左卡尼汀對心力衰竭大鼠PPAR—α及三磷酸腺苷的影響

王玲++++++張美丹++++++李若林++++++劉杰++++++侯善榮

[摘要] 目的 研究左卡尼?。↙C）對心力衰竭大鼠過氧化物酶體增殖劑激活受體-α（PPAR-α）及三磷酸腺苷（ATP）的影響。 方法 將SD雄性成年大鼠60只隨機(jī)分為4組：正常對照組、心力衰竭模型組、LC低濃度組、LC高濃度組，每組15只。心力衰竭模型組和LC低、高濃度組給予異丙腎上腺素[3 mg/（kg·d）]連續(xù)腹腔注射5 d建造慢性心力衰竭模型。LC低、高濃度組在首次注射異丙腎上腺素的同時(shí)給予LC腹腔注射[80、160 mg/（kg·d）]。6周后行心臟彩超檢查，取組織行病理切片檢查，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測大鼠血清腦鈉肽（BNP）水平，化學(xué)比色法檢測大鼠心肌ATP水平，免疫印跡法（Western blot）檢測PPAR-α蛋白表達(dá)。 結(jié)果 心臟彩超示LC低、高濃度組心功能較心力衰竭模型組明顯改善，且LC高濃度組較LC低濃度組改善明顯（P < 0.05）。與心力衰竭模型組比較，LC低、高濃度組血清BNP水平顯著降低（P < 0.05），心肌ATP水平及PPAR-α蛋白表達(dá)明顯升高（P < 0.05），且LC高濃度組較LC低濃度組的差異更為顯著（P < 0.05）。 結(jié)論 LC可能通過影響PPAR-α表達(dá)來改善心力衰竭心臟結(jié)構(gòu)改變，改善大鼠心肌細(xì)胞能量代謝，延緩心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，其效應(yīng)呈劑量相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 慢性心力衰竭；左卡尼??；過氧化物酶體增殖劑激活受體-α；能量代謝

[中圖分類號] R541.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of L-carnitine on PPAR-α and ATP of heart failure （HF） rats. Methods A total of 60 senior male SD rats were randomized to divided into four groups with 15 animals in each group， including normal control group， HF model group， low-dose L-carnitine group， and high-dose L-carnitine group. HF model group， low-dose L-carnitine group and high-dose L-carnitine group were induced by intraperitoneal injection of Isoproterenol [3 mg/（kg·d）] for 5 days. Low and high-dose groups would be given Isoproterenol and intraperitoneal injection of L-carnitine[80， 160 mg/（kg·d）] simultaneously in the first time. Echocardiography was performed in all experimented SD rats to observe the pathological changes in the myocardium， besides， all rats were taken tissue pathological slices after 6 weeks. The serum BNP level was detected with ELISA and the ATP concentration in myocardial was detected with Chemocolorimetry， and PPAR-α protein expression was measured with Western blot. Results Compared with HF model group， the results of echocardiograph showed that heart function of SD rats in low and high-dose L-carnitine groups were improved significantly， and high-dose L-carnitine group was improved significantly than low-dose L-carnitine group （P < 0.05）. Compared with HF model group， serum BNP levels were lower significantly in low and high-dose L-carnitine groups （P < 0.05）， ATP concentration and expression of PPAR-α protein of myocardium were higher significantly in low and high-dose L-carnitine groups （P < 0.05）， the difference in high-dose L-carnitine group was more significant than that in low-dose L-carnitine group （P < 0.05）. Conclusion L-carnitine may improve the result of myocardial remodeling and cellular energy metabolism to delay the process of the development of the rats with HF by affecting the expression of PPAR-α， the effect is dose-related.

[Key words] Chronic heart failure； L-carnitine； PPAR-α； Energy metabolism

心力衰竭目前是各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死因，慢性心力衰竭發(fā)生時(shí)，會出現(xiàn)心肌脂肪酸的利用障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量生成減少，進(jìn)而惡化心功能。改善心肌能量代謝能夠顯著降低心力衰竭患者的全因死亡率及心力衰竭住院率。左卡尼汀（L-carnitine，LC）是改善能量代謝的藥物，它通過運(yùn)載游離脂肪酸進(jìn)入線粒體，輔助細(xì)胞的能量代謝[1-2]，同時(shí)可以減少線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng)及氧化磷酸化，加快線粒體的利用率[3-4]。本研究通過建立大鼠慢性心力衰竭模型，觀察不同濃度LC對心肌組織三磷酸腺苷（ATP）及過氧化物酶體增殖劑激活受體-α（PPAR-α）水平的影響，探討其改變心力衰竭心臟結(jié)構(gòu)、提高能量代謝、改善心功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性成年SD大鼠60只，4周齡，體重280～300 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，合格證號：SCXK（魯）20140007。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組：正常對照組、心力衰竭模型組、LC高濃度組、LC低濃度組，每組15只。

1.1.2 主要藥品與試劑 LC粉針（晉城海斯制藥有限公司，批號：H20141372）；異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：100166-201004）；大鼠BNP ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；大鼠ATP測定試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；兔抗鼠PPAR-α抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 采用腹腔注射異丙腎上腺素法[3 mg/（kg·d），5 d]建造慢性心力衰竭模型，LC低、高濃度組在首次注射異丙腎上腺素的同時(shí)分別給予LC腹腔注射[80、160 mg/（kg·d）]。正常對照組和心力衰竭模型組給予同等體積的生理鹽水腹腔注射，連續(xù)6周。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：造模6周后，①隨機(jī)選取兩只大鼠取心肌組織，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察心肌組織變性壞死，符合慢性心力衰竭的心肌病理學(xué)改變；②心臟彩超檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）及左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示造模成功。

1.2.2 心臟彩色多普勒檢測 各組動(dòng)物末次給藥后禁食禁水24 h，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定，胸部備皮，二維切面心超引導(dǎo)下，分別測量LVEF、LVESD及LVEDD，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.3 標(biāo)本留取 心臟彩色多普勒檢測結(jié)束后，打開胸腔，于心尖波動(dòng)最明顯處穿刺采血2 mL，靜置2 h，待血液凝固后，3000 r/min離心20 min，取上層血清分別保存于-20℃低溫冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清腦鈉肽（BNP）水平。取出心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗，取左室前壁組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中，留待做HE染色，余組織存放于-80℃冰箱中凍存，用化學(xué)比色法檢測心肌組織ATP及免疫印跡法（Western blot）檢測PPAR-α蛋白。

1.2.4 病理學(xué)觀察 取待測左室前壁組織，4%多聚甲醛溶液中固定12 h，脫水，經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.2.5 ELISA 檢測大鼠血清BNP，-20℃取出保存好的血清，按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.6 化學(xué)比色法 檢測大鼠心肌組織ATP水平，取部分剩余心肌組織稱重后，加生理鹽水，煮沸10 min后冷卻，再以4000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計(jì)測定。

1.2.7 Western blot 檢測PPAR-α蛋白的表達(dá)，4組細(xì)胞處理后，孵育48 h，-80℃冰箱取出各組大鼠心肌組織，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，用PPAR-α多克隆抗體（1∶400）4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗辣根過氧化酶（HRP）-IgG（1∶1000），室溫孵育2 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片顯影，IPP7.0分析條帶吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中，心力衰竭模型組大鼠死亡5只，正常對照組大鼠死亡1只，LC低濃度組大鼠治療期間死亡4只，LC高濃度組死亡2只。與正常對照組相比，心力衰竭模型組和LC低、高濃度組大鼠均出現(xiàn)體重減輕、呼吸淺快、精神欠佳、進(jìn)食及活動(dòng)減少等癥狀。

2.2 心臟彩色多普勒結(jié)果

與正常對照組比較，心力衰竭模型組、LC低濃度組、LC高濃度組LVESD和LVEDD均明顯增大（P < 0.05），LVEF明顯降低（P < 0.05）。與心力衰竭模型組比較，LC低、高濃度組LVESD和LVEDD均顯著減?。≒ < 0.05），LVEF顯著升高（P < 0.05），且LC高濃度組較LC低濃度組差異更明顯（P < 0.05）。見表1。

2.3 心肌組織病理學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對照組心肌細(xì)胞紋理清晰，形態(tài)正常；心力衰竭模型組可見心肌細(xì)胞紋理不清，排列紊亂，心肌纖維斷裂，間質(zhì)纖維化；LC低濃度組以條索狀小灶性壞死與健存心肌交錯(cuò)為主，無片狀壞死；LC高濃度組可見輕微纖維化和變性等改變。見圖1。

2.4 血清BNP與心肌組織ATP水平

與正常對照組比較，心力衰竭模型組及LC低、高濃度組的血清BNP水平明顯增高，ATP水平明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與心力衰竭模型組比較，LC低、高濃度組血清BNP水平降低，ATP水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且LC高濃度組較LC低濃度組差異更明顯（P < 0.05）。見表2。

2.5 心肌組織PPAR-α蛋白表達(dá)

與正常對照組[（0.790±0.030）mmol/gprot）]比較，心力衰竭模型組PPAR-α表達(dá)[（0.450±0.025）mmol/gprot]明顯降低（P < 0.01）。與心力衰竭模型組比較，LC低、高濃度組PPAR-α表達(dá)[（0.630±0.040）、（0.670±0.022）mmol/gprot]升高（P < 0.05），且LC高濃度組較LC低濃度組升高更為明顯（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，近幾年對心力衰竭病因及其發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展[5-7]，但死亡率仍很高。因此，對提高慢性心力衰竭患者的生存率依舊是我們需要深入研究的重要課題。BNP是診斷心力衰竭最為準(zhǔn)確、最為敏感的指標(biāo)，而且它能反映心力衰竭的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)的心力衰竭組大鼠BNP水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示心力衰竭模型組大鼠心功能較正常對照組大鼠明顯下降，表示成功制備了大鼠心力衰竭模型。

已有研究表明細(xì)胞凋亡是心力衰竭的核心問題[8-9]，而其中的能量代謝越來越受到更大的關(guān)注[10-11]。所以，改善心力衰竭患者的心肌能量代謝問題未來可能會成為治療心力衰竭的新靶點(diǎn)。正常心肌細(xì)胞是由脂肪酸（FA）和葡萄糖氧化代謝供能，分別占心肌能量需求的60%～80%和20%～35%[12]。由于FA是心肌細(xì)胞能量代謝的主要來源，因此FA氧化途徑較其他氧化途徑對心臟功能的影響就顯得更為重要。心力衰竭時(shí)FA代謝減少，心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生和利用均會出現(xiàn)障礙，使心肌收縮和舒張能力發(fā)生障礙，進(jìn)而加劇心功能惡化[13]。

心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞線粒體中PPAR-α的表達(dá)是下降的[14-15]，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測PPAR-α蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示心力衰竭組大鼠較正常對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也驗(yàn)證了上述研究。PPAR-α能促進(jìn)心肌細(xì)胞對FA的攝取、活化和代謝[16]，以增加心肌FA利用率[17-18]，從而提高心肌細(xì)胞能量代謝，改善心功能。在臨床工作中，國內(nèi)外已有文獻(xiàn)充分證明了應(yīng)用LC能提高心臟病患者的心功能，對多種原因?qū)е碌男墓δ懿蝗加兄委熥饔?。例如Xu在2010年發(fā)現(xiàn)LC能顯著提高由肺動(dòng)脈高壓所致右心功能不全患者的運(yùn)動(dòng)耐力、心臟收縮功能；同年，Serati等在對僅有舒張功能不全患者的研究中發(fā)現(xiàn)每天應(yīng)用1500 mg的LC，連續(xù)3個(gè)月后，心臟彩超發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心臟舒張功能顯著提高，左心房明顯縮小，由心力衰竭導(dǎo)致的呼吸困難癥狀也較對照組明顯減輕[19-21]。本研究通過給予LC調(diào)節(jié)能量代謝，研究其對心力衰竭大鼠PPAR-α水平及ATP的影響，來探討LC是否能通過影響PPAR-α水平來改善心力衰竭心肌細(xì)胞能量代謝，從而改善心力衰竭大鼠的心功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LC可顯著降低大鼠血漿中BNP水平并提高ATP及PPAR-α水平，心臟彩超顯示LC低、高濃度組心功能降低較心力衰竭模型組明顯改善，表明LC能通過改善心肌能量代謝來明顯改善心力衰竭大鼠的心功能。

綜上所述，LC能改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝，延緩心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與調(diào)控PPAR-α水平有關(guān)。但就目前的研究而言，LC通過激活PPAR-α進(jìn)而改善心肌細(xì)胞能量代謝的具體作用機(jī)制還不清楚，需要在今后作進(jìn)一步的探索和研究。

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