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    TIMP1基因?qū)Ψ窝祖溓蚓T導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞HEPApiC凋亡的影響及機(jī)制研究

    2020-01-01 02:15:22常大蕓劉學(xué)工李寧華王曉麗戴蕾蓮王曉輝王義濤
    臨床肺科雜志 2020年1期
    關(guān)鍵詞:鏈球菌空白對照肺泡

    常大蕓 劉學(xué)工 李寧華 王曉麗 戴蕾蓮 王曉輝 王義濤

    肺炎是指由微生物(細(xì)菌,病毒或真菌)、物理和化學(xué)因素、免疫損傷、過敏或藥物等引起的下呼吸道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥。細(xì)菌性肺炎是最常見的肺炎形式之一,也是最常見的傳染病之一[1]。許多類型的細(xì)菌可能引起細(xì)菌性肺炎,包括肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌等。肺炎鏈球菌是引起肺炎的最常見原因,而這種病理在5歲以下及65歲以上的患者中更為嚴(yán)重。在嬰兒和老年人中,細(xì)菌性肺炎仍然是致命的肺病[2-3]。因此,更好地了解肺炎的發(fā)病機(jī)制可能有助于制定有效的治療策略?;|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)基因?qū)儆赥IMPs家族成員之一,其主要功能是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,并抑制其降解[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),TIMP1在呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。如王愛華等[5]人報(bào)道,在支氣管哮喘小鼠組織中TIMP-1異常表達(dá);余霓雯等[6]研究指出,TIMP-1參與慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)的進(jìn)展;但TIMP-1在肺炎中的研究相對較少。近期研究發(fā)現(xiàn)[7],TIMP-1在嬰幼兒重癥肺炎外周血血清中呈高表達(dá),提示TIMP-1的表達(dá)量可能作為判斷肺炎的預(yù)后指標(biāo)。然而,關(guān)于TIMP-1在細(xì)菌性肺炎中的作用機(jī)制尚不十分清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以肺炎鏈球菌干預(yù)肺泡上皮細(xì)胞HEPApiC模擬細(xì)菌性肺炎體外模型,探究TIMP-1基因?qū)Ψ窝祖溓蚓T導(dǎo)的HEPApiC細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制,以期為細(xì)菌性肺炎治療提供新的思路。

    資料與方法

    一、材料

    人肺泡上皮細(xì)胞HEPApiC、肺炎鏈球菌R6(美國ATCC細(xì)胞庫);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司);Trizol試劑、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司);SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司);CCK-8試劑、RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所);Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司);BCA蛋白檢測試劑盒(武漢云克隆動物有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司);TIMP1 siRNA及對照siRNA control(上海吉瑪制藥有限公司);TIMP1 抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體及二抗(美國Abcam公司);TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

    二、細(xì)胞培養(yǎng)

    人肺泡上皮細(xì)胞HEPApiC培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基中,其中含有10%胎牛血清,放置在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中,細(xì)胞貼壁生長,待細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時,使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),對數(shù)生長期的HEPApiC細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    三、細(xì)胞處理和分組

    對數(shù)生長期的HEPApiC細(xì)胞接種到6孔板中,置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),將HEPApiC細(xì)胞分為4組,空白對照組、感染組、陰性對照組和干擾組。其中空白對照組是未做任何處理的HEPApiC細(xì)胞;感染組是HEPApiC細(xì)胞生長匯合度達(dá)90%時加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染;陰性對照組是HEPApiC細(xì)胞生長匯合度達(dá)50%時以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA control,轉(zhuǎn)染48 h后加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染;轉(zhuǎn)染組是HEPApiC細(xì)胞生長匯合度達(dá)50%時以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染TIMP1 siRNA,轉(zhuǎn)染48 h后加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染。轉(zhuǎn)染具體操作步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

    四、QPCR檢測

    各組HEPApiC細(xì)胞干預(yù)48 h后,分別收集各組細(xì)胞,根據(jù)Trizol試劑使用說明書提取各組HEPApiC細(xì)胞中總RNA,測定RNA的純度和濃度,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并使用SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒,以cDNA為模板進(jìn)行QPCR檢測。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組HEPApiC細(xì)胞中TIMP1 mRNA相對表達(dá)水平。

    五、Western blot檢測

    分別收集處理48 h后各組HEPApiC細(xì)胞,分別加入RIPA裂解液在冰上提取細(xì)胞中總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度,取等量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,待蛋白分離后切斷電源,將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,將膜放置在5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封阻2 h。TBST洗膜后分別加入相應(yīng)一抗(TIMP1一抗為1∶500稀釋、Bcl-2一抗為1∶800稀釋、Bax一抗為1∶800稀釋),4 ℃雜交過夜,TBST洗膜后再加入1∶2000稀釋的二抗,室溫雜交2 h,TBST洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液,顯影、定影,經(jīng)成像系統(tǒng)掃描,采用Quantity One軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

    六、CCK-8法檢測

    將HEPApiC細(xì)胞以3×103個/孔接種到96孔板中,放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),根據(jù)上述1.3方法分組和處理,分別在24、48、72 h采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力,簡言之,在各個時間點(diǎn)向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8溶液,37℃繼續(xù)孵育4 h,使用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處光密度值(A值),計(jì)算細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

    七、流式細(xì)胞術(shù)檢測

    各組HEPApiC細(xì)胞處理48 h,采用0.25胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心并收集。使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,向細(xì)胞中加入100 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,依次向細(xì)胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL,輕輕混勻,室溫下避光反應(yīng)15 min,再向細(xì)胞懸液中加入400 μL 1×Binding Buffer,隨即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

    八、ELISA檢測

    分別處理48 h的各組HEPApiC細(xì)胞上清液,分別采用TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒測定上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,具體操作步驟參照ELISA檢測試劑盒說明書。

    九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、各組HEPApiC細(xì)胞中TIMP1的表達(dá)水平

    QPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細(xì)胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.05);轉(zhuǎn)染TIMP1 siRNA后HEPApiC細(xì)胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對照組和感染組(P<0.05);感染組和陰性對照組相比較,細(xì)胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)(見圖1、表1)。

    圖1 Western blot檢測各組HEPApiC細(xì)胞中TIMP1蛋白表達(dá)情況

    表1 各組HEPApiC細(xì)胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

    注:與空白對照組比,*P<0.05;與感染組比,&P<0.05;與陰性對照組比,#P<0.05

    二、敲低TIMP1基因表達(dá)對HEPApiC細(xì)胞活力的影響

    CCK-8檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細(xì)胞活力明顯低于空白對照組(P<0.05);敲低TIMP1后HEPApiC細(xì)胞活力高于陰性對照組和感染組(P<0.05);而感染組和陰性對照組相比較,細(xì)胞活力差異不顯著(P>0.05)(見表2)。

    三、敲低TIMP1基因表達(dá)對HEPApiC細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05);敲低TIMP1后HEPApiC細(xì)胞凋亡率明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05);而感染組和陰性對照組相比較,細(xì)胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)(見圖2、表3)。

    四、敲低TIMP1基因表達(dá)對HEPApiC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

    Western blot檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對照組(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.05);敲低TIMP1后HEPApiC細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組和感染組(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05);而感染組和陰性對照組相比較,細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)(見圖3、表4)。

    表2 CCK-8檢測各組HEPApiC細(xì)胞活力

    注:與空白對照組比,*P<0.05;與感染組比,&P<0.05;與陰性對照組比,#P<0.05

    圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HEPApiC細(xì)胞凋亡情況

    表3 各組HEPApiC細(xì)胞凋亡率比較

    注:與空白對照組比,*P<0.05;與感染組比,&P<0.05;與陰性對照組比,#P<0.05

    圖3 Western blot檢測各組HEPApiC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平

    表4 各組HEPApiC細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白水平比較

    注:與空白對照組比,*P<0.05;與感染組比,&P<0.05;與陰性對照組比,#P<0.05

    五、敲低TIMP1基因表達(dá)對炎癥因子表達(dá)的影響

    ELISA檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于空白對照組(P<0.05);敲低TIMP1后HEPApiC細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05);而感染組和陰性對照組相比較,細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量差異不顯著(P>0.05)(見表5)。

    表5 ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

    注:與空白對照組比,*P<0.05;與感染組比,&P<0.05;與陰性對照組比,#P<0.05

    討 論

    根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),肺炎每年造成約160萬人死亡,已成為全世界主要公共衛(wèi)生問題[8]。估計(jì)有90%的肺炎相關(guān)死亡發(fā)生在發(fā)展中國家,革蘭氏陽性菌如肺炎鏈球菌引起的肺炎占所有重癥肺炎病例的很大一部分[9-10]。肺炎發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞作為肺組織肺泡屏障功能的細(xì)胞與肺炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。研究表明,TIMP-1基因在調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育及生理病理等過程均發(fā)揮重要功能。最近Mammen等人的結(jié)果顯示,TIMP-1缺乏導(dǎo)致小鼠哮喘表型,表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性,增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和T輔助細(xì)胞2型細(xì)胞因子基因和蛋白質(zhì)表達(dá)卵清蛋白致敏;從TIMP-1敲除小鼠過敏性哮喘模型分離的肺組織中檢測發(fā)現(xiàn)炎癥因子的表達(dá)顯著增加[13]。Wu等研究顯示,IL-33可通過誘導(dǎo)MMP-9和TIMP-1之間的失衡來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積并促進(jìn)肺纖維化過程[14]。Wills報(bào)道指出,在TIMP-1表達(dá)低的非小細(xì)胞肺癌患者,使用異丙腎上腺素聯(lián)合貝伐單抗具有良好的抗腫瘤活性[15]。近期Jia等人通過鑒定來自健康對照的外周血樣品與患有細(xì)菌性肺炎的患者之間的差異表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn),TIMP-1等五個關(guān)鍵基因在革蘭氏陽性細(xì)菌引起的肺炎患者外周血中表達(dá)上調(diào),提示TIMP-1等基因可能與細(xì)菌性肺炎的發(fā)病密切相關(guān)[16]。然而關(guān)于其在肺炎中的作用及其機(jī)制的研究仍然較少,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮HEPApiC細(xì)胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高,提示TIMP-1的過表達(dá)可能參與肺炎的發(fā)生。本研究通過在HEPApiC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TIMP-1 siRNA,探究敲低TIMP-1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HEPApiC細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。

    研究顯示,肺泡上皮細(xì)胞凋亡在肺炎發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。Shi等研究顯示,肺炎支原體通過激活外部死亡受體途徑,促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡來影響兒童肺炎的發(fā)展[17]。Suliman的研究暗示肺炎損傷的AT2細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量控制活化促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡以支持肺泡功能[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌能夠抑制HEPApiC細(xì)胞活力,而敲低TIMP-1能夠上調(diào)HEPApiC細(xì)胞活力。且肺炎鏈球菌能夠促進(jìn)HEPApiC細(xì)胞凋亡,而敲低TIMP-1能夠部分逆轉(zhuǎn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HEPApiC細(xì)胞凋亡。Western blot檢測結(jié)果顯示,肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HEPApiC細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高,抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低,而敲低TIMP-1能夠下調(diào)Bax的表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。提示,敲低TIMP-1可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)阻礙肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HEPApiC細(xì)胞凋亡。炎癥反應(yīng)的激活是導(dǎo)致肺炎發(fā)生的重要因素之一,而炎癥因子的大量合成和分泌,勢必導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)最終引發(fā)組織器官受損[19-20]。TNF-α的過度表達(dá)能夠引起炎癥反應(yīng)的失控加重組織損傷,嚴(yán)重時可導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)[21]。IL-1β主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥蛋白等多種炎癥因子的合成和分泌[22]。IL-6是一種主要由淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子,其可直接參與炎癥反應(yīng)及組織損傷[23]。以往研究顯示,在肺炎組織中,TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)顯著升高[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺炎鏈球菌處理HEPApiC細(xì)胞后,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高,而敲低TIMP-1能夠減少TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。提示TIMP-1可能通過抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)降低細(xì)胞凋亡來阻礙肺炎的發(fā)生和發(fā)展。

    綜上,敲低肺泡上皮HEPApiC細(xì)胞中TIMP1基因表達(dá),能夠抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能通過抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn),但TIMP1在肺炎中的具體作用機(jī)制仍需深入探討。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究細(xì)菌性肺炎的發(fā)病機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ),為靶向TIMP1治療細(xì)菌性肺炎提供理論依據(jù)。

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