多年冬種紫云英對兩種典型雙季稻田土壤肥力及硝化特征的影響

王艷秋，高嵩涓，曹衛(wèi)東，李景環(huán)，聶軍，徐昌旭，白金順，曾鬧華，周國朋，3

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實驗室，北京100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；4.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長沙 410125；5.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所，江西 南昌330200；6.青海大學(xué)青海省農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所，青海 西寧 810016)

多年冬種紫云英對兩種典型雙季稻田土壤肥力及硝化特征的影響

王艷秋1**，高嵩涓2,3**，曹衛(wèi)東2,6*，李景環(huán)1*，聶軍4，徐昌旭5，白金順2，曾鬧華2，周國朋2，3

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實驗室，北京100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；4.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長沙 410125；5.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所，江西 南昌330200；6.青海大學(xué)青海省農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所，青海 西寧 810016)

以湖南紫潮泥和江西黃泥田兩種典型稻田下的綠肥定位試驗為依托，分析了晚稻收獲后兩種土壤的養(yǎng)分性狀、硝化強(qiáng)度、硝化勢及氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的amoA基因豐度，探討多年冬種紫云英對兩類稻田土壤肥力、硝化作用及氨氧化微生物的影響。兩地試驗處理一致，包括：1)不施肥不種紫云英(CK)；2)冬種紫云英不施化肥(GM)；3)不種紫云英單施化肥(CF)；4)冬種紫云英配施化肥(GM+CF)。結(jié)果表明,冬種紫云英可以改善兩種典型稻田土壤pH，即提高江西酸性土壤pH、降低湖南堿性土壤pH；提高土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、無機(jī)氮和有效磷含量。兩種典型水稻土的硝化能力不同，江西黃泥田的硝化強(qiáng)度及硝化勢均明顯低于湖南紫潮泥。在湖南紫潮泥中，各處理硝化強(qiáng)度在0.269～0.325 μg/(g·h)之間，處理間差異不顯著；硝化勢在培養(yǎng)第5周達(dá)到10.25%，紫云英配施化肥在一定程度上抑制了紫潮泥的硝化作用。江西黃泥田中，各處理硝化強(qiáng)度在0.010～0.021 μg/(g·h)之間，硝化勢從培養(yǎng)第3周開始上升，在培養(yǎng)第5周達(dá)到5.41%；單獨(dú)種植翻壓紫云英相對于不施肥對照提高了土壤硝化強(qiáng)度及硝化勢，與施用化肥處理效果相當(dāng)，綠肥配施化肥對硝化作用的促進(jìn)最強(qiáng)。AOA在紫潮泥和黃泥田中均占優(yōu)勢地位，紫潮泥中AOA-amoA基因豐度顯著高于黃泥田，冬種紫云英對紫潮泥中AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度均無明顯影響，而顯著提高了黃泥田中AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度，與冬種紫云英對硝化強(qiáng)度和硝化勢的影響一致。

紫云英；硝化強(qiáng)度；硝化勢；氨氧化微生物；紫潮泥；黃泥田

氮循環(huán)是稻田生態(tài)系統(tǒng)中重要的地球化學(xué)循環(huán)，包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4個過程[1]。硝化過程分為兩部分，首先由亞硝化細(xì)菌把銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，其次是由硝化細(xì)菌把亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮[2]。硝化作用能夠消耗土壤和外源肥料中的銨態(tài)氮，減少氨揮發(fā)損失，其生成的硝態(tài)氮遷移性較強(qiáng)，容易發(fā)生淋洗損失[3]。同時，硝化作用是農(nóng)田N2O排放的重要來源[4]。因此，研究土壤硝化作用具有農(nóng)學(xué)和環(huán)境雙重意義。硝化作用的研究熱點(diǎn)是了解不同施肥處理土壤的硝化活性及硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[5]。在研究中，對硝化能力有不同的表示方法，較常用的有兩種，即，硝化勢和硝化強(qiáng)度[6]。土壤硝化勢的測定為好氣培養(yǎng)法，提供最適的溫度、水分和充足的銨態(tài)氮，通過培養(yǎng)來估計硝化作用的潛力，在 3～5周的好氣培養(yǎng)過程中，硝化作用逐漸增強(qiáng)，直到某種因素限制硝化作用的進(jìn)行而趨于平緩[7]。土壤硝化強(qiáng)度的測定采用懸液法，因其耗時短，操作簡單，而被國內(nèi)外學(xué)者廣為采用[8]。氨氧化作用是硝化作用中的第一步和限速步驟[9]，氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)是參與氨氧化作用的兩種重要微生物[10]，氨單加氧酶基因amoA同時存在于AOA和AOB中，可作為AOA和AOB中的特異性分子標(biāo)記[9]。在硝化作用的研究中，基于amoA基因的分子生物學(xué)方法是從微生物角度探討硝化作用機(jī)制的重要方法，已被廣泛應(yīng)用。

我國南方稻區(qū)由于種植制度的特點(diǎn)，有大量冬閑田存在。冬閑田種植綠肥能夠充分利用稻區(qū)冬閑耕地及水熱資源，是常用的培肥措施。紫云英(Astragalussinicus)屬于豆科黃芪屬，固氮能力強(qiáng)，能為稻田提供氮素來源。稻田種植和利用紫云英是我國南方綠肥生產(chǎn)的典型模式，已有大量研究和廣泛的生產(chǎn)實踐[11]。在南方雙季稻田中翻壓紫云英可以替代部分化肥，增加水稻產(chǎn)量，減少生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)分利用效率[12]，提高土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量[13]；種植翻壓紫云英還能提高土壤磷酸酶活性，為土壤微生物創(chuàng)造良好的土壤條件，進(jìn)而促進(jìn)微生物生長[14]。

近年來，研究者多集中于秸稈或稻草還田對土壤硝化作用的影響，綠肥翻壓還田與硝化作用及硝化微生物之間的關(guān)系卻鮮有報道。湖南紫潮泥和江西黃泥田是南方雙季稻區(qū)的兩種典型水稻土，在上述地區(qū)開展了紫云英-雙季稻定位試驗，以監(jiān)測綠肥在雙季稻系統(tǒng)中的綜合效應(yīng)。本研究的目的，一是探討綠肥的引入對稻田土壤硝化作用及硝化微生物的影響；二是兩類土壤性質(zhì)差異較大，探討硝化作用對綠肥的響應(yīng)在兩類土壤上的異同。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

于2008年分別在湖南的紫潮泥和江西的黃泥田雙季稻地區(qū)開展了冬種紫云英定位試驗。湖南試驗位于益陽市南縣三仙湖鄉(xiāng)萬元橋村，東經(jīng)112°28′、北緯29°13′，海拔30 m，年均氣溫16.6 ℃，年平均降水量1238 mm，全年日照時數(shù)1776 h，土壤類型為河流沉積物發(fā)育的紫潮泥。江西試驗位于豐城市張巷鎮(zhèn)范橋村，東經(jīng)115°92′、北緯28°15′，海拔25 m，年均氣溫15.3～17.7 ℃ ，年平均降水量1552 mm，全年日照時數(shù)1936 h，土壤類型為河流沖積物發(fā)育而成的黃泥田。試驗初始時，湖南試驗土壤pH為7.70，有機(jī)質(zhì)、全氮含量分別為48.4 g/kg、3.28 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為261 mg/kg、15.6 mg/kg、98.0 mg/kg。江西試驗土壤pH為5.16，有機(jī)質(zhì)、全氮含量分別為25.0 g/kg、1.80 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為155 mg/kg、6.0 mg/kg、109.0 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

兩地試驗均設(shè)4個處理：1)不施肥不種紫云英(冬閑對照，CK)；2)冬種紫云英不施化肥(GM)；3)不種紫云英單施化肥(CF)；4)冬種紫云英配施化肥(GM+CF)。每處理設(shè)3重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為20 m2，小區(qū)間做田埂并用塑料薄膜包裹。單施化肥和化肥配施紫云英處理中早稻、晚稻化肥施用量相同，分別為N 150 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2，氮、磷、鉀化肥品種分別為尿素、過磷酸鈣和氯化鉀，其中磷、鉀肥均全部做基肥施入；氮肥，湖南按基肥和分蘗肥分次施用，江西按基肥、分蘗肥和穗肥分次施用。紫云英翻壓前測定各小區(qū)鮮草產(chǎn)量，在早稻移栽前10～15 d按22500 kg/hm2用量就地翻壓，并移走多余的紫云英。在水稻整個生育期內(nèi)，各處理田間管理措施完全一致。

1.3 樣品采集與測定

于2015年晚稻收獲后采集土壤樣品。取樣時用不銹鋼土鉆在每個樣點(diǎn)內(nèi)采用五點(diǎn)取樣法取0～20 cm耕層土壤，剔除石礫和植物殘體等雜物，帶回實驗室，一部分4 ℃保存用于活性指標(biāo)測定，其余風(fēng)干過篩，測定土壤肥力指標(biāo)。

土壤肥力指標(biāo)的測定應(yīng)用《中國農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》中的方法[7]。分別為：土壤全氮(TN)為凱氏定氮法、土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)為重鉻酸鉀容量法-外加熱法、有效磷(AP)采用0.5 mol/L NaHCO3浸提、速效鉀(AK)采用1 mol/L CH3COONH4浸提、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮為2 mol/L KCl浸提、pH值采用水土比2.5∶1.0測定。

硝化強(qiáng)度采用懸濁液培養(yǎng)法測定：稱5 g 鮮土，每樣品4重復(fù)，置于50 mL 離心管中，加20 mL 1 mmol/L (NH4)2SO4溶液和0.1 mL 1.5 mol/L NaClO3溶液，搖勻加蓋，將其中3份在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 h，另一份-20 ℃冷凍5 h作為對照。培養(yǎng)完成后加5 mL 2 mol/L KCl，搖勻過濾后測定NO2-濃度[6]。土壤硝化強(qiáng)度為單位時間內(nèi)單位質(zhì)量土壤生成的 NO2--N的量，即：μg NO2--N/(g·h)。

硝化勢采用好氣培養(yǎng)法測定：稱取150 g干土于250 mL培養(yǎng)瓶中，其中一份加入200 mg N/kg的(NH4)2SO4溶液，另一份不添加外源氮作為對照。混勻后添加蒸餾水至田間持水量的60%，透氣保水膜封口，30 ℃黑暗培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)第3、7、14、21、28、35天非破壞性取樣測定NH4+-N和NO3--N的含量[6]。硝化勢為某培養(yǎng)日內(nèi)土壤硝態(tài)氮占礦質(zhì)氮量的百分含量，記為Nt。公式為：Nt=([NO3--N]t/[NH4+-N+NO3--N]t)×100%。

1.4amoA基因豐度測定

1.4.1 DNA提取與標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用土壤專用試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil(MP Bio, Santa Ana, CA, USA)提取土壤DNA，提取所得DNA用微量紫外分光光度計Nanodrop 2000(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)測定濃度。

使用普通PCR儀(Bio-RAD)摸索反應(yīng)條件及制備標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)體系為20 μL，包括2.5 mmol/L脫氧核苷酸(dNTP)1.6 μL，10×EX Taq緩沖液2.0 μL，2.5 mmol/L MgCl21.6 μL，5 μmol/L前后引物各1 μL，0.5 μL 模板DNA，0.2 μL 5u EX Taq和12.1 μL ddH2O。AOA-amoA基因采用引物對Arch-amoAF/Arch-amoAR，引物序列為ATG GTC TGG CTW AGA CG/GCC ATC CAT CTG TAT GTC CA[15]；AOB-amoA基因采用引物對amoA-1F/amoA-2R，引物序列為GGG GTT TCT ACT GGT GGT/CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC[16],反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物電泳檢測后通過割膠回收試劑盒純化目的條帶，對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，TA克隆后提取質(zhì)粒，并使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)測定質(zhì)粒濃度。10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取5個稀釋點(diǎn)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 熒光定量PCR測定 熒光定量PCR所用引物與普通PCR相同，在熒光定量PCR儀(ABI 7500)上完成反應(yīng)，每樣3反應(yīng)，同時包含一個未加DNA模板的反應(yīng)體系(陰性對照)。反應(yīng)體系為25 μL，包括Power SybrGreen qPCR Master Mix (Applied Biosystems, California, USA)12.5 μL，10 μmol/L 前后引物各0.5 μL, 2 μL模板DNA和9.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件與同標(biāo)準(zhǔn)品制備所用條件相同。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)及作圖和SAS 8.1軟件做統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬種綠肥對稻田土壤肥力特征的影響

表1表明，湖南紫潮泥各處理平均pH值為7.62，明顯高于江西黃泥田(各處理平均值4.64)?？梢钥闯?，冬種紫云英對兩種土壤pH的作用不同，種植翻壓綠肥后黃泥田土壤pH提高，紫潮泥土壤pH則降低，但處理間差異不顯著。湖南紫潮泥和江西黃泥田的土壤有機(jī)質(zhì)含量均受施肥措施的影響較大，3個施肥處理土壤有機(jī)質(zhì)都高于不施肥冬閑對照，且差異顯著。兩地的GM處理土壤有機(jī)質(zhì)均顯著高于CK，但綠肥配合施用化肥后，兩地情況不同，紫潮泥的GM+CF處理低于CF處理，黃泥田則反之，但差異均未達(dá)顯著水平。

全氮整體趨勢與有機(jī)質(zhì)類似，與對照比較，冬種紫云英顯著提高了稻田土壤全氮含量，但與化肥處理無顯著差異。兩類土壤的無機(jī)氮特征差異較大，黃泥田銨態(tài)氮含量明顯高于紫潮泥，約是紫潮泥的3.8倍，而黃泥田硝態(tài)氮含量明顯低于紫潮泥。與CK比較，GM處理提高了兩地水稻土的銨態(tài)氮含量，降低了硝態(tài)氮含量；GM處理銨態(tài)氮與CF及GM+CF處理均差異不顯著?？傮w上看，與對照相比，單獨(dú)種植翻壓綠肥能提高銨供給、并減少向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。

施肥處理的紫潮泥土壤有效磷含量明顯低于黃泥田，黃泥田中土壤有效磷受綠肥及化肥處理影響較大。與CK比較，冬種紫云英均較大幅度地提高了兩類稻田土壤有效磷含量，但在紫潮泥中差異不顯著。兩地CF和GM+CF處理有效磷含量均顯著高于CK和GM。紫潮泥速效鉀明顯低于黃泥田，且兩類土壤速效鉀含量對冬種綠肥的響應(yīng)有所不同：紫潮泥中GM處理土壤速效鉀略低于CK，顯著低于施用化肥處理；而在江西黃泥田中GM處理土壤速效鉀含量最高，且顯著高于對照。

表1 不同處理下稻田土壤理化性狀Table 1 Soil properties under different treatments

不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。 Different letter means significant difference between treatments (P<0.05), the same below.

2.2 冬種紫云英對稻田土壤硝化作用的影響

2.2.1 硝化強(qiáng)度 湖南和江西兩類稻田土壤的硝化強(qiáng)度有很大差異，江西水稻土的硝化能力明顯低于湖南(圖1)。湖南紫潮泥中不同處理土壤硝化強(qiáng)度在0.269～0.325μg/(g·h)之間，各處理間差異不顯著，GM處理硝化強(qiáng)度稍高于CK和GM+CF，稍低于CF處理。在江西黃泥田中，各處理硝化強(qiáng)度在0.010～0.021 μg/(g·h)之間，GM處理相對CK提高了土壤硝化強(qiáng)度，同CF處理無差異，而綠肥配施化肥顯著提高了土壤的硝化強(qiáng)度，是CK的2.2倍。

圖1 兩種典型水稻土的硝化強(qiáng)度Fig.1 Nitrification activity of these two typical paddy soils 不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。 Different letters mean significant difference between treatments (P<0.05), the same below.

2.2.2 硝化勢 湖南紫潮泥的硝化勢在培養(yǎng)期間均顯著高于江西黃泥田，兩地表現(xiàn)出不同的規(guī)律(圖2)。湖南水稻土的硝化勢在培養(yǎng)第3天即達(dá)到6.11%，在培養(yǎng)過程中逐漸上升，第35天各處理平均值為10.25%；培養(yǎng)過程中GM處理降低了湖南水稻土硝化勢，綠肥配施化肥對硝化勢的抑制作用最強(qiáng)。江西黃泥田中，在培養(yǎng)前3周硝化勢一直低于2%，第4周開始上升，至培養(yǎng)結(jié)束的第5周上升到各處理平均值5.41%；整個培養(yǎng)期間，GM處理相對CK和CF均提高了土壤硝化勢，綠肥配施化肥對硝化作用的促進(jìn)最顯著。

圖2 兩種典型水稻土的硝化勢Fig.2 Nitrification potential of these two typical paddy soils

2.3 氨氧化細(xì)菌及氨氧化古菌的豐度

兩類土壤中，AOA均占優(yōu)勢地位，各樣品的AOA/AOB比值為1.56～54.77。湖南紫潮泥中AOA-amoA基因豐度在2.16×106～9.01×107拷貝/g干土之間，顯著高于江西黃泥田中的1.54×105～1.31×106拷貝/g干土。兩類土壤中的AOA-amoA基因豐度變化對冬種紫云英的響應(yīng)不同，在紫潮泥中，GM處理AOA-amoA基因豐度相對于CK稍有降低，并顯著低于CF處理；江西黃泥田中GM處理AOA-amoA基因豐度最高，且顯著高于對照。AOB-amoA的基因豐度在兩種土壤中受各處理的影響也明顯不同，在紫潮泥中，GM處理AOB-amoA基因豐度相對于CK及CF均沒有差異，而GM+CF處理則大幅降低了AOB-amoA的基因豐度，且與CF處理差異顯著；江西黃泥田中CK處理的AOB-amoA的基因豐度最低，其他3個處理間無明顯差異但均顯著高于CK(圖3)。

圖3 兩種典型水稻土中氨氧化細(xì)菌及氨氧化古菌amoA基因豐度Fig.3 The amoA gene abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB) of the two typical paddy soils表2 兩種典型水稻土中氨氧化微生物與土壤性狀之間的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients among the abundance of ammonia oxidizers and soil properties

土壤類型Soiltype氨氧化微生物AmmoniaoxidizerspH有機(jī)質(zhì)Organicmatter全氮TotalNNH4+-NNO3--N有效磷AvailableP速效鉀AvailableK紫潮泥PurplealluvialsoilAOA0.3950.3650.4160.1450.617*0.736**0.694*AOB-0.1910.0410.095-0.510-0.348-0.296-0.421黃泥田YellowclayeysoilAOA-0.6080.4790.5600.1200.4290.4500.530AOB-0.6430.661*0.813**0.1190.5280.584*0.314

*為顯著相關(guān)(P<0.05)，**為極顯著相關(guān)(P<0.01)。* significant correlation atP<0.05 level; ** significant correlation atP<0.01 level.

2.4 氨氧化微生物與土壤性狀間關(guān)系

土壤理化性狀和AOA及AOB的amoA基因豐度間的相關(guān)性分析表明，紫潮泥中AOA-amoA基因豐度與土壤NO3--N、有效磷和速效鉀顯著相關(guān)，而AOB-amoA與土壤性狀間均無顯著相關(guān)性。與紫潮泥不同，黃泥田中AOA-amoA與土壤性狀間無顯著相關(guān)性，AOB-amoA與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和土壤有效磷顯著相關(guān)。說明紫潮泥中土壤性狀對AOA豐度的影響較大，而在黃泥田中土壤性狀對AOB豐度的影響較大(表2)。

3 討論和結(jié)論

本研究顯示，冬種紫云英在一定程度上降低了堿性土壤pH，提高了酸性土壤pH，即種植翻壓綠肥有助于改善土壤pH。冬種紫云英提高了酸性土壤的pH，避免長期施用化肥導(dǎo)致的土壤酸化，其原因可能是綠肥翻壓投入了大量有機(jī)物質(zhì)，有機(jī)物中堿性物質(zhì)的輸入抵消了被收獲生物量中堿性物質(zhì)的輸出，從而避免土壤堿性物質(zhì)的過度消耗[17]；有機(jī)物具有調(diào)節(jié)pH的生物緩沖性，在土壤中加入高量有機(jī)物質(zhì)后，土壤對堿溶液的緩沖能力更強(qiáng)，更有利于調(diào)節(jié)土壤pH[18]，在我國南方雙季稻田中，長期冬種綠肥能夠?qū)ν寥牢⑸锶郝洚a(chǎn)生積極功能，通過改變功能微生物群落結(jié)構(gòu)而降低土壤酸化能力[19]。在本研究的湖南堿性土壤中，多年種植翻壓綠肥降低了土壤pH，說明紫云英作綠肥是一種調(diào)節(jié)土壤pH的有效措施。綠肥在生長過程中和翻壓后向土壤輸入了大量有機(jī)物質(zhì)，在微生物的作用下腐解并釋放營養(yǎng)元素，同時促進(jìn)微生物生長和繁殖[20]。稻田土壤中冬種紫云英能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)含量和活性，減少土壤碳素?fù)p失，改善稻田土壤生物學(xué)性狀[21]，本研究中多年冬種綠肥提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量，并且在紫潮泥中的效果更佳，說明在雙季稻種植體系中引入綠肥對保持土壤肥力有重要意義。種植翻壓紫云英能夠減少化肥施用量、促進(jìn)水稻增產(chǎn)，同時提高土壤全氮、堿解氮、有效磷和速效鉀等含量，提升土壤肥力[12,22]。綠肥施入土壤后會促進(jìn)土壤有機(jī)氮的分解，從而提高土壤氮素有效性，增加植株可利用的無機(jī)氮含量[23]。紫云英作為一種豆科綠肥，能夠利用根瘤菌固定大氣氮，故種植翻壓紫云英可提高土壤養(yǎng)分循環(huán)中的氮含量[24]。本研究中，多年冬種綠肥顯著提高了土壤全氮含量，表明紫云英能有效增加稻田土壤氮素，也進(jìn)一步說明了冬種紫云英有利于提高稻田土壤肥力，改良土壤狀況，是一種高效的培肥模式。

土壤硝化作用是由微生物驅(qū)動的反應(yīng)，因此土壤的硝化能力不僅可以反映土壤氨轉(zhuǎn)化能力的強(qiáng)弱，同時也是反映土壤活性硝化菌群落的重要指標(biāo)[25-26]。本研究采用了兩種測定土壤硝化作用的方法分別表征硝化作用的強(qiáng)度和潛力，其中硝化強(qiáng)度因培養(yǎng)時間較短，不足以引起硝化細(xì)菌的大量繁殖，可以通過短期釋放的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量表征硝化作用的強(qiáng)弱[7]。硝化勢測定通過3～5周的長期培養(yǎng)，使硝化菌在適宜的條件下大量繁殖，可以估算土壤發(fā)生硝化作用的潛力。由于在硝化勢培養(yǎng)過程中，氮的礦化作用經(jīng)常是第一步限制因子，因此硝化勢培養(yǎng)實驗?zāi)軌蛲瑫r提供更多關(guān)于礦化的信息[27]。在具體研究中，可以根據(jù)實際情況選擇合適的方法測定硝化能力的強(qiáng)弱。本研究對比了兩種不同的測定方法，發(fā)現(xiàn)在湖南紫潮泥中，硝化強(qiáng)度和硝化勢的結(jié)果不完全一致，但均為冬種綠肥下硝化勢和硝化強(qiáng)度都沒有顯著變化；江西黃泥田中，硝化強(qiáng)度和硝化勢表現(xiàn)一致，均為GM+CF>GM>CF>CK。綜合分析實驗過程和結(jié)果差異，硝化強(qiáng)度是用鮮樣即時測定，測定結(jié)果受取樣時的田間狀況影響較大，變異性較大，但是測試周期短，可以快速得出結(jié)果；硝化勢測定通過長期培養(yǎng)，雖耗時較長，但所得結(jié)果更穩(wěn)定，在沒有條件對鮮樣及時測定時較為適用。

施肥能夠為土壤帶入大量外源物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)微生物的生長，但是不同施肥措施對硝化作用及硝化微生物的影響如何尚沒有統(tǒng)一結(jié)論，在不同的研究條件下有不一致的結(jié)果。有研究表明長期施用有機(jī)肥和化肥均能提高土壤硝化能力及硝化菌群豐度[28]，氮磷鉀肥配施有機(jī)肥能夠顯著提高紫色水稻土的氨氧化潛勢和硝化強(qiáng)度，而含氯氮磷鉀肥配施有機(jī)肥顯著降低土壤硝化能力[29]。王峰等[30]研究表明，施肥處理的土壤中產(chǎn)生了高濃度的氨，會對氨氧化微生物產(chǎn)生毒害作用，從而使硝化作用受到一定程度的抑制。在本研究中，湖南紫潮泥土壤硝化作用對冬種綠肥的響應(yīng)不明顯，冬種綠肥和施用化肥對土壤硝化能力均沒有太大影響，綠肥配施化肥在一定程度上抑制了土壤硝化作用；在江西黃泥田中冬種紫云英能夠促進(jìn)土壤的硝化作用，配施化肥后促進(jìn)作用更加顯著。施用有機(jī)肥和化肥均能促進(jìn)土壤硝化作用，但由于土壤AOA和AOB對有機(jī)肥和化肥有不同的響應(yīng)，因此影響機(jī)制不同[31]，相對于無機(jī)氮肥，有機(jī)氮添加進(jìn)入土壤后要先經(jīng)過氨化作用轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮才能夠被作物利用，因此在土壤中添加有機(jī)物料對硝化作用的影響較復(fù)雜[32]。綠肥氮作為有機(jī)氮源，其對硝化作用的影響機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

在不同的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，AOA和AOB對硝化作用的相對貢獻(xiàn)一直存有爭議，大量研究表明，受復(fù)雜的環(huán)境因子的影響，AOA和AOB的種群數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)有不同的變化[33-36]。Leininger等[10]綜述了在很多類型的土壤中，AOA在數(shù)量上占主導(dǎo)地位，本研究的兩種典型稻田中同樣為AOA豐度高于AOB，與已有研究結(jié)果相一致。紫潮泥中冬種紫云英對AOA和AOB豐度沒有顯著影響，而在黃泥田中，冬種紫云英顯著提高了AOA和AOB的豐度，與硝化強(qiáng)度和硝化勢的規(guī)律相吻合，進(jìn)一步驗證了不同類型土壤中，冬種紫云英對硝化作用的影響不同。不同稻田土壤中，因其理化性狀的差異，對參與硝化作用的微生物有不同的影響，表現(xiàn)為硝化能力的差異[3]。pH是影響硝化作用的一個重要因素[37-39]，pH增加能夠通過促進(jìn)氨氧化細(xì)菌的生長從而促進(jìn)硝化作用[40]。不同區(qū)域中土壤氨氧化微生物的分布主要受pH的影響，并且在酸性土壤中AOA占主導(dǎo)地位[41]，酸性土壤條件下的硝化作用主要是自養(yǎng)硝化作用，由自養(yǎng)硝化細(xì)菌或者真菌參與完成[42]，在我國亞熱帶氣候條件下的酸性土壤硝化作用對pH變化非常敏感，銨態(tài)氮物質(zhì)的酸堿性足以改變土壤的硝化作用強(qiáng)度[43]。本研究所選取的兩種典型水稻土性質(zhì)差異較大，本研究年度(2015年)江西黃泥田各處理的平均pH為4.64，湖南紫潮泥各處理的平均pH為7.62，其硝化作用強(qiáng)度和對不同處理的響應(yīng)有很大差別。在江西黃泥田中，冬種綠肥及施用化肥均可顯著提高土壤的硝化強(qiáng)度，而在湖南紫潮泥中，綠肥與化肥配施在一定程度上抑制了硝化作用，說明了同樣的施肥措施在不同類型水稻土中對硝化作用的影響有較大差異，但是不同土壤類型下硝化作用差異的原因及機(jī)制仍需要深入研究。

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Fertility and nitrification characteristics of two typical paddy soils after application of milk vetch (Astragalussinicus) for 8 years

WANG Yan-Qiu1**, GAO Song-Juan2,3**, CAO Wei-Dong2,6*, LI Jing-Huan1*, NIE Jun4, XU Chang-Xu5, BAI Jin-Shun2, ZENG Nao-Hua2, ZHOU Guo-Peng2，3

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,InnerMongoliaNormalUniversity,Hohhot010022,China; 2.KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer,MinistryofAgriculture,InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 3.TheGraduateSchool,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 4.SoilandFertilizerInstituteofHunanProvince,Changsha410125,China; 5.InstituteofSoil&FertilizerandResource&Environment,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China; 6.SoilandFertilizerInstitute,QinghaiAcademyofAgricultureandForestrySciences,QinghaiUniversity,Xining810016,China

Two green manure experiments in Hunan and Jiangxi provinces were conducted in this study. The soil types at the two experimental sites were purple alluvial soil in Hunan and yellow clayey soil in Jiangxi. Soil properties, nitrification activity, potential nitrification rate, and the abundance of AOA (ammonia-oxidizing archaea) and AOB (ammonia-oxidizing bacteria)amoAgene transcripts were determined to evaluate the effects of application of milk vetch for 8 years on soil fertility, nitrification characteristics, and ammonia oxidizers. The two experiments had the same treatments: 1) no fertilizer and milk vetch (CK); 2) milk vetch but no chemical fertilizer (GM); 3) chemical fertilizer but no milk vetch (CF); 4) chemical fertilizer and milk vetch (GM+CF). The results showed that the application of milk vetch improved the pH of both the paddy soils; i.e., the pH of acidic soil in Jiangxi was increased and that of alkaline soil in Hunan was decreased. Application of milk vetch increased the soil organic matter, total nitrogen, ammonium nitrogen, and available phosphorus. The two paddy soils had different nitrification abilities, both the nitrification activity and potential nitrification rate were much higher in purple alluvial soil than in yellow clayey soil. In purple alluvial soil in Hunan, the nitrification activity ranged from 0.269 to 0.325 μg/(g·h) in all the treatments, and there was no significant difference among the treatments. The potential nitrification rate in purple alluvial soil reached 10.25% at the fifth week of incubation, and the GM+CF treatment inhibited nitrification ability to some extent. In yellow clayey soil in Jiangxi, the nitrification activity ranged from 0.010 to 0.021 μg/(g·h) in all the treatments. The potential nitrification rate in yellow clayey soil increased after the third week of incubation and reached 5.41% by the fifth week. Compared with the control, winter green manuring improved the soil nitrification activity and potential nitrification rate, and had almost the same effects as the CF treatment. The GM+CF treatment had the strongest effect to promote the nitrification ability of yellow clayey soil. Transcripts of AOA were predominant in both purple alluvial soil and yellow clayey soil, and the abundance of AOA-amoAtranscripts was significantly higher in purple alluvial soil than in yellow clayey soil. The application of milk vetch did not significantly affect the abundance of AOA-amoAand AOB-amoAtranscripts in purple alluvial soil, but increased their abundance in yellow clayey soil, similar to the effects of milk vetch to promote nitrification activity and the potential nitrification rate.

milk vetch; nitrification activity; potential nitrification rate; ammonia oxidizers; purple alluvial soil; yellow clayey soil

10.11686/cyxb2016281

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-14；改回日期：2016-09-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“綠肥作物生產(chǎn)與利用技術(shù)集成研究及示范”(201103005)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程，Newton Fund(Grant Ref: BB/N013484/1)資助。

王艷秋(1992-)，女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士。E-mail:18647374412 @163.com；高嵩涓(1988-)，女，河南鄭州人，博士。E-mail: gaosongjuan@caas.cn。

王艷秋, 高嵩涓, 曹衛(wèi)東, 李景環(huán), 聶軍, 徐昌旭, 白金順, 曾鬧華, 周國朋. 多年冬種紫云英對兩種典型雙季稻田土壤肥力及硝化特征的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(2): 180-189.

WANG Yan-Qiu, GAO Song-Juan, CAO Wei-Dong, LI Jing-Huan, NIE Jun, XU Chang-Xu, BAI Jin-Shun, ZENG Nao-Hua, ZHOU Guo-Peng. Fertility and nitrification characteristics of two typical paddy soils after application of milk vetch (Astragalussinicus) for 8 years. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 180-189.

**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail: caoweidong@caas.cn；lijinghuan0816@126.com