水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測方法的優(yōu)化

左舜宇，張?zhí)炻?/p>

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建，福州 350003)

水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測方法的優(yōu)化

左舜宇，張?zhí)炻?

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建，福州 350003)

對水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法進行了優(yōu)化。樣品依靠緩沖鹽體系將目標物質(zhì)離子化后用酸性氧化鋁除脂，利用乙腈提取，濃縮后過中性氧化鋁小柱凈化，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用1.00 mL 5 mmol/L乙酸銨0.1%甲酸-甲醇溶液(1 ∶1，V/V)定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機檢測，采用同位素內(nèi)標法定量。方法優(yōu)化后孔雀石綠和隱色孔雀石綠的線性范圍為0.5～20.0 ng/mL，相關系數(shù)均為0.999 9，檢出限為0.500 μg/kg,平均回收率分別為83.4%～101%和86.1%～101%，相對標準偏差(RSD，n=5)分別為3.44%～7.76%和2.28%～8.74%。該方法靈敏度高，準確性好，與現(xiàn)有國家標準相比，本方法減少了有機溶劑使用量、簡化了前處理步驟，并且穩(wěn)定了目標物質(zhì)回收率。通過驗證，該方法適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠殘留的檢測。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2017,7(1):35-40]

水產(chǎn)品；孔雀石綠；隱色孔雀石綠；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

孔雀石綠(四甲基代二氨基三苯甲烷，malachite green，MG)又名堿性綠、孔雀綠、鹽基塊綠和苯胺綠，極易溶于水，水溶液呈藍綠色，是人工合成的綠色帶有金屬關澤的結(jié)晶體，屬于三苯甲烷型的綠色染料[1-2]，曾作為工業(yè)染料廣泛用于絲綢、皮革、羊毛等染色劑[3]。因其具有抗菌效果好、抗菌譜廣、價格便宜、容易獲得等優(yōu)點，從20世紀30年代開始，就被作為驅(qū)蟲劑、防腐劑、殺菌劑[4-6]用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖中；后來還被廣泛用于治療和預防各類水生動物的鰓霉病、水霉病和小瓜蟲病[7]等，尤其在治療水霉病上具有特殊療效；另外還被用于活魚運輸、池塘暫時養(yǎng)殖過程中以及環(huán)境消毒等[8-11]。MG一般以草酸鹽或者氯化物的形式存在，吸附并富集在肌肉中，通過還原酶的作用很快代謝為溶脂性的隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)，其在肌肉組織中消除緩慢殘留時間較長。

1992年，國外有關研究人員提出MG等物質(zhì)的官能團三苯甲基可導致肝癌，被國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為了二類致癌物，經(jīng)研究表明長期食用含有MG和LMG殘留的水產(chǎn)品，容易在體內(nèi)富集引起肝、心臟、腎、眼睛、血液、脾、皮膚等臟器和組織慢性中毒[12]。但由于缺乏有效的替代物以及利益驅(qū)使，MG的違禁使用仍然時有發(fā)生。在2005年6月，英國食品標準局在英國當?shù)爻谐闄z水產(chǎn)品時檢測出MG；同年，重慶執(zhí)法人員在水產(chǎn)交易市場查獲含MG的甲魚600多只；在2016年，5月廣東省食藥監(jiān)局在惠州市酒店抽檢的散裝桂花魚中被檢測出LMG，6月香港食物環(huán)境衛(wèi)生署食物安全中心在白鱔樣本中驗出含微量MG，同月山東省食品藥品監(jiān)督管理局在市區(qū)一超市所售鯽中檢出MG[13-17]。

如何能快速、準確的檢測孔雀石綠是當前全面開展水產(chǎn)品食品安全監(jiān)管的內(nèi)容之一。目前，通常采用GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》中推薦的方法進行檢測，然而該方法專業(yè)性要求高，步驟繁瑣，且回收率不穩(wěn)定。本研究旨在優(yōu)化建立水產(chǎn)品中MG及LMG的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過采用固相萃取凈化，對前處理步驟進行優(yōu)化研究，在保證精密度高、回收率穩(wěn)定的前提下優(yōu)化方法以達到快速、準確的要求。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、耗材及儀器

乙腈(CH3CN，色譜純)；甲醇(CH3OH，色譜純)；二氯甲烷(CH2Cl2，色譜純)；無水乙酸(C2H4O2，色譜純)；乙酸銨緩沖溶液(0.1 mol/L CH3COONH4，用冰乙酸調(diào)至pH=4.5)；乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L CH3COONH4，用冰乙酸調(diào)至pH=4.5)；乙酸銨-甲醇溶液(5%)；陽離子交換柱(Waters，MCX，60 mg/3 mL)；鹽酸羥胺溶液(HONH3Cl，0.25 g/mL)；對一甲苯磺酸溶液(p-CH3C6H4SO3H，1.0 mol/L)；中性氧化鋁柱(ANPEL 1 g/3 mL)；(超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm，Milli-Q Gradient超純水，美國Millipore公司)。

超高效液相色譜(Acquity UPLC，美國Waters公司)；三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB Sciex Triple Quad 5500，美國AB公司，配有電噴霧ESI離子源)；離心機(Sigma 3K-30)；渦旋式混合器(IKA MS 3，德國IKA公司)；勻漿機(IKA T25)；pH計(Eutech pH510)；分析天平(Sartorius-SQP)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為 Acquity UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相 A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸 (1 ∶1,V/V)，流動相B為乙腈；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為1.0 μL；樣品室溫度為10 ℃；離子源為電噴霧離子源ESI；毛細管電壓為3.5 kV；脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔氣流量50 L/h。采用正離子掃描方式，多反應監(jiān)測模式(MRM)。液相色譜梯度洗脫條件見表1，質(zhì)譜定性定量離子對信息見表2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

表2 目標化合物信息

1.3 實驗方法

優(yōu)化前實驗過程參照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》進行操作。

優(yōu)化后實驗過程按照以下步驟進行：稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，分別加入100 ng/mL內(nèi)標溶液0.050 mL，0.100 mol/L 乙酸銨(甲酸調(diào)pH=4.50)2.00 mL，1.00 mol/L 對甲苯磺酸2.00 mL，250 mg/mL鹽酸羥胺1 mL，10.0 mL 乙腈，振蕩1 min后，再加入5.00 g酸性氧化鋁，振蕩混勻1 min，然后11 000 r/min離心5 min，取出上清液；殘渣加5 mL乙腈重復溶解，振蕩混勻1 min后，10 000 r/min離心5 min，合并離心上清液至另一離心管中，在該試管中加5 mL水，使用10.0 mL二氯甲烷萃取2次，振蕩混勻1 min，再次10 000 r/min離心5 min，將有機相通過無水硫酸鈉除水合并后取出，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

用2.00 mL 乙腈溶解殘渣3次，溶解液轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁柱(1 g/3 mL，先用乙腈潤洗)，收集流出液，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1.00 mL 5mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(1 ∶1,V/V)溶液定容，0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化前方法檢測結(jié)果

各取10份鰻鱺樣品進行加標(MG和LMG 各10 μg)，使用國標GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》中生鮮水產(chǎn)品和加工水產(chǎn)品的方法進行實驗，檢測分析結(jié)果見表3、表4。

表3 使用鮮活水產(chǎn)品檢測方法測定鮮活鰻鱺樣品實驗結(jié)果

表4 使用加工水產(chǎn)品檢測方法測定鮮活鰻鱺樣品實驗結(jié)果

從結(jié)果可知，參照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》方法在提取后大部分檢測結(jié)果無法滿足回收率要求(70%～120%)，生鮮水產(chǎn)品前處理方法提取效率低，方法雖然步驟簡單，可是回收率偏差較大。而對加工水產(chǎn)品的檢測方法，出現(xiàn)回收率普遍偏高的情況，但其回收率相對穩(wěn)定，因此將其作為本次優(yōu)化方法改進的基礎。

2.2 方法優(yōu)化

2.2.1提取過程優(yōu)化

在GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》方法中，需對樣品進行勻漿，在勻漿結(jié)束后損失在刀頭上的樣品較多，即使在用乙腈清洗刀頭仍會造成樣品和目標物質(zhì)的損失。因此本實驗將國標勻漿過程優(yōu)化為使用渦旋振蕩儀，在3 000 r/min下渦旋1 min，既避免了目標物的損失，又提高樣品的提取速度，減少實驗時間。

原國標方法使用分液漏斗進行液體分層，在振蕩后有部分樣品發(fā)生乳化，待分層過程等待時間長，且乳化層含水量高，不利于后續(xù)實驗。本實驗將分液漏斗改為用試管渦旋振蕩后離心，同時將下層有機相通過無水硫酸鈉除水后進行收集，避免了有機相中乙腈攜帶的水溶液收集到收集瓶中，影響后續(xù)實驗。

2.2.2實驗試劑用量優(yōu)化

對有機試劑加入量進行了優(yōu)化(表5)，通過減少有機試劑的用量不僅可以降低實驗成本，還可以有效控制實驗風險。原國標方法中乙腈與二氯甲烷的混合液比例接近2 ∶1 (V/V)會導致乙腈層與水相可能存在無法分離的情況，并且提取液中含有水相，后續(xù)濃縮過程無法完全蒸發(fā)干，將會延長實驗時間且存在暴沸的風險。

表5 實驗試劑使用量優(yōu)化

2.2.3 凈化方法優(yōu)化

LMG具有很好的親脂性，當樣品基質(zhì)復雜時，將不利于樣品中目標物質(zhì)的提取和凈化。比較了常用的凈化柱C18、HLB、MCX和氧化鋁柱的凈化效果，其中在氧化鋁柱的選擇上，由于酸性氧化鋁小柱在用乙腈活化后對脂肪的吸附能力變?nèi)?，而堿性氧化鋁在凈化過程中對MG也有吸附作用，容易使目標物造成損失，所以本次實驗選用中性氧化鋁小柱。各類型回收率對比結(jié)果見圖1。從對比結(jié)果可知中性氧化鋁柱凈化效果最好。

2.3 優(yōu)化后方法檢測結(jié)果

采用添加標準物質(zhì)的方法考察方法靈敏度。參考國標GB/T 19857—2005中檢出限為0.500 μg/kg，在優(yōu)化方法實驗條件下，以最低含量0.500 μg/kg進行加標，添加水平結(jié)果和離子色譜圖見圖2,方法優(yōu)化后的檢出限為0.500 μg/kg。通過觀察總離子流圖可知MG與LMG的峰形明顯，出峰時間準確，響應值強，靈敏度高。

用質(zhì)量濃度為0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的工作液繪制標準曲線，相關系數(shù)為0.999 9，可知曲線具有較好的線性相關性，線性回歸方程見表6。

圖1 各固相萃取柱凈化效果對比(n=3)Fig.1 Thepurified effects contrast of each SPE column

圖 2 0.500 μg·kg-1加標樣品質(zhì)譜圖Fig.2 The spectrum of spiked 0.500 μg·kg-1 sample

采用優(yōu)化后的方法對大黃魚、鯉、鱸、黑鯛、草魚、鯽、鮑、鰻鱺、鋸緣青蟹和南美白對蝦進行加標比對，檢測結(jié)果見表7、表8。從檢測結(jié)果可以看出，優(yōu)化后的檢測方法MG回收率在83.4%～101%，相對標準偏差(RSD，n=5)為3.44%～7.76%，LMG回收率在86.1%～101%,相對標準偏差(RSD，n=5)為2.28%～8.74%，比優(yōu)化前的檢測方法有了較大程度的改善，符合實際工作的需求。

表6 MG和LMG的回歸方程以及相關系數(shù)

表7 水產(chǎn)品中MG回收率和精密度

表8 LMG回收率和精密度

3 結(jié)論

隨著儀器設備和檢測分析方法不斷更新，樣品前處理就顯得尤為重要。相比國標，本研究做出了部分優(yōu)化改進，有機溶劑和材料用量減少，檢測成本降低，測定結(jié)果準確，MG和LMG加標回收率在83.4%～101%，相對標準偏差均小于10%。將優(yōu)化后的實驗方法應用于不同樣品的實際檢測，證明了該方法具有準確、簡便、快速的優(yōu)點，滿足實際檢測工作需求。

[1] 李寧. MG對健康的影響[J]. 國外醫(yī)學(衛(wèi)生分冊)，2005, 32(5): 65-69.

[2] 龔朋飛，王權，陳永軍. MG毒性及其檢測研究進展[J].水利漁業(yè), 2007, 27(4): 14-15.

[3] Culp S J, Beland F A，Heflich R H,et al.Mutagenicity and carcinogenicity in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite green [J], Mutat Res, 2002(506 /507): 55-63.

[4] Cambell R E, Lilley J H T, Panyawachira V, et al.Invitroscreening of novel treatments of alpha-nomyces invadans[J]. Aquac Res, 2001, 32(3): 44-45.

[5] Gouvello R L E, Pobel T, Richards R H, et al. Field efficacy of a ten days treatment of fumagillin against proliferative kidney disease in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture, 1999, 171: 44-49.

[6] Foster F J, Woodbury L. The use of malachite green as a fish fungicide and antiseptic [J]. Food Sci Biotechnol, 2012, 21(2): 519-524.

[7] 李池陶，徐偉，賈智英，等. 防治松浦鏡鯉魚卵水霉病藥物的篩選[J].水產(chǎn)學雜志， 2011, 24(4): 5-7.

[8] Shivaji S, Ranjana S．Toxicological effects of malachite green[J]．Aquat Toxicol, 2004, 66(3): 319-329.

[9] 倪達書. 魚類水霉病防治研究[J]. 農(nóng)村實用科技, 1986(8): 26-26.

[10] Alderman D J. Malachite green-a review [J]. Fish Dis, 1985, 8(3): 16-18.

[11] 蔡鳳英．淺談MG的危害[J]．河南水產(chǎn)，2006(l): 11-12.

[12] Cha C J, Doerge D R, Cerniglia C E.Biotransformation of malachite green by the fungus cunninghamella elegans [J]. Appl Environ Microbial, 2001, 67(9): 33-35.

[13] 岳亞軍, 夏偉, 游杰, 等. 液質(zhì)聯(lián)用法對魚類水產(chǎn)品中MG的調(diào)查分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2015(4): 11-15.

[14] 王敏娟, 聶曉玲, 程國霞, 等. 陜西省淡水魚中MG的污染調(diào)查及居民膳食暴露評估[J]. 衛(wèi)生研究, 2015(6): 9-12.

[15] 陶雁斌, 楊紹貴. 環(huán)境中MG的研究進展[J]. 四川環(huán)境, 2015(5): 6-8.

[16] 鄧婕, 鮑洪波, 吉洪明, 等. 漁業(yè)領域中MG檢測的研究進展[J]. 理化檢驗(化學分冊), 2012(12)：11-13.

[17] 陶雁斌,楊紹貴. 環(huán)境中MG的研究進展[J]. 四川環(huán)境, 2015(5): 6-7.

Research on determination method of malachite green in aquatic products

ZUO Shunyu, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 350003, China)

Establish a UPLC-ESI-MS/MS method for rapid determination of malachite green (MG) and its metabolite leucomalachite green (LMG) in aquatic fingerlings with quantification. UPLC and MS/MS analytical conditions were examined and optimized by a series of experiments. The compound was oxidated by buffered salt system and acid Al2O3, and extracted by acetonitrile and dichloromethane; the concentrated liquid was purified on a neutral Al2O3solid phase extraction cartridge. All eluates were collected and evaporated to dryness. The residue was re-dissolved in 5 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol (1 ∶1,V/V), sonficated and filtered prior to UPLC analysis by isotope-labeled internal standard method. Malachite green and leucomalachite green showed good linearity over the range of 0.5 to 20.0 ng/mL with correlation coefficient of 0.999 9,the detection limit was 0.5 ng/mL,the average recoveries ranged from 83.4% to 101% and from 86.1% to 101%, with relative standard deviations from 3.44% to 7.76% and from 2.28% to 8.74%. In addition, the method showed advantages of simplicity, accuracy, sensitivity and coverage. Compared to the existing national standard，it has made some improvements in pretreatment, reduced organic reagents, shortened the step and stabled recovery experiment, and could be applied to simultaneous determination of malachite green and metabolite leucomalachite green in aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):35-40]

aquatic products; malachite green; leucomalachite green; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

ZHANG Tianwen, zhangtw1986@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.006

2016-07-27；接收日期：2016-10-25

福建省社會發(fā)展引導性項目(2016Y0004)

左舜宇(1987-)，男，本科，助理工程師，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全，342006355@qq.com 通信作者：張?zhí)炻?，工程師，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全，zhangtw1986@163.com

S945

A

2095-1833(2017)01-0035-06