重金屬鋅離子人工抗原的合成及抗體特性

付世杰， 孫 勇， 王亞楠， 王自良

(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

重金屬鋅離子人工抗原的合成及抗體特性

付世杰， 孫 勇， 王亞楠， 王自良

(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

研究鋅離子人工抗原的合成及其多克隆抗體(pAb)的制備。用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合Zn2+合成Zn-ITCBE半抗原、異硫氰酯法制備免疫抗原Zn-ITCBE-BSA和包被原Zn-ITCBE-OVA，紫外分光光度法(UV)、SDS-PAGE和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)進(jìn)行鑒定；用Zn-ITCBE-BSA免疫Balb/c小鼠，間接ELISA測定Zn pAb效價，阻斷ELISA鑒定其敏感性，交叉反應(yīng)試驗其特異性。結(jié)果表明，Zn-ITCBE-BSA偶聯(lián)成功，Zn-ITCBE和BSA的分子結(jié)合比為25 ∶1，Zn pAb效價達(dá)到1 ∶(2.56×104)，對Zn2+的IC50為9.23，與其他重金屬離子的交叉反應(yīng)率低，獲得高價、敏感、特異的Zn pAb，為鋅離子殘留污染的免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

重金屬鋅離子；半抗原；人工抗原；抗體；鑒定

土壤和農(nóng)產(chǎn)品中的重金屬與人類健康密切相關(guān)。重金屬污染主要是指生物毒性顯著的汞、鉻、鎘、鉛以及類金屬砷，還包括具有毒性的重金屬銅、鈷、鎳、錫等金屬污染物[1]。重金屬污染不同于其他類型污染，具有隱蔽性、長期性和不可逆轉(zhuǎn)性等特點。隨著城市的擴(kuò)大和大規(guī)模工業(yè)發(fā)展，大量重金屬進(jìn)入環(huán)境后，即使?jié)舛群艿鸵部赡茉斐晌：?，通過飲用水或者通過生物富集以及食物鏈等方式最終威脅到人體健康。

鋅參與體內(nèi)200多種酶的合成和活化，是機(jī)體新陳代謝的重要物質(zhì)，是動物生長發(fā)育及維持正常生理機(jī)能所必須的微量元素，參與蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂、生長和再生；但環(huán)境污染和飼料、藥物添加劑的濫用，造成畜禽產(chǎn)品鋅的殘留不同程度超標(biāo)[2]。過量鋅是一種作用迅速的中樞神經(jīng)毒素，通過對神經(jīng)細(xì)胞的直接損害以及對體內(nèi)各種物質(zhì)的拮抗而影響腦功能，攝入過量會導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[3-4]；過量的鋅還可明顯抑制紅細(xì)胞的免疫功能，造成雛雞肝、脾的結(jié)構(gòu)和功能受損[5-7]。許多試驗和流行病學(xué)調(diào)查已證實，如果鋅在體內(nèi)含量過高，將會抑制吞噬細(xì)胞的活性和殺菌力，降低人體免疫功能，抵抗力減弱，對疾病易感性增加[5-7]。

同時，鋅主要來源于采礦、電鍍和冶煉行業(yè)污染物的排放，水和土壤中的鋅污染已經(jīng)引起環(huán)境科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。土壤中鋅超過200 mg/kg時可能對植物生長造成危害，過量鋅可直接導(dǎo)致植物發(fā)生鋅污染中毒，也可能間接影響植物對于重要營養(yǎng)元素Fe的吸收，進(jìn)而使植物因缺Fe而引起生長障礙、甚至死亡。在重金屬污染的預(yù)防和治理中，重金屬污染物的監(jiān)測和識別至關(guān)重要。

因此，衡量重金屬的定性定量分析在食品和環(huán)境檢測等方面非常重要。傳統(tǒng)的重金屬離子檢測法有無火焰原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9]、火焰原子吸收光譜法[10-11]、伏安法和離子色譜法[12]，以及電熱原子化原子吸收光譜法[13-16]等，檢測必須在具備大型分析儀器的重點實驗室內(nèi)進(jìn)行，無法用于現(xiàn)場檢測，且受到費用高、處理量有限和檢測時間長等限制[17]，不利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，難以適應(yīng)環(huán)境及市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查及產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求。

因此，建立快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、大批量篩檢的鋅免疫檢測技術(shù)，對于減少環(huán)境污染、提高食品質(zhì)量和保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與溶液 ZnSO4·7H2O，Alfa Aeaser產(chǎn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)，購于上海同仁化學(xué)研究所；4-羥乙基哌嗪乙磺酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)，Sigma產(chǎn)品；弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant，IFA)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)，均為Sigma產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)R-250、30%丙烯酰胺溶液、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、過硫酸銨(ammonium persulfate)、甘氨酸(glycine)，均為北京索萊寶科技有限公司；乙酸汞(mercury acetate)、鉬酸(molybdic acid)、硫酸鈷(cobalt sulfate neptahydrate)、硝酸鍶(strontium nitrate)、三氧化二鐵(ferric sesquioxide)、氧化鎂(magnesium oxide)、碳酸鈣(calcium carbonate)、銅粉(copper powder)、鉻粉(chromium powder)、鉛粉(lead powder)，均為國產(chǎn)分析純；四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)，上海五聯(lián)化工廠；羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP)，上海華美生物工程公司；試驗用水為重蒸去離子水(double distilled water，DDW)。其他試劑市售所得，均為AR級。

1.2 溶液

1.2.1 SDS-PAGE所需溶液 電泳染色液：將45 mL甲醇、45 mL DDW和10 mL冰乙酸混勻，然后加入0.25 g考馬斯亮藍(lán)，充分溶解后，濾紙過濾后備用。

電泳脫色液：將40 mL甲醇、40 mL DDW和10 mL冰乙酸混勻即可。

分離膠緩沖液：稱取18.17 g Tris，加入DDW 100 mL，充分溶解后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，4 ℃冰箱保存。

濃縮膠緩沖液：稱取6.0 g Tris，加入DDW 100 mL，充分溶解后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，4 ℃冰箱保存。

上樣緩沖液：稱取SDS 0.2 g、溴酚藍(lán)10 mg，加入濃縮膠緩沖液0.5 mL、甘油1 mL、β-ME 0.25 mL，然后用DDW定溶至5 mL，4 ℃冰箱避光保存。

5×電泳緩沖液：稱取7.55 g Tris、47 g甘氨酸，溶解在450 mL DDW中；再加入10% SDS，用DDW定容至500 mL，室溫保存，使用時5倍稀釋。

1.2.2 ELISA所需緩沖液 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.56 g，KH2PO40.2 g，溶于DDW定容至 1 000 mL。

洗滌緩沖液(PBS+Tween20，PBST)：PBS+0.05% Tween20。

0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液(carbonate buffered saline，CBS)：Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，加DDW定容至1 000 mL。

封閉液(SPBST)：5%豬血清+PBST。

TMD底物緩沖液：(1)A液。用0.1 mol/L pH值為5.0醋酸鈉/檸檬酸緩沖液加熱溶解0.5 g過氧化脲，再與0.08 g非那西丁(預(yù)先加熱溶于DDW)混合，定容至1 000 mL。(2)B液。TMB 1.27 g溶于500 mL甲醇，再與500 mL甘油混合。

2 mol/L H2SO4終止液：98%濃硫酸(18 mol/L)10 mL稀釋至180 mL。

1.3 主要儀器

PHS-3C酸度計，上海雷磁公司；98-1磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；JY-3000電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Optima 2100DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)，美國PE公司；WD-9403D型紫外儀，北京六一儀器廠；抗原與佐劑乳化器，本實驗室自制；Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；Legend micro 17型離心機(jī)，美國Thermo公司；303A1型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.4 試驗動物

SPF級6周齡雌性Balb/C小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，本實驗室飼養(yǎng)。

1.5 金屬螯合物人工抗原的合成

1.5.1 Zn2+-ITCBE-BSA免疫原的合成 采用異硫氰酯法[18]，參考Chakra等的方法并加以改進(jìn)合成免疫原Zn2+-ITCBE-BSA[19]。稱取10 mg ITCBE溶于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬螯合劑溶液；稱取6.65 mg ZnSO4溶于 1 mL pH值為8.0的HEPES緩沖液(10 mmol/L)中形成Zn2+溶液；將金屬螯合劑溶液和Zn2+溶液混合并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后在室溫條件下放在搖床上反應(yīng)12 h，即形成Zn2+-ITCBE螯合物半抗原。稱取20 mg BSA溶于 1 mL pH值為8.0的HEPES緩沖液(10 mmol/L)中形成 20 mg/mL 的載體蛋白溶液；取1 mL Zn2+-ITCBE螯合物半抗原溶液加入到1 mL載體蛋白溶液中并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫?fù)u床反應(yīng)24 h，然后移入透析袋中透析5 d，即形成Zn2+-ITCBE-BSA完全抗原。合成路線見圖1。

1.5.2 Zn2+-ITCBE-OVA 包被原的合成 合成方法同“2.1.1”節(jié)。

1.6 人工抗原的鑒定

1.6.1 人工抗原濃度測定 以HEPES溶液做為空白對照，將免疫抗原Zn2+-ITCBE-BSA和包被抗原Zn2+-ITCBE-OVA用HEPES緩沖液稀釋100倍，用蛋白核酸分析儀在 280 nm 波長下測定人工抗原中的蛋白濃度。

1.6.2 SDS-PAGE鑒定 根據(jù)BSA的Mr(6.62×104)，選擇濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，濃縮膠電壓為 120 V，分離膠電壓為60 V，點樣量10 μg/孔，對BSA、Zn2+-ITCBE-BSA進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色，紫外儀照相。

1.6.3 ICP-AES檢測抗原中Zn2+的含量 將100 μg/mL的Zn2+標(biāo)準(zhǔn)儲備液用2%的硝酸稀釋成0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL 的濃度梯度，儀器軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出線性回歸方程；樣品溶液50倍稀釋，用226 nm波長在最佳優(yōu)化試驗條件下進(jìn)行測定，儀器軟件自動分析結(jié)果。

1.6.4 多抗血清(pAb)鑒定

1.6.4.1 Zn2+-EDTA pAb的制備 用Zn2+-ITCBE-BSA免疫6周齡雌性Balb/C小鼠5只，免疫劑量為 50 μg·0.2 mL/只，背部皮下4點注射。首免，用無菌PBS溶解Zn2+-ITCBE-BSA，與等量CFA混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無菌PBS溶解Zn2+-ITCBE-BSA，與等量IFA混合，充分乳化，首免后3周進(jìn)行，共免5次，每次間隔2周，最后1次免疫后10 d斷尾采血，5 000 r/min離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4.2 效價測定 采用間接ELISA測定pAb效價，基本程序參照Tijssen的方法。第1步，用經(jīng)pH值為9.6 0.05 moL/L 的碳酸鹽緩沖液稀釋的Zn2+-ITCBE-OVA包板，包被濃度2 μg/mL，包被量每孔100 μL，37 ℃溫育2 h，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第2步，用5%豬血清封閉，每孔200 μL，37 ℃溫育1 h，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第3步，加pAb，每孔50 μL，用封閉液倍比稀釋，設(shè)陰性對照(negative control，NC)和空白對照(blank control，BC)，37 ℃溫育15 min，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第4步，加RaMIgG-HRP，1 ∶1 000用封閉液稀釋，每孔50 μL，37 ℃溫育30 min，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第5步，加酶底物TMB顯色，每孔100 μL，室溫反應(yīng)10 min；第6步，終止顯色反應(yīng)，每孔加入終止液2 mol/L H2SO4100 μL，用酶標(biāo)儀讀D450 nm值；第7步，結(jié)果判斷，以待測孔D450 nm≥NCD450 nm的2.1倍(P/N≥2.1)判為陽性。

1.6.4.3 敏感性鑒定 用10 mmol/L HEPES緩沖液配制EDTA溶液，將Zn2+標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成0、3.906、7.812、15.625、31.250、62.500、125.000、250.000、500.000、1 000.000 ng/mL 的濃度梯度，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0，室溫?fù)u床反應(yīng)24 h，即形成Zn2+-EDTA螯合物溶液。以此溶液為抑制劑，采用阻斷ELISA試驗鑒定其敏感性，基本程序參照覃雅麗等的方法，見文獻(xiàn)[20]。第1步，用Zn2+-ITCBE-OVA包板，包被濃度2 μg/mL，包被量每孔100 μL，37 ℃溫育2 h，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第2步，用5%豬血清封閉，每孔200 μL，37 ℃溫育1 h，PBST洗板4次，每次間隔 3 min；第3步，加D450 nm為1.0的小鼠血清50 μL和不同濃度的Zn2+-EDTA螯合物溶液50 μL，設(shè)NC和BC，37 ℃ 溫育15 min，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第4步，加RaMIgG-HRP，1 ∶1 000用封閉液稀釋，每孔50 μL，37 ℃溫育30 min，PBST洗板4次，每次間隔3 min；第5步，加酶底物TMB顯色，每孔100 μL，室溫反應(yīng)10 min；第6步，終止顯色反應(yīng)，每孔加入終止液2 mol/L H2SO4100 μL，用酶標(biāo)儀讀D450 nm值；第7步，計算抑制率(B/B0，B0為Zn2+-EDTA 0濃度時的吸光度，B為Zn2+-EDTA不同濃度時的吸光度)。以B/B0為縱坐標(biāo)，以不同濃度抑制劑的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制Zn2+-EDTA對Zn2+-EDTA pAb的抑制曲線，根據(jù)曲線趨勢推導(dǎo)回歸方程，計算pAb對Zn2+-EDTA的50%抑制濃度(IC50)，并以IC50做為敏感度。

1.6.4.4 特異性鑒定 采用交叉反應(yīng)試驗鑒定其特異性。交叉反應(yīng)試驗選擇汞、鉻、鉛、鋅、銅、銫、鈷、鉬、鐵與EDTA的螯合物(螯合方法同上)和EDTA溶液做為抑制劑，用阻斷ELISA測定各抑制物的IC50，以Zn2+-EDTA pAb對Zn2+-EDTA的IC50和Zn2+-EDTA pAb對各競爭物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(cross-reactivity，CR%)。計算方法如下：

CR=Zn2+-EDTA的IC50/其他抑制物IC50×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法測定抗原濃度

利用Pharmacia蛋白質(zhì)核酸分析儀在280 nm波長下測定透析后的Zn2+-ITCBE-BSA、Zn2+-ITCBE-OVA蛋白的濃度分別為8.48、9.23 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE電泳鑒定

由圖2可知，BSA的泳動速度大于Zn2+-ITCBE-BSA，說明Zn2+-ITCBE-BSA的分子量大于BSA，證明BSA與Zn2+-ITCBE已成功偶聯(lián)。

2.3 ICP-AES測定抗原中Zn2+含量

由表1可知稀釋50倍后的樣品讀數(shù)，透析后的Zn2+-ITCBE-BSA和Zn2+-ITCBE-OVA 2種抗原中Zn2+的含量分別為197.45、130.80 μg/mL，可以證明金屬螯合物人工抗原合成成功。

表1 ICP-AES測定樣品中Zn2+含量

2.4 Zn2+-EDTA pAb鑒定

2.4.1 間接ELISA效價測定 由表2可知，免疫的5只小鼠血清抗體效價均達(dá)到了10-4，說明獲得了較好的免疫效果，其中4號小鼠效價最高，為0.597。

2.4.2 Zn2+-EDTA pAb敏感性鑒定 由表3可知，以Zn2+在3.906～1 000 ng/mL與過量EDTA螯合后形成的螯合物為抑制劑，5只小鼠的抗血清均產(chǎn)生了抑制。其中4號小鼠抑制效果最好，將其D450 nm值轉(zhuǎn)化為B/B0，再對lg[Zn2+-EDTA/100]進(jìn)行回歸分析，4號小鼠的線性回歸方程為y=-0.298 4x+0.975 2，r2為0.943 5，IC50為39.26 ng/mL(圖3)。

表2 小鼠抗Zn2+-ITCBE血清效價

表3 小鼠抗血清對Zn2+-EDTA的抑制效價

2.4.3 Zn2+-EDTA pAb特異性鑒定 由表4可知，Zn2+-EDTA對其pAb結(jié)合反應(yīng)的特異性很強(qiáng)；除與Hg2+-EDTA具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)外，與EDTA及其他金屬離子螯合物無交叉反應(yīng)。

3 討論

3.1 關(guān)于人工抗原的合成

Zn2+結(jié)構(gòu)簡單，不具有T、B 2種細(xì)胞表位而無法直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，既無免疫原性，也無反應(yīng)原性，而且Zn2+帶有電荷，能與機(jī)體內(nèi)生物分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆的反應(yīng)而導(dǎo)致機(jī)體中毒。因此，必須將Zn2+通過螯合劑進(jìn)行螯合，然后再將其連接到載體蛋白合成人工抗原，通過動物免疫制備Zn2+螯合物的特異性抗體。選擇合適的偶聯(lián)劑是人工抗原制備的關(guān)鍵。Meares等的研究結(jié)果表明，作為金屬離子人工抗原的偶聯(lián)劑必須滿足3個條件，一是能夠選擇性結(jié)合金屬離子并減弱金屬離子與生物分子之間的反應(yīng)能力，二是能夠與載體蛋白偶聯(lián)，三是偶聯(lián)物能夠被免疫系統(tǒng)識別，具有免疫原性[21-23]。通過大量篩選對比試驗，大分子雙功能螯合劑是最為理想的偶聯(lián)劑(圖4)。本試驗選擇異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)作為螯合劑，Zn2+與ITCBE螯合后，形成一個穩(wěn)定的六齒狀的配位化合物，該化合物具有獨特的空間構(gòu)型和一定的分子量，相當(dāng)于1個半抗原，然后再用異硫氰酯法將該螯合物偶聯(lián)到BSA或OVA上制備成人工抗原。筆者認(rèn)為，在合適的pH值范圍內(nèi)ITCBE才能夠充分的螯合金屬離子，這是使合成的人工抗原具有較好免疫原性的關(guān)鍵。

表4 Zn2+-EDTA pAb與其他金屬螯合物的交叉反應(yīng)

3.2 關(guān)于載體蛋白的選擇

載體蛋白的作用是提供T細(xì)胞識別表位，小分子半抗原與載體蛋白結(jié)合后，可作為載體蛋白的抗原決定簇，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞激活、分化、增殖，從而產(chǎn)生針對半抗原小分子的特異性抗體。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HAS)、兔血清白蛋白(RSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等，本研究選用BSA作載體蛋白，原因是BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易變性，價廉易得，分子內(nèi)含自由氨基多，在較大pH范圍和不同離子強(qiáng)度下均能保持較大的溶解度，更有利于偶聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。

3.3 關(guān)于人工抗原的鑒定

本試驗對合成的金屬螯合物抗原進(jìn)行了SDS-PAGE電泳鑒定、ICP-AES測定抗原中Zn2+含量和抗血清鑒定。在人工抗原的合成中偶聯(lián)到載體蛋白上的有些螯合劑并未螯合金屬離子，即形成ITCBE-BSA無金屬人工抗原，這些無金屬抗原與金屬螯合物抗原在進(jìn)行紫外掃描和SDS-PAGE電泳鑒定中不容易區(qū)別；個別Zn2+可以結(jié)合到載體蛋白上，故 ICP-AES所測定的抗原中Zn2+含量不能準(zhǔn)確地代表螯合離子的量。鑒于以上原因，本試驗沒有對所合成的人工抗原進(jìn)行偶聯(lián)率的計算。因此，筆者認(rèn)為，ICP-AES測定抗原中Zn2+含量和SDS-PAGE電泳鑒定只能作為輔助的重金屬螯合物人工抗原的鑒定，抗血清鑒定是重金屬螯合物人工抗原最為準(zhǔn)確、可靠的鑒定方法。

4 小結(jié)

利用雙功能螯合劑異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸通過異硫氰酯法合成了重金屬Zn2+的免疫抗原和包被抗原，并對所合成的抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳、ICP-AES檢測其Zn2+含量和小鼠免疫試驗，結(jié)果證明所合成的人工抗原具有較好的免疫原性，為Zn2+螯合物多克隆抗體(pAb)和單克隆抗體(mAb)的進(jìn)一步研制奠定了研究基礎(chǔ)和技術(shù)儲備。

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2015-11-24

國家科技支撐計劃(編號：2011BAK10B01-15)。

付世杰(1988—)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士，主要從事動物性食品安全快速免疫檢測技術(shù)研究。E-mail：372677205@qq.com。

王自良，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事動物性食品安全快速檢測技術(shù)研究。E-mail：15836090463@163.com。

TS201.6

A

1002-1302(2017)02-0185-05

付世杰，孫 勇，王亞楠，等. 重金屬鋅離子人工抗原的合成及抗體特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：185-189.