四環(huán)素類抗生素殘留的檢測(cè)方法及其對(duì)漁業(yè)環(huán)境的影響研究進(jìn)展

孟麗華，史艷偉，時(shí)兵，孟娟，蔣幫銅，吳廣州

(濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測(cè)站，山東 濟(jì)寧 272000)

四環(huán)素類抗生素殘留的檢測(cè)方法及其對(duì)漁業(yè)環(huán)境的影響研究進(jìn)展

孟麗華*，史艷偉，時(shí)兵，孟娟，蔣幫銅，吳廣州

(濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測(cè)站，山東 濟(jì)寧 272000)

近年來(lái)四環(huán)素類抗生素在水產(chǎn)品和漁業(yè)環(huán)境中殘留污染已引起廣泛關(guān)注。文章對(duì)水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留的前處理方法及儀器檢測(cè)方法等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，同時(shí)詳細(xì)介紹了四環(huán)素類抗生素對(duì)漁業(yè)環(huán)境的影響，以期為漁業(yè)水質(zhì)中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(1):50-55]

四環(huán)素類抗生素；殘留；檢測(cè)方法；漁業(yè)環(huán)境；水產(chǎn)品；前處理

四環(huán)素類(tetracyclines, TCs)是一類由放線菌產(chǎn)生的、化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于氫化并四苯環(huán)衍生物的抗生素，可分為天然品和半合成品兩大類，其中最常使用的是金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、強(qiáng)力霉素(doxycycline, DC)和四環(huán)素(tetracycline, TC)。四環(huán)素類為廣譜抗菌藥，具有抗菌或抑菌的功效，因其價(jià)格便宜且在防治腸道感染和促進(jìn)生長(zhǎng)方面具有顯著作用，被用于畜禽飼料添加劑和藥品中，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于防治魚類腸炎病、赤皮病、爛鰓病和白頭白嘴病等[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖魚類只能吸收一部分的四環(huán)素類抗生素，相當(dāng)一部分則以原藥或代謝物的形式隨排泄物排入到養(yǎng)殖水體中，從而在漁業(yè)環(huán)境中蓄積[2]。四環(huán)素類抗生素通過(guò)對(duì)水產(chǎn)品和養(yǎng)殖水體的直接污染或通過(guò)食物鏈傳遞到動(dòng)物源食品中，對(duì)人類的健康和生存造成不利的影響[2]。四環(huán)素類藥物殘留達(dá)到一定量后，可對(duì)胃腸、肝臟造成損害及使牙齒染色等，還會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)，二重感染后，具有致畸致癌作用，因此被許多國(guó)家列為限量藥物[3]。可見(jiàn)，四環(huán)素類抗生素在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖環(huán)境中殘留問(wèn)題研究已非常必要。目前檢測(cè)水產(chǎn)品中四環(huán)素類殘留的標(biāo)準(zhǔn)主要有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20764—2006《可食動(dòng)物肌肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-紫外檢測(cè)法》[4]、GB/T 21317—2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》[5]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3015—2002 《水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定》[6]及浙江地標(biāo)DB 33T 691—2008 《水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測(cè)定》[7]。漁業(yè)環(huán)境中四環(huán)素殘留檢測(cè)還未出臺(tái)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，相應(yīng)的檢測(cè)方法研究也較少[2]。

文章主要對(duì)水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的前處理、檢測(cè)分析方法及對(duì)漁業(yè)環(huán)境的影響研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為漁業(yè)水質(zhì)中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)的前處理方法

樣品的前處理包括樣品提取和樣品凈化兩大步驟，是將待測(cè)樣品處理成適合測(cè)定的檢測(cè)溶液的過(guò)程，是檢測(cè)過(guò)程中關(guān)鍵的一部分，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精密度和回收率。因此，樣品前處理技術(shù)的優(yōu)化是目前獸藥殘留分析研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

1.1 樣品的提取

提取是指根據(jù)殘留藥物與樣品基質(zhì)的物理化學(xué)特性差異，采用適當(dāng)?shù)娜軇⒋郎y(cè)物從樣品基質(zhì)中提取分離出來(lái)。因此溶劑的選擇，決定著提取的效果。在弱酸性溶液中四環(huán)素類藥物相對(duì)穩(wěn)定，由于其易與金屬離子和生物樣本中的蛋白質(zhì)發(fā)生絡(luò)合，所以提取四環(huán)素類殘留時(shí)需要在弱酸性條件下加入金屬絡(luò)合劑和去蛋白劑。常用的溶劑有Mcllvaine Buffer EDTA緩沖液[8]、高氯酸[9]、醋酸銨緩沖液[10]、檸檬酸緩沖液[11]、Na2EDTA-檸檬酸緩沖液[12]、乙酸、乙酸鎂和EDTA混合液[13]、草酸甲醇溶液[14]、二氯甲烷[15]等。不同的提取劑對(duì)水產(chǎn)品中4種抗生素回收率詳見(jiàn)表1。由表1可以看出，高氯酸、磷酸、草酸、乙酸等提取液的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)易沉淀、雜質(zhì)少，但有的抗生素的回收率偏低，現(xiàn)傾向于用Na2EDTA-檸檬酸緩沖液代替，既提供金屬絡(luò)合劑又提供酸性環(huán)境，還提高提取率。

表1 提取劑對(duì)水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素回收率的影響

1.2 樣品的凈化

凈化是指通過(guò)物理或化學(xué)的方法將提取液中的干擾物質(zhì)去除的過(guò)程，主要是利用待測(cè)物與干擾物的理化特性的差異，將干擾物的量減少到能正常檢測(cè)目標(biāo)殘留物的水平，是四環(huán)素類抗生素精確測(cè)量的前提。水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留分析常用的凈化方法主要液液萃取法[17-18]、固相萃取法[8-16]、基質(zhì)固相分散法[19]和固相微萃取法[20]。

液液萃取主要是利用待測(cè)物與其他雜質(zhì)在萃取液中溶解度的不同而進(jìn)行提取的一種方法，方法簡(jiǎn)單方便，適合于簡(jiǎn)單樣品的分離，對(duì)于復(fù)雜樣品需要進(jìn)一步凈化和富集。馬瑞欣等[17]用甲醇-水-甲酸(80 ∶20 ∶0.3，V/V)和含0.3%甲酸的甲醇溶液兩步提取，減壓蒸餾，高效液相色譜分析，土霉素回收率75.9%～116.2%，四環(huán)素回收率67.87%～102.2%，金霉素回收率43.78%～84.17%?；w分散固相萃取法將固相萃取材料與樣品一起研磨后，將混合物填料裝柱，然后淋洗，是集樣品均化、提取、凈化于一體的方法。賴克強(qiáng)等[19]采用基質(zhì)固相分散法將魚肉與C18填料研磨混合均勻后上柱，先用正己烷淋洗，再用二氯甲烷洗脫，旋轉(zhuǎn)，定容后高效液相色譜測(cè)定，平均加標(biāo)回收率為73.2%～92.3%。固相微萃取是基于待測(cè)物在固定相和水相之間的平衡分配基礎(chǔ)，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的分離方法，具有簡(jiǎn)單、便攜、低廉的特點(diǎn)。Wen等[20]通過(guò)固相微萃取和高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，測(cè)得四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素的最低檢出限分別為22、16、30、21 ng/g。

水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素類藥殘凈化最常用的是固相萃取柱，包括C18柱、HLB柱、PCX柱等。林荊等[21]采用固相萃取HLB柱凈化方法，同時(shí)凈化鰻中的6種四環(huán)素類藥物，經(jīng)甲醇洗脫、氮吹吹干定容后，然后進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，回收率為61%～97%，該方法操作簡(jiǎn)單、萃取效率高，具有廣泛的通用性，適用于大多數(shù)水產(chǎn)品的處理凈化。程雪梅等[22]采用C18柱凈化方法提取蝦中的4種四環(huán)素類藥物，經(jīng)4%甲酸甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮定容后，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，平均回收率為50.2%～91.2%，檢出限為2～8 μg/kg(S/N=3)；李小玲等[10]采用PCX柱凈化水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素及鹽酸克倫特羅藥物殘留，用NH3·H2O-乙酸乙酯混合液洗脫，回收率為64.3%～100.6%；黃志勇等[23]直接將提取液氮吹濃縮定容后，過(guò)0.45 μm濾膜后直接進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)，與其他前處理方法相比，該方法具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。

2 水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留的檢測(cè)方法

水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)以儀器檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)法為主，常見(jiàn)的儀器檢測(cè)方法有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[24-27]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[28-30]、高效液相色譜柱前衍生-熒光檢測(cè)法[31]、超高效液相色譜法[32-33]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[34-35]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[36]和毛細(xì)管電泳法[37]；免疫學(xué)檢測(cè)法主要有酶聯(lián)免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、膠體金免疫層析法和放射性免疫法[38-40]；此外還有微生物法[41]等。

目前水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)最常用的方法是高效液相色譜法。劉麗等[42]建立高效液相色譜-紫外法測(cè)定水產(chǎn)品中的土霉素、四環(huán)素、金霉素，結(jié)果為土霉素、四環(huán)素和金霉素的檢出限分別為0.010、0.008和0.035 mg/kg，加標(biāo)回收率為85%～120%。王萍亞等[11]則用高效液相色譜(HPLC)-熒光法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種四環(huán)素藥物殘留，土霉素和四環(huán)素的檢出限為0.01 mg/kg，金霉素和強(qiáng)力霉素的檢出限為0.03 mg/kg，添加平均回收率80%～10%。鄭潔[31]采用柱前衍生化的方法，將四環(huán)素類抗生素定量轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光的衍生物，然后進(jìn)行HPLC分離和熒光檢測(cè)，結(jié)果表明，柱前衍生四環(huán)素類抗生素的HPLC分離-熒光檢測(cè)法比天然四環(huán)素類抗生素的HPLC-熒光檢測(cè)法的檢出限提高103～105。隨著超高效液相色譜的出現(xiàn)，貝亦江等[32]利用超高效液相色譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中金霉素、土霉素、四環(huán)素的藥物殘留，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，使用UPLC檢測(cè)分析，縮短了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)的靈敏度。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是所有檢測(cè)方法中提供信息量最多的一種檢測(cè)方法，既可準(zhǔn)確定量，又可定性。劉艷萍等[16]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素，4種物質(zhì)定量下限均可達(dá)到2.0 μg/kg，該方法適用于水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素多殘留的同時(shí)確證檢測(cè)。林荊等[21]用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中6種四環(huán)素類藥物殘留，其添加回收率為61%～97%，檢出限為2.5 μg/kg。液質(zhì)-串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限低，靈敏度高，分析快速，能夠有效去除假陽(yáng)性干擾，特異性強(qiáng)，是未來(lái)獸藥殘留、農(nóng)藥殘留檢測(cè)確證的主要方法。

免疫法是一種前處理簡(jiǎn)單、選擇性高、靈敏度高、且不需要大型儀器的方法。 Cháferpericás等[39]比較了酶聯(lián)法和時(shí)間分辨熒光免疫法測(cè)定金頭鯛中土霉素，兩種方法測(cè)定檢出限為16和0.08 μg/kg。檀尊社等[38]用膠體金免疫層析法快速測(cè)定水產(chǎn)樣品中四環(huán)素類藥物殘留，僅需要5～10 min反應(yīng)時(shí)間，試劑靈敏度達(dá)到100 ng/mL。鄭晶等[40]應(yīng)用放射性免疫分析法篩檢烤鰻中的四環(huán)素族藥物殘留，檢測(cè)限可達(dá)50 μg/kg，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需80 min。免疫法一般適合篩選樣品，不適合精確的定量測(cè)定，并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，試劑盒使用起來(lái)價(jià)格比較昂貴，限制了其普遍發(fā)展使用。

3 四環(huán)素類抗生素對(duì)漁業(yè)環(huán)境的影響

水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用的四環(huán)素類抗生素有70%～80%都隨飼料或糞便進(jìn)入養(yǎng)殖水體或沉入底泥中，由于它們?cè)诃h(huán)境中不易發(fā)生生物降解，使得該類藥物在養(yǎng)殖水體和底泥中富集[43]，對(duì)養(yǎng)殖水體中的微生物、藻類植物、甲殼動(dòng)物[44]和水生動(dòng)物都產(chǎn)生了生態(tài)毒性[45]。常見(jiàn)的四環(huán)素對(duì)漁業(yè)環(huán)境的生態(tài)毒性見(jiàn)表2。

表2 四環(huán)素類藥物對(duì)漁業(yè)環(huán)境的生態(tài)毒性

四環(huán)素類抗生素的主要作用是抗菌、抑菌，因此在研究四環(huán)素對(duì)漁業(yè)環(huán)境中的微生物的影響時(shí)，國(guó)內(nèi)外的大量學(xué)者主要針對(duì)四環(huán)素對(duì)細(xì)菌和真菌的生態(tài)毒性開(kāi)展大量研究。Backhaus等[46]通過(guò)對(duì)費(fèi)氏弧菌的長(zhǎng)達(dá)24 h生物發(fā)光抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)5大類常用抗生素的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，四環(huán)素類抗生素干擾蛋白質(zhì)合成以及干擾DNA/RNA合成，對(duì)該細(xì)菌具有強(qiáng)毒性，半數(shù)有效濃度(EC50)值為0.025 1 mg/kg。

作為漁業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者，藻類在維持整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性中具有非常重要的作用，漁業(yè)環(huán)境中抗生素大量富集，必然會(huì)對(duì)藻類造成影響[47-49]。四環(huán)素類藥物通過(guò)抑制微藻類蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成從而最終抑制微藻的生長(zhǎng)。Fernández等[50]研究表明，強(qiáng)力霉素對(duì)綠藻的半抑制濃度為15.2 mg/L；趙素芬等[51]在室溫條件下研究了不同濃度的土霉素對(duì)等鞭金藻細(xì)胞增殖和光合色素含量的影響，研究表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，土霉素的濃度越大，等鞭金藻葉綠素a含量越少，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞的光合作用強(qiáng)度下降，影響藻細(xì)胞的繁殖能力。

漁業(yè)環(huán)境中的四環(huán)素殘留不僅對(duì)微生物、藻類產(chǎn)生毒性，對(duì)甲殼動(dòng)物也有一定影響，一般來(lái)說(shuō)，抗生素對(duì)水生甲殼動(dòng)物產(chǎn)生毒性的質(zhì)量濃度要比細(xì)菌和藻類高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。Wollenberger等[52]研究了集約化漁場(chǎng)常用的9種抗生素對(duì)大型淡水藻繁殖能力的影響，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，土霉素的48 h EC50約為1 000 mg/L，而四環(huán)素的最高無(wú)效應(yīng)濃度(NOEC)為340 mg/L，一般情況下，比急性毒性水平低一個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的抗生素才能對(duì)大型蚤的繁殖能力產(chǎn)生毒性作用；在慢性毒性實(shí)驗(yàn)中, 四環(huán)素EC50值為44. 8 mg/L，而土霉素EC50值為46. 2 mg/L。

上述研究大部分只是針對(duì)急、慢性毒性實(shí)驗(yàn)的直接結(jié)果，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素殘留對(duì)魚類生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。王慧珠等[53]以大型蚤、斑馬魚和鯽作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討了環(huán)境中的四環(huán)素和金霉素對(duì)3種水生生物的急性毒性，實(shí)驗(yàn)表明，四環(huán)素對(duì)鯽和斑馬魚96 h半致死濃度(LC50)分別為322. 8和406.0 mg/L，金霉素對(duì)鯽和斑馬魚96 h LC50值分別為34.68和61.15 mg/L。根據(jù)腎細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)可以看出在一定的濃度范圍內(nèi)土霉素能誘導(dǎo)鯽的腎細(xì)胞產(chǎn)生較大的DNA損傷，與陰性對(duì)照相比均有極顯著性差異(P<0.01)[54]。李兆利等[55]以鯉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，得到了土霉素誘導(dǎo)鯉腎細(xì)胞DNA損傷的相同結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)土霉素對(duì)鯉胚胎有致畸效應(yīng)。四環(huán)素類藥物的基因毒性可能對(duì)生物的影響更加深遠(yuǎn)。

4 小結(jié)

水產(chǎn)品及漁業(yè)環(huán)境中四環(huán)素類抗生素殘留對(duì)動(dòng)植物及人類均有不利影響，目前對(duì)水產(chǎn)品中抗生素殘留的研究已經(jīng)比較成熟，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都總結(jié)了比較合適的前處理過(guò)程和檢測(cè)方法，國(guó)家和地方也出臺(tái)了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，但是對(duì)漁業(yè)環(huán)境中四環(huán)素抗生素殘留的研究較少，相關(guān)的研究也大都集中在四環(huán)素抗生素對(duì)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境的毒性，對(duì)漁業(yè)環(huán)境中殘留的檢測(cè)方法的報(bào)道較少，目前國(guó)家也沒(méi)有出臺(tái)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，因此加強(qiáng)漁業(yè)環(huán)境中四環(huán)素抗生素殘留的前處理方法和檢測(cè)方法的調(diào)查研究，對(duì)漁業(yè)環(huán)境中檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立、限量標(biāo)準(zhǔn)的制定都具有重要的意義。

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Research progress of the detection method of tetracyclines antibiotics residues and its influence on fishery environment

MENG Lihua*, SHI Yanwei, SHI Bin, MENG Juan, JIANG Bangtong, WU Guangzhou

(Jining Fishery Monitoring Station，Jining 272000，China)

The tetracyclines have been widely used in aquaculture since they were cultured and extracted. In recent years, the tetracyclines residues in aquaculture and fishery environment have drawn extensive attention. This paper summarized the pretreatment and detection method of tetracycline residues in aquatic product. In addition, the impact of tetracycline on the fishery environment was introduced in detail. This paper would lay a foundation for developing the detection method of the tetracyclines residues and setting up standards for its limit in fishery environment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):50-55]

tetracyclines; residues; detection method; fishery environment;aquatic product;pretreatment

MENG Lihua, menglihua521@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.008

2016-11-01；接收日期：2016-11-22

山東省常規(guī)專家項(xiàng)目(370020120042)

孟麗華(1979-)，女，碩士研究生，中級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全與控制， menglihua521@163.com

S94

A

2095-1833(2017)01-0050-06