泌的細(xì)胞因子在黏膜淋巴細(xì)胞遷移和限定歸巢部位（比如：淋巴細(xì)胞穿梭的組織特異性）中扮演重要的角色（Miyasaka and Tanaka,2004）。趨化因子通過結(jié)合細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，抑制腺苷酸環(huán)化酶，活化細(xì)胞內(nèi)鈣離子來調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的直接遷移（Dixit and Simon, 2012）。受體活化后，趨化因子結(jié)合到淋巴器官或其它組織的膜鏈和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的葡糖氨基聚糖類來產(chǎn)生趨化因子成分（Proudfoot et al.,2003）。在小腸，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的CCL25和CCL28，分別結(jié)合淋巴細(xì)胞分泌的CCR9和CCR10（Stenstad et al.,2006; Wang et al.,2000;Wurbel et al.,2007）。

據(jù)估計(jì)，超過80%IgA抗體分泌細(xì)胞（ASC）位于腸相關(guān)淋巴組織中（Suzuki et al.,2007；Macpherson and Slack,2007）。因此，在豬體中，黏膜B細(xì)胞有效遷移的特殊穿梭信號(hào)的啟動(dòng)，對(duì)腸道疾病的預(yù)防和清除是必需的。例如，在對(duì)腸道病原輪狀病毒的小腸感染過程的研究中，病毒僅存在很短的時(shí)間窗口（首次感染4～9 d，二次感染3～7 d），此時(shí)可在血液中檢測(cè)到腸來源的淋巴細(xì)胞和IgA抗體分泌細(xì)胞的運(yùn)輸。這些細(xì)胞在血液中短暫的運(yùn)輸表明其在腸道受到的刺激，并且歸巢至小腸和其它黏膜部位（Brown et al.,2000;Ward et al.,1996b;Yuan et al.,1996）。這些研究結(jié)果表明在豬體中識(shí)別運(yùn)輸信號(hào)啟動(dòng)窗口期和淋巴細(xì)胞受刺激后由腸道進(jìn)入循環(huán)，運(yùn)輸至其它黏膜部位的時(shí)間窗口期的重要性，比如乳腺。此外，就像在小鼠腸道中出現(xiàn)的α4β7+記憶性B細(xì)胞與輪狀病毒的清除相關(guān)聯(lián)，歸巢標(biāo)記物α4β7可能對(duì)于PEDV的清除也是有用的（Williams et al.,1998）。

Bourges和同事分析了豬體內(nèi)不同黏膜部位黏附分子和細(xì)胞因子差異化表達(dá)情況（Bourges et al., 2007）。相比α4β7，α4β1在黏膜固有層、上皮內(nèi)CD3T和IgA B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)高于在鼻黏膜和外周血淋巴細(xì)胞。然而，在小腸上皮內(nèi)CD3T和IgA B淋巴細(xì)胞中α4β7的表達(dá)高于α4β1。在鼻和小腸黏膜表達(dá)不同通過測(cè)量血管黏附素來確定。PNAd在鼻黏膜固有層的血管表達(dá)，而在小腸血管未檢測(cè)到。相反，MAdCAM-1在小腸中檢測(cè)到表達(dá)，而在鼻黏膜固有層不表達(dá)。相比小鼠和人類，在豬體內(nèi)，這些結(jié)果提示黏膜歸巢特性存在組織特異性（Butcher and Picker,1996）。此外，黏膜細(xì)胞因子及其相關(guān)受體的表達(dá)也表現(xiàn)出組織特異性。CCL25在呼吸道組織中展現(xiàn)低水平的mRNA表達(dá)，而在小腸中表現(xiàn)高水平的表達(dá)。在小腸、大腸和氣管存在CCL28的高水平表達(dá)。當(dāng)豬體小腸和呼吸道組織中CCR9的表達(dá)普遍存在時(shí)，高水平表達(dá)的CCR10定位到小腸和大腸、腸系膜淋巴結(jié)和乳腺。評(píng)估健康豬體和感染豬體中黏附分子和細(xì)胞因子的角色對(duì)于理解發(fā)病機(jī)制和宿主免疫反應(yīng)是不可或缺的，有助于開發(fā)更有效的疫苗。了解淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其相關(guān)信號(hào)有助于進(jìn)一步理解腸道病原（如PEDV）的免疫反應(yīng)。通過優(yōu)化疫苗效果，使其靶向豬體小腸淋巴細(xì)胞對(duì)黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)最大效應(yīng)期，將會(huì)增強(qiáng)乳汁免疫，從而減少新生哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率。

2.2 在母豬中IgA漿細(xì)胞從小腸到乳腺的歸巢

有關(guān)于通過對(duì)懷孕動(dòng)物的免疫提供給哺乳仔豬被動(dòng)保護(hù)，從而免受細(xì)菌和病毒感染的研究（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif,1975;Bohl et al.,1974;Kortbeek-Jacobs et al.,1984;Lanza et al.,1995;Moon and Bunn,1993;Saif et al.,1972;Saif and Fernandez, 1996;Saif et al.,1984;Wilson et al.,1972）。乳汁免疫即通過消化初乳和乳汁來獲得免疫球蛋白（IgG、IgM、sIgA）的連續(xù)供應(yīng)過程，在初乳中IgG為優(yōu)勢(shì)型，乳汁中IgA為優(yōu)勢(shì)型（Klobasa et al.,1987）。在腸道分泌物中最大量的抗體為sIgA，其通過借助上皮細(xì)胞底外側(cè)表面的多聚免疫球蛋白受體將小腸漿細(xì)胞產(chǎn)生的二聚體IgA遷移至腸腔來產(chǎn)生（圖1）。一旦進(jìn)入腸腔，sIgA即可提供免疫保護(hù)，促成小腸的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定（Macpherson et al.,2008;Mantis et al., 2011）。“腸-乳腺-sIgA軸”通過小腸的自然感染或口服免疫來啟動(dòng)后，漿母細(xì)胞以泌乳的方式運(yùn)輸至乳腺提供特異性免疫。小腸中IgA漿母細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移主要是通過表面整聯(lián)蛋白α4β7與MAd－CAM-1，CCR9與CCL25，CCR10與CCL28的相互作用來介導(dǎo)。然而，在小鼠中，歸巢標(biāo)記一致的顯示為CCR10和CCL28的相互作用，通過二者的相互作用來調(diào)控IgA漿母細(xì)胞的遷移；當(dāng)CCL28被阻斷，乳汁中IgA抗體水平減少，從而導(dǎo)致了乳鼠攝入性IgA抗體的缺乏（Wilson and Butcher,2004）。此外，在CCR10缺陷的鼠模型中，IgA抗體分泌細(xì)胞在乳腺的積累功能喪失（Morteau et al.,2008）。這些研究在豬體內(nèi)未被復(fù)制，但存在相關(guān)的證據(jù)。在小鼠和豬泌乳前，CCL28在乳腺中最大量的表達(dá)（Berri et al.,2008;Lazarus et al.,2003）。在母豬的整個(gè)妊娠過程中，乳腺中CCL28蛋白量和積累的IgA B細(xì)胞的數(shù)量同時(shí)增加（Bourges et al.,2008;Meurens et al.,2006）。另外，CCL28蛋白在母豬乳汁中被檢測(cè)到，進(jìn)一步證實(shí)在母豬乳汁免疫中該細(xì)胞因子的重要角色（Berri et al.,2008）。

在母豬的妊娠末期和哺乳早期，乳腺血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MAdCAM-1增加（Bourges et al.,2008）。在豬和小鼠中，當(dāng)α4β7與MAdCAM-1結(jié)合提示募集IgA漿母細(xì)胞到乳腺，同時(shí)也存在相反的結(jié)論（Postigo et al.,1993;Tanneau et al.,1999）。在小鼠，α4β7結(jié)合MAdCAM-1的功能阻斷，乳汁IgA的蓄積未減少（Low et al.,2010）。而且，在豬體中，遷移進(jìn)入乳腺的IgA漿母細(xì)胞僅有小部分IgA B細(xì)胞在乳腺中表達(dá)α4β7(Bourges et al.,2008）。這些結(jié)果表明盡管α4β7/MAdCAM-1相互作用在“腸-乳腺-sIgA軸”中起重要作用，但同時(shí)也存在其它的作用機(jī)制。然而，在小鼠中，整聯(lián)蛋白α4β1和各自的地址素VCAM-1（addressin VCAM-1）與淋巴細(xì)胞到乳腺的遷移相關(guān)。在豬體中，泌乳期乳腺中檢測(cè)到表達(dá)α4β1的IgA B細(xì)胞，數(shù)量上高于表達(dá)α4β7的IgA B細(xì)胞。此外，血管細(xì)胞黏附素（VCAM-1）在乳腺的表達(dá)先于分娩和泌乳期間（Bourges et al.,2008）。當(dāng)小鼠用抗VCAM-1血清處理，IgA抗體分泌細(xì)胞在泌乳乳腺的蓄積被抑制（Low et al.,2010）。這些數(shù)據(jù)表明抗體分泌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的運(yùn)輸依賴于α4β1/VCAM-1的相互作用。小鼠和豬之間的不同報(bào)道要考慮淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物種差異（Rothkotter,2009）。需要進(jìn)一步豬體內(nèi)的研究來確證從小鼠研究中獲得的結(jié)果。

分析乳腺組織和分泌物中B細(xì)胞、T細(xì)胞和趨化因子來監(jiān)視免疫細(xì)胞到乳腺的運(yùn)輸特征。在整個(gè)懷孕期，乳腺中B/T免疫細(xì)胞組成和積累呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)過程，與CCR10和CCL28 mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)平行關(guān)系。比如，在妊娠早期（妊娠期前3個(gè)月），乳腺中IgA B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量較少，同時(shí)CCR10/CCL28表達(dá)幾乎沒有；在妊娠中期，乳腺中T細(xì)胞數(shù)量增加，而IgA B細(xì)胞數(shù)量與妊娠前期相同；妊娠晚期，乳腺中T細(xì)胞的蓄積達(dá)到峰值，而IgA B細(xì)胞數(shù)量和CCR10/CCL28表達(dá)適度的增加。在動(dòng)物分娩時(shí)間，IgA B細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，在泌乳期，CCR10/CCL28表達(dá)持續(xù)增長（Bourges et al.,2008;Chabaudie et al., 1993;Meurens et al.,2006）。這些結(jié)果表明B細(xì)胞運(yùn)輸對(duì)于乳腺免疫的重要性，隨后抗體分泌至初乳和乳汁中。了解懷孕后期免疫細(xì)胞遷移至乳腺的動(dòng)力學(xué)特征，對(duì)于乳汁免疫的調(diào)節(jié)是必不可少的。通過自然感染或口服接種來啟動(dòng)未感染母豬的“腸-乳腺-sIgA軸”，需要優(yōu)化病原特異性B細(xì)胞、T細(xì)胞和其它影響因素，包括胎次、妊娠階段、乳素和乳腺發(fā)育的激素、暴露劑量（本部分內(nèi)容僅提出概念，未全翻譯）。

圖1 關(guān)于“腸-乳腺-sIgA軸”和轉(zhuǎn)運(yùn)分子的示意（Chattha et al.,2015）

3 母豬乳汁免疫相關(guān)的物質(zhì)

3.1 IgA抗體

鑒定感染或免疫相關(guān)物質(zhì)便于評(píng)估個(gè)體動(dòng)物或群體的易感性，便于理解感染/接種疫苗、宿主免疫反應(yīng)、臨床癥狀和免疫保護(hù)之間的關(guān)系。關(guān)于乳汁免疫，母豬通過母源抗體來提供給新生仔豬免疫保護(hù)是最好的例證（Saif,1999;Zinkernagel,2001）。已有記錄表明由于胎盤的不可透過性母豬生出無免疫球蛋白后代（Kim et al.,1966）。通過乳汁免疫提供給仔豬免疫防御需要的母源抗體持續(xù)到仔豬可以產(chǎn)生足夠數(shù)量的內(nèi)源性抗體階段。先前在豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒的研究中鑒定了免疫相關(guān)物質(zhì)。其中，新生仔豬對(duì)TGEV保護(hù)率的增加與初乳和乳汁中高滴度的sIgA抗體相關(guān)（Bohl et al.,1972; Bohl and Saif,1975;Saif et al.,1972）。此外，在人輪狀病毒誘導(dǎo)疾病模型中，首次鑒定出血液和小腸中IgA抗體分泌細(xì)胞穿梭，IgA抗體分泌細(xì)胞作為一種免疫保護(hù)標(biāo)記，活化腸道免疫。在這項(xiàng)研究中，血液中輪狀病毒特異性的IgA抗體分泌細(xì)胞，而不是IgG抗體分泌細(xì)胞，與小腸IgA抗體分泌細(xì)胞相關(guān)，可抵抗同型病毒的攻擊（Yuan et al.,1996）。這種關(guān)系在新生兒病人中被證實(shí)，循環(huán)的輪狀病毒特異性IgA抗體分泌細(xì)胞與小腸固有層IgA抗體分泌細(xì)胞相關(guān)（Brown et al.,2000）。從腸到其它黏膜組織細(xì)胞穿梭的特定時(shí)間范圍，通過評(píng)價(jià)SPF豬只經(jīng)過輪狀病毒攻擊后，小腸（腸系膜淋巴結(jié)和回腸固有層）、循環(huán)（血液）和系統(tǒng)（脾臟）單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)來確定。輪狀病毒接種或攻擊早期，血液中輪狀病毒特異性淋巴增殖反應(yīng)與小腸中淋巴增殖反應(yīng)相關(guān)。而且，大量的淋巴增殖反應(yīng)與輪狀病毒特異性分泌抗體細(xì)胞相關(guān)，這也支持淋巴細(xì)胞增殖量化協(xié)助刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的Th細(xì)胞穿梭的假說（Ward et al.,1996a;Yuan et al.,1996）。

這些研究表明了在PEDV感染的后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的血液中免疫細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞從腸到乳腺穿梭窗口期的重要性。小腸黏膜免疫相關(guān)的免疫因子，像sIgA，是重要的免疫相關(guān)物。關(guān)于PEDV，近期的研究表明接受被動(dòng)乳汁免疫的仔豬，保育豬的排毒量明顯減少。檢測(cè)的仔豬糞便中病毒RNA的載量與乳汁IgA抗體水平之間呈線性關(guān)系。仔豬獲得高滴度的IgA抗體，其糞便中檢出明顯低的PEDV RNA載量。IgA抗體在乳汁免疫和新生仔豬的PEDV被動(dòng)保護(hù)中起到重要作用（Poonsuk et al., Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 47）。近期的研究表明系統(tǒng)性的抗體提供抗PEDV的保護(hù)（Poonsuk et al.,2016）。在這項(xiàng)研究中，2～5日齡新生仔豬分別腹膜內(nèi)注射不同濃度的抗PEDV血清抗體，24 h后接種PEDV病毒，由于循環(huán)系統(tǒng)中PEDV抗體的存在，攻毒仔豬很快恢復(fù)至正常體溫，表現(xiàn)出較PEDV抗體陰性仔豬攻毒后更小的死亡率。然而，通過腹膜內(nèi)的抗血清抗體的注射，仔豬的生長率、PEDV糞便排毒和體液免疫反應(yīng)未提高。系統(tǒng)性抗體在PEDV的清除中起到重要的作用，對(duì)新生仔豬保護(hù)作用最大的是乳汁中母源sIgA。

近來進(jìn)行的一項(xiàng)免疫效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)，在生產(chǎn)單元將即將死亡新生仔豬的小腸返飼給母豬，同時(shí)使用商品化疫苗做平行口服免疫，進(jìn)一步支持上述假設(shè)。在第1個(gè)生產(chǎn)單元A，無PEDV感染的后備母豬和母豬在產(chǎn)前6周和3周分別肌肉注射Harrisvaccines公司PEDV疫苗（iPED）；該疫苗基于α病毒表達(dá)載體技術(shù)通過使用重組馬動(dòng)脈腦炎病毒（VEE）TC-83株復(fù)制子表達(dá)PEDV S糖蛋白來制備。包裹PEDV S RNA的重組VEE病毒顆粒通過感染的Vero細(xì)胞收獲，VEE表達(dá)S基因的復(fù)制子RNA用于疫苗中（Kim et al.,2016）。在生產(chǎn)單元A中，免疫后備母豬和母豬產(chǎn)生低水平或可忽略的血清PEDV IgG抗體和乳汁PEDV中和抗體滴度。第2個(gè)生產(chǎn)單元B，后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬在PEDV暴發(fā)初期于產(chǎn)前4個(gè)月進(jìn)行返飼免疫，這些免疫動(dòng)物乳汁中產(chǎn)生高滴度的PEDV中和抗體，但在血清中未檢測(cè)到PEDV IgG抗體。第3個(gè)生產(chǎn)單元C，生產(chǎn)母豬在農(nóng)場(chǎng)PEDV暴發(fā)初期，給予連續(xù)3 d的返飼免疫，之后分別在血清和乳汁中檢測(cè)到PEDV中和抗體和IgG抗體。這些結(jié)果表明乳汁PEDV中和抗體滴度的成功產(chǎn)生，依賴于生產(chǎn)母豬的經(jīng)口暴露或口服免疫，血清IgG抗體滴度可能與PEDV的免疫不相關(guān)（Bohl et al.,1972; Saif and Bohl,1979;Saif et al.,1972）。Scherba和同事在兩次PEDV暴發(fā)期間，針對(duì)第4個(gè)生產(chǎn)單元D，平行進(jìn)行了產(chǎn)前9周和2周的PEDV免疫和產(chǎn)前8周和2周的返飼免疫，生產(chǎn)單元D生產(chǎn)后經(jīng)歷第3次的PEDV暴發(fā)。在生產(chǎn)單元D中的后備母豬和生產(chǎn)母豬血清PEDV IgG抗體水平超過4周后即減弱，與乳汁中PEDV中和抗體水平不一致，這也表明了針對(duì)PEDV的血清IgG抗體和乳汁PEDV中和抗體滴度之間缺乏相關(guān)性（Scherba et al.,2016）。同時(shí)設(shè)置的對(duì)照單元，3頭后備母豬既不免疫也不感染，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，與上述分組在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣。這項(xiàng)研究中，缺少對(duì)血清和乳汁中PEDV IgA抗體水平的分析，缺乏對(duì)隨后PEDV暴發(fā)的仔豬死亡率和保護(hù)率的報(bào)道，因這項(xiàng)研究在生產(chǎn)豬群進(jìn)行，仔豬攻毒研究不可能開展。有必要注明：因?yàn)樯a(chǎn)單元B-D經(jīng)歷過PEDV暴發(fā)，外加返飼免疫，使得每個(gè)生產(chǎn)單元的動(dòng)物攝入不同劑量PEDV，其中病毒量依賴于生產(chǎn)單元管理實(shí)踐和環(huán)境病毒載量；作者闡述生產(chǎn)單元A是無PEDV感染，無血清學(xué)數(shù)據(jù)來證實(shí)。

3.2 中和抗體、PEDV疫苗和仔豬被動(dòng)保護(hù)

病毒感染后產(chǎn)生中和抗體，抗體多變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)必須結(jié)合與病毒中和相關(guān)的抗原表位。抗體中和的機(jī)制包括病毒感染周期各部分的抑制作用，包括細(xì)胞表面結(jié)合、融合、穿入、胞吞作用、病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制（Klasse and Sattentau,2002）。對(duì)于一些獲批的疫苗產(chǎn)品，中和抗體與疫苗效力質(zhì)量相關(guān)（Zinkernagel,2001）。PEDV為α病毒，包括至少7個(gè)ORF，編碼4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白，S（Spike）蛋白，E（envelope）蛋白，M（membrane）蛋白，N（nucleocapsid）蛋白和由ORF3基因編碼的輔助蛋白（Huang et al., 2013）。S蛋白形成棘突，位于N蛋白外圍，包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域S1和S2。S1結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞受體結(jié)合相關(guān)，S2蛋白介導(dǎo)病毒的膜融合和穿入細(xì)胞（Bosch et al., 2003;Sturman et al.,1985;Wicht et al.,2014）。對(duì)于TGEV而言，S1結(jié)構(gòu)域是病毒中和抗體的有效誘導(dǎo)部位，對(duì)仔豬的保護(hù)至關(guān)重要。對(duì)于PEDV S1蛋白的研究表明S1D（aa636-789）結(jié)構(gòu)域與PEDV抗血清反應(yīng)，引起小鼠產(chǎn)生PEDV中和抗體（Sun et al., 2007）。此外，使用S1蛋白的特異性卵黃抗體IgY口服免疫新生仔豬可獲得對(duì)PEDV攻擊的保護(hù)（Kweon et al.,2000）。然而，由于缺少使用非特異性抗體IgY免疫后攻毒對(duì)照，非免疫IgY是否也介導(dǎo)被動(dòng)免疫保護(hù)并不清楚。S1蛋白誘導(dǎo)中和抗體的能力，在不同的冠狀病毒之間是保守的，包括β冠狀病毒屬SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(Sui et al.,2004;Yu et al.,2015)。S1蛋白刺激中和抗體產(chǎn)生的能力使其可作為PEDV腸道免疫啟動(dòng)后的加強(qiáng)疫苗使用（Park et al.,1998）。sIgA通過結(jié)合PEDV S蛋白胞外結(jié)構(gòu)域（受體結(jié)合亞單位S1和膜融合亞單位S2）來抑制病毒細(xì)胞穿入和感染。因此，在新生仔豬腸腔中足量sIgA對(duì)于預(yù)防PEDV感染和致死非常重要。DR13株疫苗經(jīng)口服途徑較肌注途徑免疫母豬提供給仔豬更多被動(dòng)保護(hù)效果（仔豬死亡分別為13%和60%）（Song et al., 2007）。該研究結(jié)果表明了“腸-乳腺-sIgA軸”循環(huán)。經(jīng)口服途徑較肌注途徑免疫分娩階段懷孕母豬，其血清中表現(xiàn)出增加的PEDV IgA抗體水平。兩種免疫途徑免疫母豬的血清中和抗體滴度無差異?？诜緩矫庖叩哪肛i較肌注途徑免疫的母豬表現(xiàn)出初乳中增加的PEDV中和抗體滴度。初乳中增加的PEDV中和抗體滴度與血清中增加的IgA抗體相關(guān)，口服途徑免疫母豬后所產(chǎn)3日齡仔豬血清中展現(xiàn)增加的中和抗體滴度。這些結(jié)果表明針對(duì)于DR13株疫苗來說，通過口服途徑誘導(dǎo)的母豬初乳或乳汁中和抗體滴度可更好的反映仔豬保護(hù)效果。比起系統(tǒng)性的抗體水平，與保護(hù)性免疫相關(guān)的初乳/乳汁抗體是更合理決定疫苗效果的診斷工具。

3.3 抗體分泌細(xì)胞

先前描述到，腸源的IgA ASC在血清中短暫運(yùn)輸，可能是與腸感染免疫相關(guān)。選2組仔豬分別用PEDV強(qiáng)毒株和弱毒株免疫，僅強(qiáng)毒株免疫仔豬在血液、小腸和脾臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性ASC。經(jīng)PEDV攻毒后，使用強(qiáng)毒株免疫仔豬較弱毒株免疫仔豬在腸道中產(chǎn)生增加的IgG抗體和IgA ASC。在腸淋巴組織和血液中抗體分泌細(xì)胞（ASC）和保護(hù)之間存在強(qiáng)的正相關(guān)性（de Arriba et al.,2002）。在臨床中，懷孕母豬PEDV感染后1個(gè)月腸道中檢測(cè)到IgA和IgG PEDV特異性ASC。在PEDV暴露6個(gè)月后，母豬腸道中ASC數(shù)量減少但仍可檢測(cè)到（Ouyang et al.,2015）。然而，近期研究未在血液中檢測(cè)到PEDV特異性ASC穿梭。此外，在不同農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的已被PEDV感染動(dòng)物，可能在初次感染和屠宰的時(shí)間段再次受不同劑量的PEDV感染。在可控的環(huán)境條件下，需要進(jìn)一步檢測(cè)感染動(dòng)物和PEDV攻毒仔豬的乳汁免疫和死亡率。還需要進(jìn)一步血液分析來證實(shí)血清PEDV特異性ASC與乳汁保護(hù)的相關(guān)性。

4 預(yù)防流行性PEDV和TGEV的疫苗免疫策略

通過母源免疫策略誘導(dǎo)乳汁免疫來抑制TGEV感染的策略（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J, Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）?？蓱?yīng)用于新出現(xiàn)的PEDV感染?？偨Y(jié)前期研究成果，僅使用弱毒口服TGEV疫苗經(jīng)過多倍劑量接種懷孕母豬（通常在產(chǎn)前5～6周和2～3周進(jìn)行2次接種）誘導(dǎo)乳汁中產(chǎn)生sIgA抗體和變化的被動(dòng)保護(hù)率。然而，弱毒株免疫母豬較強(qiáng)毒株免疫母豬產(chǎn)生較低的乳汁sIgA抗體水平和仔豬保護(hù)率。導(dǎo)致差異原因包括疫苗中較低的病毒量和胃腸道穩(wěn)態(tài)的喪失，以及病毒致弱后在母豬腸道復(fù)制能力。在免疫母豬所產(chǎn)仔豬TGEV攻毒保護(hù)研究中，如果疫苗在母豬腸道中誘導(dǎo)主動(dòng)免疫失敗，母豬發(fā)病，表現(xiàn)腹瀉或食欲減退和停止乳汁產(chǎn)生，哺乳仔豬表現(xiàn)高死亡率（Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。因此，誘導(dǎo)有效黏膜免疫的TGEV或PEDV母源疫苗對(duì)于保護(hù)母豬腸道是至關(guān)重要的。先前提到，使用滅活TGEV疫苗經(jīng)非口途徑免疫不能誘導(dǎo)黏膜免疫，在血清和初乳中主要是系統(tǒng)性的IgG抗體占主導(dǎo)地位，其在乳汁中很快下降，提供給仔豬微不足道（很?。┑娜橹庖摺＠獾氖?，如果血清中誘導(dǎo)產(chǎn)生的高水平IgG抗體滲入初乳中，其在乳汁中高水平維持可保護(hù)新生仔豬度過第1周。通過肌注滅活或活的PEDV疫苗是否能夠刺激母豬產(chǎn)生針對(duì)PEDV的足夠免疫保護(hù)，Paudel等（2014）在母豬中評(píng)價(jià)了4組疫苗組合的免疫效果，包括非免疫對(duì)照組，滅活疫苗免疫組（兩次免疫，K/K），活疫苗免疫組（兩次免疫，L/L）和活疫苗、滅活疫苗免疫組（活疫苗首免，滅活疫苗加強(qiáng)免疫，L/K）。所有免疫采用肌注途徑，分別在產(chǎn)前4周和2周進(jìn)行。母豬經(jīng)ELISA抗體檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)為PEDV陰性（糞便檢測(cè)）。研究表明：K/K組母豬血清、初乳和仔豬血清中有更高的IgG和IgA抗體滴度和中和活性，L/L組水平最低。由于活疫苗的肌肉注射途徑，病毒不太可能到達(dá)腸道，從而在大多數(shù)母豬的小腸上皮細(xì)胞復(fù)制。這項(xiàng)研究結(jié)果可提供關(guān)于疫苗免疫原性的資料，但是不能反映經(jīng)口途徑感染PEDV后的免疫反應(yīng)。此外，還需要進(jìn)行仔豬PEDV攻毒保護(hù)試驗(yàn)來確證K/K免疫組提供給仔豬充足的乳汁免疫和對(duì)發(fā)病仔豬的有效保護(hù)（Paudel et al.,2014）。

4.1 關(guān)于母源疫苗設(shè)計(jì)和返飼途徑中IgA免疫細(xì)胞從腸到乳腺靶向歸巢的實(shí)際情況

IgA免疫細(xì)胞從腸至乳腺歸巢的時(shí)間和機(jī)制，與疫苗免疫方法，豬群免疫狀態(tài)的相關(guān)性，尚存在許多未解問題。關(guān)于使妊娠母豬產(chǎn)生足夠乳汁免疫的最佳疫苗免疫時(shí)間或間隔的研究很少。也沒有關(guān)于經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的疫苗免疫反應(yīng)比較的詳細(xì)研究。對(duì)于經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬來說，妊娠期間“腸-乳腺-sIgA軸”何時(shí)啟動(dòng)是一個(gè)重要問題，青春前期后備母豬是否能通過暴露于病毒后誘導(dǎo)。在第一項(xiàng)研究中，使用US PEDV分離毒株進(jìn)行試驗(yàn)，使用自然感染PEDV SINDEL弱毒株豬群的4頭母豬（平均胎次5.4），農(nóng)場(chǎng)中母豬自然感染臨床分離的活病毒株。7個(gè)月后，這些母豬轉(zhuǎn)入隔離設(shè)施，在妊娠109 d，試驗(yàn)條件下再次接觸更強(qiáng)的PEDV分離毒株。產(chǎn)后3日齡仔豬，給予口服接種強(qiáng)毒，記錄攻毒后4 d內(nèi)仔豬的存活情況。在PEDV陽性豬群組，攻毒后所有仔豬全部存活，無感染豬群組攻毒后死亡率為33%（Goede et al.,2015）。這個(gè)研究表明：豬場(chǎng)經(jīng)產(chǎn)母豬能夠產(chǎn)生乳汁免疫，但是攻毒仔豬保護(hù)效果不完全，在4窩豬中變化不定，這也提示有許多影響因素。新近報(bào)道，研究者對(duì)接觸病毒后母豬進(jìn)行了至少5個(gè)月PEDV血清抗體滴度檢測(cè)。有必要對(duì)性成熟或妊娠前后備母豬感染PEDV后所產(chǎn)仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，以便確定后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬乳汁免疫的誘導(dǎo)效果和仔豬被動(dòng)免疫的相關(guān)性（Schelkopf et al.,Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting,page 309）。另一個(gè)重要問題，在后備母豬/經(jīng)產(chǎn)母豬腸道中病毒復(fù)制的劑量和區(qū)域如何影響乳汁中IgA抗體誘導(dǎo)，是否乳汁IgA抗體對(duì)預(yù)防仔豬PEDV感染足夠。如同在TGEV疫苗研究中闡述，在設(shè)計(jì)母源疫苗和返飼方式時(shí)，應(yīng)該考慮到經(jīng)產(chǎn)母豬腸道PEDV復(fù)制，或者使用PEDV弱毒疫苗，要考慮誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生抗原的穩(wěn)定性和免疫原性。

4.2 豬群PEDV狀態(tài)

根據(jù)PEDV感染，抗體水平和臨床癥狀，可將豬群分成3種狀態(tài)。PEDV陰性豬群為無PEDV感染；PEDV活動(dòng)豬群為RT-qPCR檢測(cè)到病毒并表現(xiàn)臨床發(fā)病豬群；PEDV穩(wěn)定豬群為之前感染過PEDV，之后不表現(xiàn)臨床疾病，基于RT-qPCR檢測(cè)的PEDV糞便檢測(cè)為陰性，部分或全部母豬PEDV抗體陽性。在美國PEDV感染的第4年初，PEDV活動(dòng)豬群可能是在流行早期之前感染豬群。其臨床疾病沒有首次感染豬群廣泛，表明PEDV首次感染豬群中經(jīng)產(chǎn)母豬的母源免疫缺乏（Goede and Morrison,2016）（Proceedingsofthe2016 AASV Annual Meeting:Hough, S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。從2013—2014年年底之后，在美國新發(fā)PEDV病例明顯減少，但仍出現(xiàn)PEDV陰性豬群首次感染的偶發(fā)病例，如同在2013年首次報(bào)道一樣，豬場(chǎng)經(jīng)歷明顯的經(jīng)濟(jì)損失（https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animal health/animal-disease-information/swine disease-information/ct_ped_info）。對(duì)豬群不同狀態(tài)的描述可為針對(duì)PEDV的控制策略提供一定依據(jù)。然而，由于美國大多數(shù)豬采用多點(diǎn)式生產(chǎn)方式飼養(yǎng)，這些豬來源于包括超過1 000頭共舍的經(jīng)產(chǎn)母豬場(chǎng)。此外，在一些飼養(yǎng)點(diǎn)，大的母豬舍分布密集。相反，更多傳統(tǒng)的生產(chǎn)-肥育飼養(yǎng)場(chǎng)，在其所有飼養(yǎng)點(diǎn)上包含相對(duì)少量的母豬數(shù)量。在豬群飼養(yǎng)管理方面的多樣性導(dǎo)致了多個(gè)豬病的混合感染流行，對(duì)于PEDV來說，這種情況尤其受影響。

4.3 返飼方法

起初，通過將整個(gè)豬群暴露于污染材料或返飼（如感染仔豬糞便和腸組織）的方式來激發(fā)PEDV的主動(dòng)免疫，從而達(dá)到控制PED的目的（https://www. aasv.org/）。使母豬產(chǎn)生針對(duì)PEDV的免疫保護(hù)，且通過初乳或乳汁轉(zhuǎn)移給仔豬，使仔豬在最易感染階段，獲得有效保護(hù)。從臨床發(fā)病率明顯下降角度來看，返飼策略似乎起到很好作用，但并不是100%有效（Goede and Morrison,2016）。返飼實(shí)踐中，減少或消除臨床疾病過程產(chǎn)生的明顯不足是控制感染后母豬免疫的持續(xù)時(shí)間和質(zhì)量問題。此外，將大量豬群暴露于病毒所帶來的問題，返飼用生物材料的質(zhì)量問題，返飼人員實(shí)際操作存在的問題。涉及多種返飼的改進(jìn)策略，在確保所有母豬至少1次暴露給感染病毒的目標(biāo)下，在超過2周時(shí)間內(nèi)，使所有經(jīng)產(chǎn)母豬返飼2～3次（https://www.aasv.org/pedv/Conceptsforherdexposure 121713.pdf）。這種方式明顯改善了一些豬場(chǎng)條件，但仍有低水平臨床病例報(bào)告，這也說明一些繁殖豬群通過返飼方式來獲得免疫并不可行。或者，盡管母豬用感染野毒的方式獲得免疫，但仔豬仍然受侵襲，原因?yàn)椋?）母豬免疫的持續(xù)期或等級(jí)不夠；2）臨近生產(chǎn)階段，返飼使用的病毒致病性太強(qiáng)導(dǎo)致經(jīng)產(chǎn)母豬在產(chǎn)房大量病毒所致。這些結(jié)果突出顯示了對(duì)母豬乳汁免疫影響因素和哺乳仔豬被動(dòng)免疫保護(hù)相關(guān)因素了解缺乏。返飼失敗也可能與弱毒疫苗有相似的問題：1）病毒含量太低；2）材料的不當(dāng)儲(chǔ)存；3）豬體已有的免疫阻斷了腸道中病毒復(fù)制；4）妊娠階段返飼時(shí)間的選擇影響了乳汁免疫效果（Ackerman M,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 421）。

4.4 豬群大小影響PEDV感染的持續(xù)性

隨著US PEDV流行進(jìn)行第4年，發(fā)表了很多的臨床病例報(bào)告（Goede and Morrison,2016）（Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting:Hough,S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。有研究表明在疫病暴發(fā)的急性期，返飼策略幫助許多的農(nóng)場(chǎng)減少了損失，其對(duì)將來疾病的發(fā)生起到了預(yù)防作用（比如，PEDV穩(wěn)定豬群）。然而，也有一些農(nóng)場(chǎng)返飼實(shí)踐中存在控制疾病的困難期（PEDV活躍豬群）。小豬群的陰性狀態(tài)可能歸咎于較少污染的運(yùn)輸工具、工人衣服和輸入豬群。較小豬場(chǎng)比起大型豬場(chǎng)，工人易于監(jiān)督管理，地理位置上更容易分隔開，大豬場(chǎng)相對(duì)更集中。

現(xiàn)階段，在美國無PEDV感染豬群反映了其嚴(yán)格堅(jiān)持的生物安全實(shí)踐；PEDV穩(wěn)定豬群表明感染豬群如何消除PEDV和維持無病毒感染；PEDV活躍豬群通常是單個(gè)疫點(diǎn)大群發(fā)病，從農(nóng)場(chǎng)中消除病毒很困難。這種地方流行性PEDV感染可能反映出經(jīng)產(chǎn)母豬群缺乏的免疫，而不是存在一種特定的可再感染母豬的環(huán)境穩(wěn)定病毒。所有PEDV分離株理化特性相似，對(duì)消毒劑、脫水劑等有相同易感性。因此，農(nóng)場(chǎng)之間的差異與農(nóng)場(chǎng)特定的活動(dòng)和返飼方法相關(guān)，而不是由于新病毒株的出現(xiàn)。PEDV穩(wěn)定場(chǎng)典型特點(diǎn)是較小，比大豬場(chǎng)更可能徹底凈化。此外，對(duì)感染性PEDV病毒在糞漿（http://www.pork.org/wpcontent/uploads/2014/05/goyal-13-215-main.pdf）和儲(chǔ)糞池（Tun et al.,2016）中長期檢測(cè)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其可能作為再感染的潛在貯存庫，在大農(nóng)場(chǎng)和小農(nóng)場(chǎng)對(duì)糞便的處理方式的不同決定了PEDV穩(wěn)定群和活躍群之間的差異?！叭M(jìn)全出”的管理實(shí)踐活動(dòng)中，由于連續(xù)的母豬分娩，新生仔豬持續(xù)出生也一定程度影響PEDV在豬群中的傳播和持續(xù)性。豬群還易通過污染的飼料感染。有研究報(bào)告和試驗(yàn)表明在許多無感染農(nóng)場(chǎng)可能是通過污染飼料發(fā)生了PEDV感染（Bowman et al.,2015;Deet et al.,2014;Dee et al.,2016;Kochhar,2014），也有關(guān)于PEDV流行起源于中國的假設(shè)報(bào)道（Huang et al.,2013）。

5 在血清陽性豬群中通過首次/加強(qiáng)母源免疫的策略來增強(qiáng)仔豬保護(hù)（針對(duì)于地方流行的TGEV和PEDV）

腸道病毒疫苗研究包括TGEV和輪狀病毒，兒童脊髓灰質(zhì)炎病毒（Jafari et al.,2014;John et al., 2014）中，提出自然感染或口服免疫的方式進(jìn)行首次免疫，而后選用非口途徑的亞單位或滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，能夠增強(qiáng)或保持黏膜或乳汁免疫效果。經(jīng)口首免/非口途徑加強(qiáng)免疫的策略可解釋為何這些非口服疫苗在TGEV或輪狀病毒感染或使用口服弱毒疫苗的母豬中是有效的（Saif,1999;Saif et al., 2012）。例如，非口途徑免疫TGEV S蛋白亞單位疫苗（包含病毒中和表位），單獨(dú)接種血清陰性的懷孕母豬無法誘導(dǎo)乳汁IgA抗體的產(chǎn)生和對(duì)仔豬的被動(dòng)保護(hù)（Shoup et al.,1997）。然而，當(dāng)作為口服首免母豬的加強(qiáng)免疫用疫苗時(shí)，S蛋白單位疫苗或滅活的TGEV疫苗增強(qiáng)了乳汁sIgA抗體滴度和被動(dòng)保護(hù)效果（Park et al.,1998）。單獨(dú)使用滅活輪狀病毒顆粒疫苗不能誘導(dǎo)腸道sIgA抗體和對(duì)仔豬的有效保護(hù)，而在使用活疫苗首免后的加強(qiáng)免疫后，產(chǎn)生比口服弱毒輪狀病毒活疫苗加強(qiáng)的免疫效果（Azevedo et al.,2013）。乳汁免疫和仔豬免疫保護(hù)均可通過使用口服首免活疫苗、非口途徑滅活疫苗加強(qiáng)免疫的方式來增強(qiáng)。腸黏膜病毒復(fù)制刺激影響經(jīng)由“腸-乳腺-sIgA軸”的乳汁免疫。這種模式系統(tǒng)也適用于PEDV，也需要類似的母源免疫策略“腸-乳腺-sIgA軸”啟動(dòng)和仔豬保護(hù)效果。近期研究人員分別給無PEDV感染的懷孕母豬和感染過PEDV的懷孕母豬在產(chǎn)前5周和2周進(jìn)行肌注滅活疫苗，進(jìn)而比較兩種母豬的免疫效果。陰性對(duì)照母豬使用RT-PCR檢測(cè)為陰性，無血清學(xué)數(shù)據(jù)。使用1日齡PEDV感染仔豬的糞便，稀釋至PCR Ct19，對(duì)所有5日齡仔豬進(jìn)行口服攻擊。研究表明，相比無感染母豬，先前接觸過PEDV的母豬血清和乳汁中PEDV IgA抗體水平明顯增加，在兩組母豬中使用滅活疫苗接種均未產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫效果；滅活疫苗刺激產(chǎn)生的血清IgG抗體滴度明顯增加，無論是無感染母豬還是感染過病毒母豬其血清或乳汁IgA抗體滴度沒有明顯增加。仔豬死亡率與初乳和乳汁中PEDV IgA抗體滴度相關(guān)，先前接觸過病毒的母豬，在初乳和乳汁中檢測(cè)到IgA抗體，其豬窩中仔豬沒有發(fā)生死亡；而來自于無感染豬群母豬所產(chǎn)仔豬表現(xiàn)高的死亡率。這也提議在管理試驗(yàn)時(shí)間和條件下，無論是無感染母豬還是感染過病原母豬，滅活疫苗作為初次免疫或加強(qiáng)免疫對(duì)于誘導(dǎo)乳汁免疫無效（Schwartz et al.,Proceedingsofthe2016AASVAnnualMeeting,page363-366）。

6 PEDV疫苗：過去和現(xiàn)在

在20世紀(jì)80至90年代的歐洲，由于PEDV暴發(fā)明顯減少，對(duì)于PEDV疫苗的研究主要集中在PEDV強(qiáng)毒株暴發(fā)引起巨大經(jīng)濟(jì)影響的亞洲國家。1999年以后，中國主要使用PEDV和TGEV二聯(lián)滅活疫苗（Ma et al.,1995）。2003—2006年，豬群使用PEDV弱毒疫苗。這些疫苗中，尤其是TGEV/PEDV二聯(lián)滅活疫苗被廣泛用來控制PEDV感染。隨著2010年出現(xiàn)了毒力更強(qiáng)的PEDV毒株，也迫切需要更有效的疫苗來控制新疫病的暴發(fā)。在2010年暴發(fā)PEDV期間，疫苗誘導(dǎo)仔豬免疫保護(hù)的缺乏可能是高毒力新毒株與經(jīng)典PEDV毒株的基因遺傳分析差異所致，經(jīng)典毒株和高毒力的新毒株之間誘導(dǎo)交叉中和抗體（Lin et al.,2015;Song et al.,2015）。為獲得更有效的疫苗，2014年12月TGEV、PEDV、RoV三聯(lián)活疫苗獲批上市（Song et al.,2015）。據(jù)報(bào)道在試驗(yàn)豬場(chǎng)該產(chǎn)品表現(xiàn)出增強(qiáng)的保護(hù)率，但是關(guān)于效力和免疫機(jī)制相關(guān)的研究資料未公開。韓國從2004年開始使用PEDV弱毒疫苗進(jìn)行口服免疫，PEDV DR13株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代至100代，整個(gè)致弱過程中通過限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）確定了毒株中9個(gè)核苷酸的改變和ORF3基因序列的變異（Song and Park,2012）。在日本，1997年之后，一直使用細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的商品化弱毒疫苗（P-5V）。這些疫苗是有效的，但是并不是所有免疫母豬均獲得了穩(wěn)固的乳汁免疫（Song et al.,2015）。一些關(guān)于影響乳汁免疫效果低的因素包括疫苗中使用的優(yōu)勢(shì)抗原、抗原穩(wěn)定性、抗原劑量、免疫途徑，以及先前討論的一些其它參數(shù)。自2013年P(guān)EDV暴發(fā)以來，美國批準(zhǔn)了兩個(gè)PEDV疫苗產(chǎn)品，第一個(gè)疫苗由Harrisvaccines開發(fā)，其基于α病毒表達(dá)載體技術(shù)（Vander Veen et al., 2012）。2013年第一代疫苗（iPED）在限制使用條件下獲準(zhǔn)上市，2014年1月第二代疫苗（iPED+）獲準(zhǔn)上市。iPED+疫苗較iPED疫苗而言，結(jié)合了更長S基因片段，該產(chǎn)品標(biāo)注給經(jīng)產(chǎn)母豬或后備母豬分娩前肌注1頭份。第二個(gè)疫苗Zoetis公司開發(fā)了滅活疫苗（Florham Park,New Jersey,Study Report No.B826RUS-13-258,Zoetis Inc.），該產(chǎn)品給經(jīng)產(chǎn)母豬或后備母豬分娩前肌注2頭份。雖然這兩個(gè)疫苗在美國使用，但也缺乏田間效力和免疫相關(guān)的公開數(shù)據(jù)。需要在試驗(yàn)場(chǎng)和現(xiàn)地豬場(chǎng)進(jìn)行更多研究來確定這些疫苗的效果，以鑒定哺乳仔豬免疫保護(hù)關(guān)系。

7 結(jié)論

充足的乳汁免疫對(duì)于哺乳仔豬被動(dòng)獲得對(duì)PEDV感染的保護(hù)是必需的。雖從TGEV的母源預(yù)防效果中獲得許多了解，豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）的出現(xiàn)誘導(dǎo)了針對(duì)TGEV的交叉保護(hù)，使得沒有更進(jìn)一步對(duì)“腸-乳腺-sIgA軸”和乳汁免疫機(jī)制相關(guān)變量進(jìn)行詳細(xì)研究。目前研究表明，初乳和乳汁IgA和PEDV中和抗體滴度可能與PEDV保護(hù)性免疫相關(guān)。研究表明，在乳汁分泌物中，充足的IgA和PEDV中和抗體滴度可能依賴于母豬腸道中病毒的劑量和病毒復(fù)制區(qū)域。關(guān)于“腸-乳腺-sIgA軸”誘導(dǎo)和維持的機(jī)制仍有很多未知之處。在現(xiàn)地豬場(chǎng)，很多因素導(dǎo)致了疫苗免疫失敗，尤其是經(jīng)過返飼操作?，F(xiàn)地觀察結(jié)果和在亞洲國家的疫苗免疫接種試驗(yàn)中觀察到缺乏的乳汁免疫問題，進(jìn)一步突出我們對(duì)影響乳汁免疫誘導(dǎo)因素了解的欠缺，這些因素包括接種劑量，毒株免疫原性，疫苗病毒抗原，經(jīng)產(chǎn)母豬/后備母豬日齡和疫苗接種時(shí)妊娠階段動(dòng)物性成熟程度等。我們開發(fā)疫苗的策略必須是靶向應(yīng)答最強(qiáng)的懷孕或泌乳母豬，鑒定影響乳汁免疫的因素有利于改善妊娠豬群PEDV疫苗和其它腸道病原疫苗的免疫計(jì)劃，有利于改善整個(gè)豬群的免疫力和豬場(chǎng)生產(chǎn)效力。

（編輯：郭玉翠）

S828

A

1002-1957(2017)01-0033-08

2016-12-02收稿，2016-12-20修回

呂茂杰（1982-），男，山西靜樂人，博士，主要從事獸用疫苗的研究和開發(fā)工作.E-mail：lvmaojie650@sina.com

校者簡介：楊保收（1962-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)生物技術(shù)與疫苗開發(fā).E-mail：bsyang@ringpu.com