HPV E6/E7基因和HPV L1基因DNA檢測的比較及意義

王慧靜　謝旺凱　王儉　肖蘭蘭　計蘇慧　薛向陽　董海艷　王樂丹　陳向敏

【摘要】 目的：比較宮頸組織人乳頭瘤病毒16亞型中HPV早期基因（E6/E7）和晚期基因（L1）的檢出情況，并分析其作為宮頸癌及癌前病變評價的意義。方法：選擇高危型（HR）-HPV16亞型的E6/E7區(qū)基因和HR-HPV的L1區(qū)基因設(shè)計特異性引物，優(yōu)化條件，建立高危型HPV16分型檢測方法。分別收集宮頸組織慢性宮頸炎22例，宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌54例共76例組織標(biāo)本，根據(jù)病理學(xué)診斷結(jié)果分為兩組，對照組（慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅠ級）和高級別宮頸病變組（CINⅡ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗癌），抽提DNA，采用新建立的方法對HPV早、晚期基因進(jìn)行PCR檢測，同時與臨床的雜交捕獲二代法（HCⅡ）檢測的HPV L1基因進(jìn)行比較。結(jié)果：成功建立了敏感、特異的基于E6/E7和L1基因的PCR檢測方法，E6/E7基因HPV16分型檢測陽性率為55.3%（42/76），HPV L1和HCⅡ-HPV L1檢測陽性率均為25.0%（19/76），E6/E7基因陽性率明顯高于HPV L1和HCⅡ-HPV L1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而HPV L1和HCⅡ-HPV L1基因陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組的HPV E6/E7、HPV L1和HCⅡ-HPV L1陽性率分別為29.0%、9.7%和12.9%，顯著低于高級別宮頸病變組的73.3%、35.6%和33.3%（P<0.05）。HPV早期基因（E6/E7）與晚期基因（L1）檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析，對照組HPV E6/E7與HPV L1的檢測結(jié)果有關(guān)聯(lián)（P<0.05）；高級別宮頸病變組HPV E6/E7與HPV L1的檢測結(jié)果有關(guān)聯(lián)（P<0.01）；其余檢測結(jié)果均沒有關(guān)聯(lián)（P>0.05）。結(jié)論：HPV E6/E7基因比L1基因檢測更具靈敏、高效、實(shí)用的特點(diǎn)，將E6/E7基因HPV16亞型陽性檢測結(jié)果與CINⅡ以上病理診斷結(jié)果相結(jié)合，可作為預(yù)測評價臨床早期宮頸病變及宮頸癌的有效方法之一。

【關(guān)鍵詞】 人乳頭瘤病毒16亞型； E6/E7基因； L1基因； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.36.003 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2016）36-0005-04

Comparison and Significance of the DNA Detection of E6/E7 Gene and L1 Gene in HPV/WANG Hui-jing，XIE Wang-kai，WANG Jian，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2016，14（36）：5-8

【Abstract】 Objective：To compare the situation of the HPV16 subtype detection of the early gene（E6/E7） and the later gene（L1） in cervical tissue and analyze the significance in evaluating cervical cancer and cervical precancerosis.Method：The E6/E7 gene and the L1 gene of high risk HPV16 subtype were chosen and designed specific primers.Then PCR conditions were optimized and the new PCR detective method of high-risk HPV16 was established.76 cases of cervical tissues established were collected，which including 22 cases of chronic cervicitis and 54 cases of cervical intraepithelial neoplasias（CIN） and crervical squamous carcinoma.According to pathological diagnosis results，they were divided into two groups including control group（chronic cervicitis and CINⅠ） and high-grade cervical lesion group（CINⅡ，CINⅢ，crervical squamous carcinoma），and DNA was extracted and detected by new established method of E6/E7 gene PCR and HPV-L1 gene PCR.Then the detecting result was compared with clinical detecting method of HCⅡ.Result：A sensitive and specific PCR detective method based on E6/E7 gene and L1 gene for high-risk HPV16 type were established successfully.The positive rate of HPV E6/E7 PCR method of tissues was 55.3%（42/76），the positive rates were both 25.0%（19/76） with HPV L1 gene PCR method and HPV L1 HCⅡ method.The positive rate of HPV E6/E7 PCR method was obviously higher than other methods，and the difference was statistically significant（P<0.01）.But the positive rates between HPV L1 gene PCR method and HPV- L1 HCⅡmethod was not statistically significant（P>0.05）.The positive rate of HPV E6/E7，HPV L1 and HPV- L1 HCⅡ in the control group was respectively 29.0%，9.7% and 12.9%，which were respectively obviously lower than the positive rate of 73.3%，35.6% and 33.3% in high-grade cervical lesion group（P<0.05）.The detection result about relevance between the early gene（E6/E7） and the late gene（L1） was analyzed，the result showed that HPV E6/E7 and HPV L1 were both related in the control group（P<0.05） and in high-grade cervical lesion group（P<0.05），but the others were not related（P>0.05）.Conclusion：The E6/E7 gene detection is more sensitive，more efficient，more pragmatic than L1 gene.Combining the positive detection results of HPV16 E6/E7 gene with the pathological diagnosis above CINⅡ class can be one of practical methods of predicting and evaluating the early clinical cervical lesion and cervical cancer.

【Key words】 HPV16 subtype； E6/E7 gene； L1 gene； Polymerase chain reaction

First-authors address：Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China

宮頸癌是女性最常見惡性腫瘤之一，近年來隨著宮頸癌防治工作的發(fā)展，宮頸癌的發(fā)生率和死亡率呈現(xiàn)下降的趨勢，但它仍是導(dǎo)致女性死亡的最常見病因之一。已經(jīng)證實(shí)，持續(xù)性高危型HPV感染是誘發(fā)宮頸腫瘤的病因[1]。目前唯一通過美國FDA認(rèn)證的廣泛應(yīng)用于臨床的雜交捕獲二代法，通過DNA和特異的RNA探針雜交，主要根據(jù)L1衣殼蛋白基因來判斷是否有HPV感染，但L1晚期基因在病毒基因整合過程中常發(fā)生斷裂丟失[2]，這嚴(yán)重限制了基于L1基因的臨床檢測效果。而HPV E6/E7早期基因在基因整合過程中持續(xù)存在于HPV基因組中，因此HPV E6/E7基因被認(rèn)為是宮頸癌檢測的更可靠的持續(xù)性存在的靶點(diǎn)[3]。因此通過該基因早期預(yù)測宮頸病變和疾病進(jìn)展，從而降低其發(fā)生率和死亡率具有臨床意義。鑒于國內(nèi)還未見HPV早期基因E6/E7與晚期基因L1檢測比較的研究報道，本研究以HPV16型別為基礎(chǔ)，選擇E6/E7基因和L1基因設(shè)計特異性引物，建立一種新型的PCR檢測方法，對76例宮頸組織進(jìn)行高危型HPV16早期基因（E6/E7）和HPV晚期基因（L1）的檢測，同時結(jié)合宮頸組織的病理診斷結(jié)果分析比較，評價臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年12月-2012年4月采自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和附屬第二醫(yī)院的婦產(chǎn)科患者宮頸組織，經(jīng)病理確診慢性宮頸炎22例、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN） Ⅰ級9例、CIN Ⅱ級18例、CIN Ⅲ級17例、宮頸鱗癌10例，共76例；根據(jù)組織樣本的病理學(xué)診斷結(jié)果將76例樣本分為兩組，對照組（慢性宮頸炎、CIN Ⅰ級）31例，高級別宮頸病變組（CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗癌）45例。其中醫(yī)院通過雜交捕獲二代法（HCⅡ）檢測HPV L1陽性為19例。患者年齡最小25歲，最大69歲，平均41歲。所有標(biāo)本征得患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

HPV16型核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，包括TIANGEN 2×Taq PCR MasterMix（KT201）；TIANGEN TIANgel Midi Purification Kit（DP209-2）；TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus Code（No.QPK-212T，212，212X5）；Thermal EPR116 PCR儀[賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司]；HPV16陽性的Siha細(xì)胞和HPV18陽性的Hela細(xì)胞由微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 方法

1.3.1 提取宮頸組織和細(xì)胞株DNA 取細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，用基因組提取試劑盒（DP304）提取細(xì)胞DNA，同時提取76例宮頸組織，并按試劑盒中的操作步驟進(jìn)行，最后將DNA濃度統(tǒng)一稀釋成100 ng/?l后，放于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計及合成 通過NCBI查找HPV E6/E7的基因序列，分析同源性，利用Primer 6.0及Oligo 7.0軟件設(shè)計HPV16型特異引物，參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]獲取HPV L1通用引物GP5+/6+的序列引物。由上海生工生物工程有限公司合成如下引物：HPV16 E6/E7區(qū)（209 bp），前向引物為5-GTGGACCGGTCGATGTATGTCT-3，反向引物為5-TCCGGTTCTGCTTGTCCAGC-3；HPV L1區(qū)（146 bp），前向引物為5-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3，反向引物為5-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3。

1.3.3 多聚酶鏈反應(yīng)（PCR） 在25 μl反應(yīng)體系中依次加入滅菌雙蒸水5.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，兩條引物各1 μl，樣本DNA 5 μl進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；循環(huán)35次；72 ℃后延伸5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠（含有0.1 μl/ml的Gelred染料）電泳并在凝膠成像分析儀觀察。若在209 bp處出現(xiàn)DNA明亮條帶，且與感染HPV16型的Siha細(xì)胞DNA電泳結(jié)果一致，表明HPV16型DNA陽性。同時平行進(jìn)行HPV L1基因引物PCR的檢測方法，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后測序驗(yàn)證。

1.3.5 HPV E6/E7基因PCR檢測方法敏感性試驗(yàn) 將HPV16陽性的DNA模板進(jìn)行系列10倍稀釋后行基于HPV16 E6/E7基因的PCR檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用PASW 18.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率（%）表示，成組設(shè)計兩個率的比較以及2×2列聯(lián)表關(guān)聯(lián)性分析，采用Pearson 字2檢驗(yàn)、四格表校正字2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；3個率比較采用Pearson 字2檢驗(yàn)，隨后的兩兩比較采用字2分割法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7和HPV L1分型檢測方法的建立

（1）以明確HPV16感染的宮頸組織及Siha細(xì)胞（HPV16+）作為陽性模板，通過設(shè)計HPV16亞型的E6/E7早期基因特異性引物和L1晚期基因通用引物，優(yōu)化PCR條件，建立了HR-HPV PCR檢測方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法能特異檢測到HPV早、晚期基因，其產(chǎn)物分別為209 bp和146 bp（圖1、圖2）。（2）敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA模板量低至0.01 ng仍能擴(kuò)增特異目的片段（圖3）。表明該分型檢測方法成功建立。

圖1 HPV16 E6/E7陽性標(biāo)準(zhǔn)電泳圖

注：M：D2000 Marker；泳道1：Siha細(xì)胞；泳道2：Hela細(xì)胞；泳道3：明確HPV16感染的宮頸組織

圖2 HPV16 L1陽性標(biāo)準(zhǔn)電泳圖

注：M：D1000 Marker；泳道1：Siha 細(xì)胞；泳道2：Hela細(xì)胞

圖3 HPV16 E6/E7早期基因PCR檢測敏感性分析

注：M：D2000 Marker；泳道1～5分別為100、10、1、0.1、0.01 ng DNA模板量

2.2 HPV E6/E7和HPV L1基因陽性檢出結(jié)果

76例宮頸組織平行進(jìn)行前述的HPV E6/E7和HPV L1 DNA檢測，PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7基因檢出陽性率55.3%；HPV L1基因檢出陽性率為25.0%；HCⅡ-HPV L1基因檢出陽性率為25.0%；三種基因陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=20.374，P=0.002），而HPV L1和HCⅡ-HPV L1陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 不同病理學(xué)分級HPV早、晚期基因陽性率比較

在宮頸病變患者中，對照組的HPV E6/E7陽性率為29.0%，顯著低于高級別宮頸病變組的73.3%（P<0.01），對照組的HPV L1陽性率為9.7%，顯著低于高級別宮頸病變組35.6%（P<0.01），對照組的HCⅡ-HPV L1陽性率為12.9%，顯著低于高級別宮頸病變組的33.3%（P<0.05），見表2。

2.4 不同病理分級中HPV E6/E7與HPV L1和HCⅡ-HPV L1檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析

根據(jù)HPV早期基因與HPV晚期基因檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析：（1）對照組HPV E6/E7與HPV L1檢測結(jié)果具有關(guān)聯(lián)性（P=0.019）；（2）高級別宮頸病變組HPV E6/E7與HPV L1檢測結(jié)果具有關(guān)聯(lián)性（字2=7.036，P=0.008）；（3）在對照組和高級別宮頸病變組中，HPV E6/E7與HCⅡ-HPV L1檢測結(jié)果都沒有關(guān)聯(lián)性（用四表校正字2值，分別為：字2=2.497，P=0.114；字2=3.196，P=0.074），見表3。

3 討論

盡管近年來宮頸癌的死亡率呈現(xiàn)一定的下降趨勢，但早期宮頸癌的預(yù)防仍是人類關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。高危型HPV的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)病的重要因素，已證實(shí)超過2/3的宮頸癌發(fā)病與HPV16型或18型等高危型的持續(xù)感染相關(guān)，且宮頸組織的病變程度與HR-HPV的早期基因DNA和mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[5]。目前臨床上主要通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測、病理組織檢測診斷宮頸組織病變，均為有創(chuàng)性操作，且作為常規(guī)篩查手段易造成大量的資源浪費(fèi)。

本研究設(shè)計的HPV16 E6/E7特異性引物，在優(yōu)化條件后建立的HPV16的PCR檢測方法具有高度特異性與靈敏度，檢測的HPV16早期基因E6/E7陽性率明顯高于HPV L1晚期基因，與文獻(xiàn)[5-6]報道一致，表明早期基因E6/E7在致癌過程中始終呈持續(xù)高表達(dá)；而L1晚期基因的檢出率明顯低于E6/E7基因，與臨床檢測的HCⅡ-HPV L1基因檢出率基本相同，這可能是HPV-DNA整合到宿主細(xì)胞DNA后導(dǎo)致L1晚期基因缺失，而使L1基因呈陰性表達(dá)[7]。在不同的病理組織學(xué)分級患者中，結(jié)果顯示對照組和高級別宮頸病變組HPV的陽性率隨著病理級別的升高呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示HPV16的陽性率與病變程度有關(guān)。另外HPV早、晚期基因檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析顯示在兩組不同的病理分級中HPV E6/E7與HPV L1檢測結(jié)果有關(guān)聯(lián)，提示HPV E6/E7與HPV L1聯(lián)合檢測，可以更全面地評估宮頸病變風(fēng)險，提高宮頸病變診斷準(zhǔn)確率。而HPV E6/E7與HCⅡ-HPV L1結(jié)果無關(guān)聯(lián)，可能與其采用HCⅡ法檢測有關(guān)?？梢娺@種新的基于HPV E6/E7的高危型HPV16的檢測方法在篩查高級別宮頸病變方面有優(yōu)勢，提示當(dāng)患者宮頸組織高危型HPV16檢測為陽性時，病理組織學(xué)活檢為CIN Ⅱ、Ⅲ級及宮頸鱗癌時應(yīng)引起高度警惕。有報道高危型HPV的早期蛋白E6、E7在宮頸腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用[8-9]，且在宮頸癌中持續(xù)存在[10]，本研究結(jié)果也證實(shí)了早期基因E6/E7 DNA表達(dá)明顯高于晚期基因L1 DNA的表達(dá)，并且相較于L1基因，選擇HPV E6/E7早期基因進(jìn)行檢測，檢出率更高。因此HPV E6/E7基因是作為檢測高危型HPV更為可靠的靶基因，新建立的基于E6/E7基因檢測HPV的方法可用于臨床篩查癌前病變及宮頸癌。

綜上所述，基于早期基因E6/E7的DNA檢測與晚期基因L1 DNA及HCⅡ雜交捕獲法L1檢測比較，E6/E7的DNA檢測法是更具特異、靈敏、高效、實(shí)用的一種新的檢測方法，且具有操作簡便，檢測成本低等特點(diǎn)，較臨床主流的HCⅡ雜交捕獲法更有優(yōu)勢，將其應(yīng)用于臨床進(jìn)行宮頸癌HPV篩查，更具應(yīng)用價值和臨床意義。通過比較高危型HPV早期基因與晚期基因的差異性表達(dá)，結(jié)合臨床病理組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，可更有效地篩查出潛在的高度宮頸病變?nèi)巳?，進(jìn)行早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)和早治療，以降低宮頸腫瘤的發(fā)生率和死亡率。

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（收稿日期：2016-08-19）