多種魚類肌漿蛋白與過敏患者血清特異性IgE結(jié)合情況檢測與分析

石徑，羅永康*，江米足

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.浙江大學附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310001)

多種魚類肌漿蛋白與過敏患者血清特異性IgE結(jié)合情況檢測與分析

石徑1，羅永康1*，江米足2

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.浙江大學附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310001)

收集浙江地區(qū)過敏性疾病患者血清80例，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定7種魚類肌漿蛋白與對魚過敏和僅對蝦蟹過敏兩組過敏患者血清特異性IgE的結(jié)合能力。通過凝膠電泳和免疫印跡分析多種魚類肌漿蛋白的蛋白質(zhì)組成和過敏原分布情況。實驗結(jié)果顯示，魚過敏和蝦蟹過敏兩組患者血清對每種魚肌漿蛋白特異性IgE陽性率之間的比較無顯著性差異，具有一定的一致性。過敏患者血清與不同種魚類肌漿蛋白反應的陽性率有所差別，總體來看虹鱒(Oncorhynchusmykiss)陽性率最高(70.67%)，其次為大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(46.67%)和大口黑鱸(Micropterussalmoides)(26.39%)，鳙、鯉、草魚和鱘的陽性率相對較低。電泳分析顯示不同種魚類的蛋白質(zhì)組成存在一定差異。免疫印跡結(jié)果顯示，不同品種魚類與陽性血清反應的組分有所差異，而其中特異性反應陽性率較高的虹鱒、大菱鲆和大口黑鱸3種魚在分子量12 kDa左右存在特異蛋白條帶。本研究對魚過敏和蝦蟹過敏人群血清中多個品種魚類的肌漿蛋白特異性IgE進行了全面的檢測分析，對水產(chǎn)品過敏疾病的預防和低致敏性水產(chǎn)食品的開發(fā)，提供一定的理論依據(jù)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2017,7(1):22-28]

魚蛋白過敏；特異性IgE；肌漿蛋白；過敏患者血清

食物過敏一直是備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，隨著社會的進步和發(fā)展，食物過敏性疾病的發(fā)病率逐年增加，給人們的生命健康造成了巨大的威脅[1]。食物過敏是人體對食品中抗原物質(zhì)產(chǎn)生的主要由免疫球蛋白E(IgE)介導的Ⅰ型超敏反應，臨床上表現(xiàn)為蕁麻疹、哮喘和腹瀉等癥狀，嚴重可導致休克[2]。食物過敏性疾病主要通過體內(nèi)皮膚點刺試驗和體外血清特異性IgE檢測等方法進行診斷[3]。在聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)提出的8大類容易引起過敏的食物中，魚類是其中重要的種類，過敏發(fā)病率較高[4]。楊華等[5]對370例慢性蕁麻疹患者的檢測發(fā)現(xiàn)，食物性變應原陽性率最高的是淡水魚(61.35%)，其次為海蟹(55.68%)、海魚(37.84%)。

小清蛋白是魚類最主要的過敏原蛋白，國外自1971年首次從鱈(Theragrachalcogramma)中發(fā)現(xiàn)小清蛋白后，在魚類過敏方面做了許多的研究工作[6-8]。機體對小清蛋白不同表位產(chǎn)生不同的特異性IgE抗體，患者臨床上可能對多種魚類都產(chǎn)生過敏反應，也可能僅對某種魚表現(xiàn)出過敏反應[9]。國際上對魚類過敏的報道大多集中在海水魚，國內(nèi)起步較晚，目前對魚類過敏原的研究正在逐漸深入[10-11]。目前的研究和報道已鑒定出多種魚類過敏原，Li等[12]從草魚(Ctenopharyngodonidellus)中純化分離并鑒定出草魚主要過敏原小清蛋白的3個亞型，分子量均在11 kDa左右。Guo等[8]從日本海鯛(Evynnisjaponica)白肉中發(fā)現(xiàn)除了小清蛋白，還有一種14 kDa的過敏原蛋白。Liu等[13]鑒定出淡水魚團頭魴(Megalobramaamblycephala)中2種主要的過敏原蛋白，免疫印跡分析中與過敏血清的IgE表現(xiàn)出特異性結(jié)合，兩種過敏原的分子量分別為47和41 kDa，經(jīng)鑒定兩個過敏原分別為烯醇酶的亞型和肌肉肌酸激酶。中國是魚類特別是淡水魚生產(chǎn)和消費大國，因食用魚類而引起過敏的現(xiàn)象也時有發(fā)生。不同種魚類在魚過敏患者人群中的致敏率是否有差別，對其他水產(chǎn)品過敏的患者是否對魚類產(chǎn)生交叉過敏反應，目前還鮮有報道。本研究以國內(nèi)常見的鳙(Aristichthysnobilis)、鯉(Cyprinuscarpio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鱘(Acipensersinensis)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)7種魚類為研究對象，提取其肌漿蛋白，通過ELISA、SDS-PAGE和Western blot方法檢測魚類蛋白與魚過敏患者血清特異性IgE的結(jié)合能力，分析和比較不同種魚類蛋白的致敏能力。同時與魚蛋白和僅對蝦蟹過敏患者血清的特異性IgE結(jié)合能力進行差異性比較，分析對蝦蟹過敏患者與魚蛋白的交叉反應情況。為魚類過敏的研究和低致敏性魚類食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的鳙、鯉、草魚、鱘、大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆購買于北京小月河農(nóng)貿(mào)市場，快速活體運至實驗室，擊斃，去鱗，取背部白色肉進行蛋白的提取。

過敏患者血清：收集浙江大學附屬兒童醫(yī)院經(jīng)臨床診斷為蕁麻疹、哮喘、過敏性鼻炎等過敏性疾病，并在過敏原檢驗報告單中顯示對魚類過敏原檢測為陽性(特異性IgE含量(0.35 IU/mL)的兒童患者血清共67例(血清編號分別為：1-52、1-75、1-76、1-79、1-80、1-81、1-84、1-97、1-110、1-116、1-121、1-126、1-130、1-138、1-163、1-163、1-165、1-167、1-170、1-175、1-176、1-182、1-191、2-9、2-11、2-13、2-15、2-17、2-22、2-26、2-29、2-32、2-48、2-56、2-57、2-59、2-60、2-61、2-68、2-71、2-75、2-82、2-90、2-94、2-96、2-100、2-101、2-104、2-107、2-116、2-126、2-129、2-132、2-134、2-145、2-147、2-151、2-154、2-167、2-169、2-174、2-181、2-186、2-187、2-188、2-196、2-197、2-198)，另收集僅對蝦和蟹過敏原檢測為陽性的患者血清13例(血清編號分別為：1-179、1-195、1-208、1-222、1-223、2-77、2-166、2-173、3-17、3-45、3-80、3-83、3-85)。過敏患者血清共計80例，其中男性50例，女性30例；年齡在6個月～12歲之間。

陰性血清：收集個人和家庭成員均無過敏性疾病的人的血清9例，其中男性5例，女性4例，陰性血清混合制成血清池，作為ELISA和Western blot檢測中的陰性對照。血清分離后至檢測前于-60 ℃保存。

試劑：辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgE抗體(Sigma)；蛋白質(zhì)標準分子量；其他所用藥品或試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 魚肉肌漿蛋白的制備

取5 g絞碎的魚肉，加入5倍體積冷的0.02 mol/L Tris-HCl，pH7.5的緩沖溶液，均質(zhì)后，4 ℃靜止30 min，10 000 g離心20 min，取上清液即為肌漿蛋白，雙縮脲法測定其蛋白含量。1.2.2 魚肌漿蛋白與過敏患者血清IgE結(jié)合能力的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定7種魚肉肌漿蛋白與過敏患者血清IgE抗體的特異性結(jié)合能力。7種魚肌漿蛋白的包被濃度為0.01 mg/mL，5倍稀釋的魚過敏和蝦蟹過敏患者血清分別作為一抗，同時添加陰性血清作為對照。二抗為羊抗人IgE-HRP(Sigma)，稀釋倍數(shù)500倍。利用酶標儀雙波長測定各孔450和630 nm下的吸光值OD450和OD630，各孔吸光值記為OD=OD450-OD630。

魚肉肌漿蛋白與過敏患者血清的結(jié)合能力通過吸光值高于陰性血清的百分比來表示，計算公式為：魚蛋白與IgE結(jié)合能力(%)=(OD-OD0) /OD0×100。其中，OD為各患者血清ELISA法測定的吸光值；OD0為陰性血清對應的吸光值。ELISA反應呈陽性血清的篩選，以魚蛋白與過敏患者血清IgE結(jié)合能力>100%為標準。

1.3 SDS-PAGE電泳

采用SDS-PAGE對7種魚肌漿蛋白中的蛋白質(zhì)組分進行分析。肌漿蛋白與電泳樣品緩沖液1 ∶1(V/V)混合，沸水浴加熱5 min，上樣量為80 μg。電泳分離膠濃度10%，濃縮膠4%，初始電壓80 V，至樣品前沿剛好進入分離膠后，電壓提高到120 V。

1.4 Western blot分析

將魚過敏患者血清中ELISA檢測顯示至少對1種魚蛋白呈陽性的血清混合制成陽性血清池，與7種魚類魚肌漿蛋白提取液進行Western blot，混合的陰性血清池作為陰性對照。魚肌漿蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE分離后，將凝膠根據(jù)蛋白分子量大小分為上、下兩部分，200 mA恒流，大、小分子量凝膠轉(zhuǎn)膜時間分別為90 min和15 min，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂乳粉37 ℃封閉1 h，人血清用封閉液稀釋10倍，4 ℃孵育過夜，TBST清洗5次(前兩次5 min/次，后三次10 min/次)，二抗(HRP標記的羊抗人IgE，1 ∶10 000)37 ℃孵育1 h，TBST清洗5次，加入ECL化學發(fā)光液后，于暗室中將膜曝光于X光片上，顯影、定影后掃描保存結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和SPSS 17.0軟件進行檢驗，計量資料以平均數(shù)±標準差表示，兩組間率(%)的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚肌漿蛋白與過敏患者血清IgE結(jié)合能力的檢測

采用ELISA法檢測7種魚肌漿蛋白與收集的過敏患者血清特異性IgE結(jié)合能力的結(jié)果如圖1所示?？傮w來看，不同種類的魚肌漿蛋白與過敏患者血清IgE的結(jié)合能力存在差別。虹鱒的肌漿蛋白與所檢測的血清呈陽性反應的比例最高，陽性血清共53例(陽性率70.67%)，其次與大菱鲆和大口黑鱸兩種魚肌漿蛋白反應呈陽性的血清比例較高，血清陽性率分別為46.67%和26.39%。另外4種魚類肌漿蛋白與血清反應的陽性率較低，從高到低分別為草魚(16.00%)、鯉(8.00%)、鳙(5.33%)和鱘(2.67%)。

2.2 兩組水產(chǎn)過敏患者血清檢測陽性率比較

將水產(chǎn)過敏患者血清根據(jù)病例信息分為魚過敏和蝦蟹過敏兩組，對兩組血清中不同魚蛋白特異性IgE檢測陽性率及陽性例數(shù)的比較見表1?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，兩組血清對不同種魚類肌漿蛋白的特異性IgE陽性率不存在顯著性差異，表明兩組血清對每種魚肌漿蛋白的特異性IgE陽性率有一定的一致性。整體而言，魚過敏患者血清對不同魚類蛋白的陽性率存在差異，陽性率在3.0%～71.6%之間；蝦蟹過敏患者血清對鳙、草魚和鱘3種魚無陽性反應，對其他4種魚的陽性率分布在12.5%～62.5%之間。兩組血清陽性率最高的均為虹鱒，其次是大菱鲆和大口黑鱸。結(jié)果顯示，在醫(yī)院診斷為魚過敏和蝦蟹過敏的患者血清樣本中，不同品種魚類蛋白的特異性IgE陽性率存在差異，不同魚類的致敏能力不同。僅對蝦蟹過敏的患者血清對鳙、草魚和鱘蛋白的交叉反應較弱，對其他4種魚類蛋白存在不同程度的交叉反應。目前對過敏患者過敏原IgE的檢測也有較多的相關(guān)研究，但對多個品種魚類過敏原的檢測和分析較少。戴海玲等[14]對患有蕁麻疹及濕疹、哮喘和過敏性紫癜3組患兒血清中過敏原IgE進行的檢測結(jié)果顯示，水產(chǎn)品過敏原陽性率由高到低依次為：蝦、蟹、海魚組合和淡水魚組合。李敏等[15]對南京地區(qū)患有哮喘、過敏性鼻炎和蕁麻疹不同過敏性疾病的1 047名患兒血清進行過敏原檢測的結(jié)果顯示，患兒血清整體對鱈、龍蝦、扇貝陽性率最高，達14.61%，其次為鮭(7.92%)、蟹(6.20%)和蝦(4.87%)。

表1 兩組水產(chǎn)過敏患者血清對多種魚類蛋白特異性IgE檢測陽性結(jié)果比較

2.3 魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析

7種魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析如圖2所示。不同魚類肌漿蛋白的電泳圖譜存在一定的差異性，鳙、鯉和草魚3種魚肌漿蛋白的組成十分相似，其中草魚在26～55 kDa分子量范圍內(nèi)的蛋白濃度相對較高，條帶較深，這與3種魚中草魚的過敏患者血清陽性率相對較高具有一致性。鱘、大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆4種魚的肌漿蛋白組成與前3種魚的差別較大，在分子量10～17 kDa和分子量20～55 kDa的蛋白條帶差異較明顯，差異蛋白中可能存在一種或多種過敏原蛋白，從而導致大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆3種魚肌漿蛋白與過敏患者血清反應的陽性率較高。目前的研究和報道已鑒定出多種魚類過敏原，魚類主要的過敏原蛋白小清蛋白分子量在12 kDa左右，Liu等[13]鑒定出淡水魚團頭魴中2種主要的過敏原蛋白為烯醇酶的亞型和肌肉肌酸激酶，分子量分別為47和41 kDa。

圖1 7種魚肌漿蛋白與過敏患者血清特異性IgE的結(jié)合能力Fig.1 Specific IgE binding capacity of sarcoplasmic protein of seven kinds of fishes in serum of patients with aquatic allergy

圖2 幾種魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析M: 標準蛋白；1: 鳙；2: 鯉；3: 草魚；4: 鱘；5: 大口黑鱸；6: 虹鱒；7: 大菱鲆。下同。Fig.2 SDS-PAGE analysis of sarcoplasmic protein ofseveral kinds of fishesM:Standard protein; 1: Aristichthys nobilis; 2: Cyprinus carpio; 3: Ctenopharyngodon idellus; 4: Acipenser sinensis; 5: Micropterus salmoides; 6: Oncorhynchus mykiss; 7: Scophthalmus maximus. The same below.

2.4 Western blot對魚蛋白過敏原的分析

魚過敏患者陽性血清與陰性血清分別與7種魚肌漿蛋白的western blot分析結(jié)果如圖3所示。陰性血清也存在不同程度的結(jié)合條帶，這可能是因為人血清相比制備抗體成分更復雜，因而存在非特異性結(jié)合。與陰性對照血清相比，7種魚類肌漿蛋白與陽性過敏患者血清反應的蛋白組分有所差異，條帶數(shù)量均明顯多于陰性血清。特別對ELISA檢測中與過敏患者血清結(jié)合陽性率較高的大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆3種魚進行分析，與陰性血清對比可以看出這3種魚類在分子量12 kDa左右和分子量20～50 kDa范圍存在較多特異蛋白條帶。其中12 kDa左右的特異條帶為大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆3種魚特有，另4種魚中均未檢測出，但大菱鲆與陰性血清在12 kDa處也存在明顯的結(jié)合條帶，是非特異性結(jié)合或是其他原因還有待進一步研究。Western blot結(jié)果分析與大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆3種魚與患者血清特異性IgE檢測陽性率較高具有一致性，且分子量與文獻報道的小清蛋白分子量較一致，因此推斷分子量12 kDa左右的特異蛋白條帶很可能是魚類最主要的過敏原小清蛋白。

7種魚肌漿蛋白的western blot檢測中，鱘的特異條帶相對最少，這也與ELISA檢測中鱘魚蛋白與血清結(jié)合的陽性率最低相一致。鳙、鯉和草魚3種魚檢出的條帶最多，分子量分布在20～60 kDa范圍，但3種魚在ELISA檢測中與過敏患者血清結(jié)合的陽性率較低，這可能是因為較高分子量范圍的蛋白相比12 kDa左右的小清蛋白的致敏性較弱，且患者血清與制備抗體相比在純度和特異性方面都相差許多，因此可能存在一些非特異性結(jié)合的條帶。

圖3 幾種魚肌漿蛋白與陽性過敏血清(a)和陰性對照血清(b)的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of sarcoplasmic protein of several kinds of fishes with allergic positive serum(a) and negative control serum (b)

3 結(jié)論

不同種魚類的肌漿蛋白與對魚過敏和蝦蟹過敏患者血清特異性IgE的結(jié)合能力有所差別，其中虹鱒與血清特異性IgE結(jié)合能力最強，血清陽性率最高，其次是大菱鲆和大口黑鱸，鳙、鯉、草魚和鱘與血清反應的陽性率相對較低。魚過敏和蝦蟹過敏兩組患者血清對每種魚肌漿蛋白的特異性IgE陽性率之間的比較無顯著性差異，具有一定的一致性。蝦蟹過敏患者血清對不同種魚存在不同程度的交叉反應，其中對鳙、草魚和鱘3種魚類交叉反應較弱。電泳和免疫印跡分析顯示與血清結(jié)合陽性率較高的大口黑鱸、虹鱒和大菱鲆3種魚肌漿蛋白在12 kDa左右存在特異蛋白條帶，7種魚類均在免疫印跡分析中檢測出不同程度的蛋白條帶。本研究檢測分析了魚過敏和蝦蟹過敏患者人群中對7種魚類肌漿蛋白的特異性IgE分布情況，對不同品種魚類致敏性的研究具有一定的參考價值。

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Detection and analysis of the binding activities of IgE from allergic patients to sarcoplasmic protein of different kinds of fishes

SHI Jing1, LUO Yongkang1*, JIANG Mizu2

1.College of Food Science﹠Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China； 2.Children’s Hospital affiliated with Zhejiang University, Hangzhou 310001, China)

Sera from 80 fish-allergic and only shrimp and crab-allergic patients were collected in Zhejiang region, and the binding activities of IgE in patients sera to sarcoplasmic proteins from 7 species of fish were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The protein composition and allergen distribution of fish were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. Results demonstrated that there was no significant difference in specific IgE positive rate between fish allergic and only shrimp and crab-allergic patients. But allergic patients’ sera had different positive rate in reaction with different kinds of fish proteins. The proteins ofOncorhynchusmykiss,ScophthalmusmaximusandMicropterussalmoideswere more allergenic with the positive rate of 70.67%, 46.67% and 26.39%, respectively. In constrast,Aristichthysnobilis,Cyprinuscarpio,CtenopharyngodonidellusandAcipensersinensishad relatively low positive rate. SDS-PAGE analysis showed that the composition of protein was different in 7 fish species. Western blot results showed that the components of fish species had various reaction with positive sera. Thereinto, three species of fish (Oncorhynchusmykiss,ScophthalmusmaximusandMicropterussalmoides), which was higher positive rate, were detected about 12 kDa specific protein bands. In summary, the study was detected and analyzed the specific IgE binding capacity in sera from fish-allergic and shrimp and crab-allergic patients to sarcoplasmic protein of varieties of fish. These provided some references for the diseases prevention of aquatic products and the development of hypoallergenic aquatic food. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):22-28]

fish protein allergy; specific IgE; sarcoplasmic protein; allergic patients serum

LUO Yongkang，luoyongkang@263.net

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.004

2016-07-19；接收日期：2016-09-16

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金資助(CARS-46)

石徑(1988-)，女，博士研究生，研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工技術(shù)，shijing0422@126.com 通信作者：羅永康，教授，博士生導師，研究方向為水產(chǎn)品貯藏加工技術(shù)，luoyongkang@263.net

S912；TS254.1

A

2095-1833(2017)01-0022-07