紫花苜蓿根腐病原
——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選

柏玉晶，姚玉玲，張振粉，楊成德，薛莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

紫花苜蓿根腐病原
——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選

柏玉晶，姚玉玲，張振粉，楊成德*，薛莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

采用常規(guī)組織分離法，對(duì)甘肅省武威市紫花苜蓿根腐病菌進(jìn)行分離和致病性測(cè)定，并通過形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定方法對(duì)致病性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，MXGF7可造成紫花苜蓿嚴(yán)重根腐，該病原菌大型分生孢子多紡錘形或鐮刀形，大小為3.3～4.7 μm×14.8～32.0 μm；小型分生孢子少，紡錘形或啞鈴形，大小2.9～4.2 μm×8.4～18.2 μm；ITS序列及鐮孢菌Fu3/Fu4區(qū)基因序列分析表明，病原菌均與Fusariumchlamydosporum的相似度達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將該病原菌鑒定為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。采用平板對(duì)峙法，從分離自東祁連山高寒草地牧草的123株內(nèi)生細(xì)菌中篩選出61株菌株對(duì)F.chlamydosporum有拮抗效果，且抑菌率均在55%，并利用形態(tài)特征和16S rDNA基因序列分析將具有穩(wěn)定拮抗作用265ZY3菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

苜蓿根腐??；厚垣鐮孢菌；內(nèi)生細(xì)菌；鑒定

紫花苜蓿(Medicagosativa)為優(yōu)良的多年生豆科牧草，利用年限長(zhǎng)，產(chǎn)草量高，營(yíng)養(yǎng)好，再生性強(qiáng)，是畜牧業(yè)首選青飼料，有“牧草之王”的稱號(hào)，在世界各國廣泛種植[1]。但是，隨著利用年限的增長(zhǎng)，苜蓿根腐病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為苜蓿栽培中的重要限制因素之一，其在美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯、日本和阿根廷等國家[2-4]及國內(nèi)新疆、甘肅、青海和內(nèi)蒙古等地均嚴(yán)重發(fā)生[5-8]。該病害為害苜蓿全生育期，使其固氮能力降低，植株衰弱，單產(chǎn)和品質(zhì)下降；據(jù)估計(jì)每年全世界造成的產(chǎn)量損失在20%左右，嚴(yán)重發(fā)生的地塊達(dá)到40%[9]。苜蓿根腐病的病原研究報(bào)道較多，但均主要認(rèn)為由鐮孢菌屬真菌引起，如李敏權(quán)等[10]報(bào)道甘肅省中部干旱地區(qū)主要病原為尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)和半裸鐮孢(F.semitectum)；王多成等[11]報(bào)道，甘肅省張掖市引起苜蓿根腐病的病原是茄鐮孢(F.solani)、串珠鐮孢(F.moniliforme)和尖孢鐮孢；潘龍其等[12]報(bào)道內(nèi)蒙古赤峰市主要病原為擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichioide)。鐮孢屬厚垣鐮孢(F.chlamydosporum)可引起多種植物病害，如其可造成木耳的“白毛菌”病，導(dǎo)致木耳耳片霉?fàn)€[13]，還可以引起大豆根腐病[14]、阿爾及利亞地中海油松幼苗腐爛病[15]及番石榴的枯萎病[16]等，但該病原菌引起苜蓿根腐病的報(bào)道未見。本試驗(yàn)從甘肅省武威市苜蓿根腐病標(biāo)本中分離獲得一株致病鐮孢菌，其形態(tài)與厚垣鐮孢相似。因此，本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)特征和分子方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其拮抗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了篩選和鑒定，以期為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原的分離與純化

供試苜蓿根腐病樣于2013年采自甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)組織分離法分離病原菌，在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1000 mL)上進(jìn)行培養(yǎng)與純化，待純化的菌株產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離，進(jìn)一步純化后移入PDA斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆肹17]。

1.2 致病性測(cè)定

離體試驗(yàn)：采用致傷接種法。將苜蓿播種于直徑12 cm的塑料花盆中，在溫度為20～30 ℃的室內(nèi)培育植株至40 d苗齡時(shí)，選取健康的苜蓿，將分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后打成直徑6 mm的菌餅接于傷口處，以無菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，保濕48 h，25 ℃培養(yǎng)，3次重復(fù)，連續(xù)觀察根部發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算發(fā)病率。發(fā)病率(%)=總發(fā)病株數(shù)/總調(diào)查數(shù)×100。

浸根接種法：將苜蓿播種于直徑12 cm的塑料花盆中，在溫度為20～30 ℃的室內(nèi)培育植株至40 d苗齡時(shí)，將根部稍加損傷，用濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液浸根15 min，用無菌水浸根做對(duì)照，后移至花盆繼續(xù)生長(zhǎng)，3次重復(fù)，連續(xù)觀察根部發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算發(fā)病率。

形成典型癥狀后對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行再分離，按柯赫氏法則[17]確定致病菌。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接于PSA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)待產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗及產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征；在40倍鏡下分別測(cè)定大、小分生孢子、厚垣孢子大小(50個(gè))，并在顯微鏡下拍照。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[18]和《鐮刀菌屬》[19]等參考資料進(jìn)行鑒定。

1.3.2 分子鑒定 DNA提?。簩⒕杲佑赑DA培養(yǎng)基于25 ℃下培養(yǎng)5～10 d后,刮取菌絲0.2 g于1.5 mL離心管中；加入混合均勻的螯合樹脂150 μL，用電動(dòng)組織研磨器充分研磨至菌絲成糊狀、螯合樹脂內(nèi)的固體顆粒消失；再加入螯合樹脂150 μL；沸水浴15～20 min；4 ℃,12000 r/min離心10 min，取上清液。經(jīng)電泳檢測(cè)將具有特異性條帶的DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]。

利用ITS1(5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3′)、ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)及鐮孢菌特異性引物Fu3(5′-CCG AGT TTA CAA CTC CCA AA-3′)、Fu4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。兩種引物均由華大生物工程有限公司合成。其擴(kuò)增體系均為：2×MasterMix 25 μL,引物各3 μL，DNA模板2 μL(以加2 μL雙蒸水為空白對(duì)照)，最后用雙蒸水定容到50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，具特異性條帶的產(chǎn)物送華大生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，明確其種類。

1.4 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及鑒定

1.4.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[17]。以東祁連山高寒草地牧草的根、莖、葉部分離的126株內(nèi)生細(xì)菌為供試拮抗菌(由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供)，將病原真菌置于PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d后打成直徑 6 mm的菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，內(nèi)生拮抗菌經(jīng)24 h活化培養(yǎng)后點(diǎn)接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點(diǎn)，以點(diǎn)接無菌水為對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，3次重復(fù)，待對(duì)照病原真菌長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后測(cè)量處理菌落直徑(cm)，以抑菌率表示內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力。抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.4.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將優(yōu)良拮抗菌株于NA平板劃單菌落，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察并描述單菌落形態(tài)特征；在NA平板上培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色，并測(cè)量菌體大小(30個(gè))和顯微照相[17]。

1.4.3 16S rDNA序列分析 用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司，Ezup柱式基因組細(xì)菌DNA抽提試劑盒)提取病原菌的基因組DNA。采用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]擴(kuò)增拮抗菌株的16S rDNA。其擴(kuò)增體系為：10×buffer 5 μL，MgCl2(25 mol/L)3 μL，dNTP(5 mmol/L)1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，引物1(10 μmol/L)1 μL，引物2(10 μmol/L)1 μL，模板DNA 1 μL(以加1 μL雙蒸水為空白對(duì)照)，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)32次；72 ℃下延伸8 min。 PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，具特異性條帶產(chǎn)物送華大生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，明確其種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

發(fā)病初期苜蓿根及根頸部產(chǎn)生褐色壞死斑，根部橫切發(fā)現(xiàn)維管束呈棕色，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，最后呈現(xiàn)嚴(yán)重腐爛變?yōu)樯詈稚昂谏?，維管束腐爛呈中空；地上植株生長(zhǎng)緩慢，葉片變黃枯萎,最后植株死亡(圖1)。

2.2 病原菌的分離及其致病性測(cè)定

從多個(gè)發(fā)病根部進(jìn)行常規(guī)分離法、單孢純化，得到8個(gè)真菌分離物(圖2)，其培養(yǎng)性狀、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)各不相同，并將8個(gè)分離物依次編號(hào)為MXGF1、MXGF2、MXGF3、MXGF4、MXGF5、MXGF6、MXGF7和MXGF8。對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)離體接種8株菌株的苜蓿根部全部發(fā)病；浸根接種后MXGF2’、MXGF4’、MXGF6、MXGF7、MXGF8發(fā)病率100%，MXGF2發(fā)病率75%，MXGF4、MXGF5發(fā)病率50%。

離體致病性試驗(yàn)表明，接種部位深褐色、腐爛，表面產(chǎn)生白色霉層，剖開發(fā)病部位，根部維管束向內(nèi)變?yōu)楹稚?圖3B)，與田間癥狀一致，對(duì)照無癥狀(圖3A)。將苗齡為40 d的苜蓿根用濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液浸根15 min后移至花盆繼續(xù)培養(yǎng)，30 d后，葉片由外向內(nèi)逐漸枯黃，后地上部分開始萎蔫；根部致傷部位先出現(xiàn)水漬狀壞死斑，后病斑擴(kuò)大顏色變?yōu)楹稚?、深褐?圖2)，發(fā)病嚴(yán)重的腐爛部位變?yōu)楹谏野枷葑兛?圖2H)；根頸及根頸部分節(jié)處呈褐色、紅褐色至黑色腐爛病斑(圖3D)，對(duì)照無癥狀(圖2A、圖3C)。

2種方法從發(fā)病部位再分離均可得到與原接種真菌相同的分離物，根據(jù)柯赫氏法則，確定8株菌株均為苜蓿根腐病的致病菌。其中根據(jù)發(fā)病程度發(fā)現(xiàn)，MXGF7菌株的病斑明顯大，且發(fā)病嚴(yán)重于其他菌株(圖2H)，所以對(duì)MXGF7做了后續(xù)研究。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 25 ℃培養(yǎng)5 d后，菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。菌落圓形，絨毛狀，初生菌絲奶白色，后略帶黃色，氣生菌絲發(fā)達(dá)(圖4A)，培養(yǎng)基背面由內(nèi)向外呈黃棕色至淡黃色(圖4B)。7 d左右開始產(chǎn)生分生孢子。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗,大小2.3～7.0 μm×6.8～17.5 μm(圖4C)。

圖1 苜蓿根及根頸腐爛病癥狀Fig.1 Symptoms of alfalfa rot on crown and root

小型分生孢子少，紡錘形或啞鈴形，0～1隔，大小8.4～18.2 μm×2.9～4.2 μm。大型分生孢子多紡錘形或鐮刀形，兩端鈍、基部具足跟(圖4D)或細(xì)長(zhǎng)、兩端逐漸變尖、基部具腳泡(圖4E)，多3～5隔，3隔孢子大小14.8～29.6 μm×3.3～4.5 μm，5隔孢子大小24.53～32.0 μm×3.8～4.7 μm。厚垣孢子圓形，間生或串生，直徑 7.2～29.3 μm(圖4F)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，根據(jù)形態(tài)特癥初步鑒定該菌株為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。

圖2 浸根接種苜蓿根部發(fā)病情況Fig.2 The smptoms on alfalfa root by dipping root inoculation A:對(duì)照Contrast; B:MXGF2; C:MXDF2’; D:MXGF4; E:MXGF4’; F:MXGF5; G:MXGF6; H:MXGF7; I:MXGF8.

圖3 MXGF7致病性測(cè)定Fig.3 Pathogenicity test of the pathogen of MXGF7 A：根部橫切對(duì)照；B：根部橫切發(fā)病癥狀；C：根頸部對(duì)照；D：根頸部發(fā)病癥狀。A: The crosscutting control of root; B: The crosscutting symptoms of root; C: The control of root crown; D: The symptoms of root crown.

2.3.2 分子鑒定 利用引物ITS1、ITS4和Fu3、Fu4分別對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以DNA Marker-DL2000為對(duì)照，具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送往華大生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源序列比較，下載相似性高的序列，并用Mega(5.0)軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，ITS基因擴(kuò)增序列為528 bp，與F.chlamydosporum(KT211539.1)相似度達(dá)99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖5)；引物Fu3/Fu4擴(kuò)增序列509 bp，在GenBank中經(jīng)同源序列比較發(fā)現(xiàn)其與F.chlamydosporum(HQ654898.1)的同源性在99%以上，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上與其聚在一起(圖6)，即二者親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)特征，將該病原菌鑒定為厚垣鐮孢菌F.chlamydosporum。

2.4 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

圖4 病原菌形態(tài)特征Fig.4 Morphological characters of the pathogens A：菌落正面；B：菌落背面；C：產(chǎn)孢細(xì)胞；D～E：大型分生孢子；F：厚垣孢子。A:Upper surface of the colony; B: Reserved surface of the colony; C: Conidiogenous cell; D-E: Macroconidia of the pathogen; F:Chlamydospore.

圖5 基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogrnetic tree based on ITS gene sequence

2.4.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選 經(jīng)平板對(duì)峙培養(yǎng)表明，分離自高寒草地123株細(xì)菌中有61株對(duì)厚垣鐮孢菌有拮抗效果，且抑菌率均在55%以上，其中菌株263AG5′抑菌能力最強(qiáng)，抑菌率達(dá)69.93%，其次為菌株263ZY1、263XY1、261AY3，其抑菌率分別為69.35%、69.26%和69.23%(表1)。

圖6 基于鐮孢菌專用引物Fu3/Fu4擴(kuò)增序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogrnetic tree based on the Fu3/Fu4 specificity sequence of pathogenic fungus表1 部分內(nèi)生細(xì)菌對(duì)厚垣鐮孢菌的抑菌能力測(cè)定(抑菌率65%以上)Table 1 Inhibition rate of endophytic bacteria on Fusarium chlamydosporum(more than 65% antibacteria ratio)

拮抗菌株Antagonisticstrains處理菌落直徑Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)拮抗菌株Antagonisticstrains處理菌落直徑Treatingcolonydiameter(cm)抑菌率Antifungalratio(%)CK18.17a0.00d262AY83.03bcd66.00ab263ZY23.22b64.57bc265ZG32.95cd67.11ab263ZY43.10c66.09bcCK57.65a0.00b263ZY12.85e69.35a261AG32.82bc67.60ab261ZG142.92d68.48ab261AG92.87bc66.90ab263ZG53.17bc65.22cASZ42.78bc68.07ab264ZY103.10c66.09bc針2Zhen22.95b65.73ab263ZG93.10c66.09bc263AG5'2.65e69.93aCK27.62a0.00a261AY72.93b65.97ab262XY6'2.87bc66.75b261AY3'2.77bc68.30ab262XY12.88b66.51b261MY62.83bc67.37ab265ZY62.80c67.68b262AG62.82bc67.60abCK37.98a0.00c264AY12.87cd66.90ab265XG73.12b65.03b261AY32.70de69.23a263XY12.80c69.26aXSG42.80cd67.83ab262XY2'3.05b65.92b線3Xian32.78bc68.07abCK47.95a0.00c針1Zhen12.80cd67.83ab262AY63.10b65.10abCK67.57a0.00b265XY43.10b65.10ab矮2Ai22.80b67.45a265AG133.03bc66.00b矮3Ai32.82b67.22a265ZY32.92cd67.56a矮4Ai42.88b66.28a265ZY22.97cd66.89ab264ZY72.8267.22a263XY32.90cd67.79a---

注：小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

Note: Lowercase letters is significantly atP<0.05 level.

2.4.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌菌絲及孢子的影響 厚垣鐮孢菌正常菌絲呈淡黃褐色，菌絲均勻光滑，銳角分支，有隔膜，分支和隔膜處均有隘縮(圖7,CK-2)；大型分生孢子鐮刀形，細(xì)胞壁均勻光滑，有明顯隔膜，隔膜處有隘縮。受拮抗細(xì)菌影響的菌絲顏色變深，菌絲或膨大變粗或變細(xì)，粗細(xì)不均勻，隔膜消失或變得不明顯(圖7,263XY1-2)，膈膜間膨大呈球形，菌絲呈念珠狀(圖7,263AG5’-2)，有的菌絲中間出現(xiàn)泡狀物(圖7,261AY3-2)；分生孢子隔膜消失，孢子體中間出現(xiàn)許多泡狀物，有的孢子壁變形不光滑呈波浪狀，有的孢子出現(xiàn)嚴(yán)重不規(guī)則變形。

2.4.3 形態(tài)學(xué)鑒定 經(jīng)抑菌、溶磷、固氮和產(chǎn)吲哚乙酸能力綜合篩選，獲得功能性良好的菌株265ZY3，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。將265ZY3在NA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d，菌落大小為0.5～1.0 cm，不規(guī)則形，邊緣呈波狀，表面褶皺，干燥，中間向上隆起，圓形，奶白色(圖8A)；革蘭氏染色呈陽性，桿狀(圖8B)，菌體大小為0.36～0.77 μm×1.18～3.04 μm。

2.4.4 16S rDNA序列分析 經(jīng)電泳檢測(cè)對(duì)具有特異性條帶的DNA樣品用引物27 f和1492 r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以DNA Marker-DL2000為對(duì)照，在1500 bp附近有一條明顯的擴(kuò)增條帶。測(cè)序后所得rDNA-ITS序列為株265ZY3與GenBank中菌株B.amyloliquefaciens(KF831366.1)的相似性為100%，與其他菌株的相似性均在99%以上，下載相似性較高的序列，并用Mega(5.0)軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(KF831366.1) 聚在一起(圖9)，即與其親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖7 3株拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌菌絲的影響Fig.7 Effect of antagonistic strains to mycelium

1455 bp。經(jīng)在GenBank中進(jìn)行同源序列比較，表明菌

圖8 265ZY3單菌落(A)與革蘭氏染色(B)Fig.8 A single colony (A) and gram staining (B) of 265ZY3

圖9 265ZY3菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 16S rDNA phylogenetic tree of strain 265ZY3

3 討論

3.1 苜蓿根腐病的研究

最早研究苜蓿根和根頸腐病的學(xué)者是 Cormack，他對(duì)加拿大他亞伯達(dá)Abert苜蓿根部寄生真菌進(jìn)行了研究，明確了銳頂鐮孢，燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)在苜蓿中的寄生情況[23]。苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，病原種類較多，先后報(bào)道的該病病原已達(dá)29種，其中鐮孢菌14種，細(xì)菌2種，線蟲1種，其他病原菌12種[24,12]。目前國內(nèi)外已報(bào)道的鐮孢菌有：尖孢鐮孢、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、茄鐮孢、銳頂鐮孢、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、三線鐮孢菌(F.tricinctum)、接骨木鐮孢菌(F.sambucinum)、鏈狀鐮孢菌 (F.fusarioides)、木賊鐮孢菌(F.equisti)、半裸鐮孢、串珠鐮孢、大刀鐮孢菌(F.Culmorum)、梨孢鐮孢菌(F.poae)和擬枝孢鐮孢菌。2001年我國陳雅君等[25]對(duì)黑龍江省紫花苜蓿進(jìn)行了根腐病研究，確定了優(yōu)勢(shì)致病菌為鐮孢菌和絲核菌；李敏權(quán)等[10]和王多成等[11]報(bào)道甘肅省苜蓿根腐病的病原有尖孢鐮孢、銳頂鐮孢、半裸鐮孢、茄鐮孢和串珠鐮孢；王蘭英等[26]對(duì)苜蓿根腐病原菌茄鐮孢、尖孢鐮孢和燕麥鐮孢進(jìn)行了生防放線菌的分離與篩選；丁守彥等[27]做了不同品種苜蓿對(duì)鐮孢菌的抗性鑒定研究。本試驗(yàn)分離鑒定的厚垣鐮孢菌所致苜蓿根腐病是國內(nèi)首次報(bào)道。

3.2 鐮孢菌的鑒定方法

大多數(shù)菌物種類多，形態(tài)特征復(fù)雜，其形態(tài)除了受遺傳物質(zhì)的控制外，還受環(huán)境的影響，其部分形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)會(huì)隨著培養(yǎng)條件的變化而不穩(wěn)定，因此物種鑒定還極大的依賴于研究者的經(jīng)驗(yàn)。本試驗(yàn)觀察到F.chlamydosporum在PDA培養(yǎng)基上和PSA培養(yǎng)基上孢子大小存在明顯差異，PDA上的分生孢子較小。研究資料表明，依據(jù)真菌形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定受多種因素的影響，例如鐮孢菌的產(chǎn)孢條件難以摸索[28]，并且菌物形態(tài)上的相似性和許多有性態(tài)的未知性，通過培養(yǎng)性狀及表型鑒定很難將其在種級(jí)水平上分類，所以菌物的準(zhǔn)確鑒定還必須結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。長(zhǎng)期以來所采用的rDNA-ITS鑒定在真菌分類和發(fā)育系統(tǒng)中廣泛應(yīng)用，王曉英等[29]又結(jié)合鐮孢菌rDNA 18S、5.8S、28S及其區(qū)間ITS1和ITS2序列設(shè)計(jì)了鐮孢菌專用引物Fu3/Fu4，其區(qū)間序列表達(dá)和調(diào)控十分保守，可以較好的表現(xiàn)鐮孢菌在種一級(jí)的關(guān)系，近幾年在鐮孢菌的鑒定上得到了廣泛的應(yīng)用。劉文波等[30]利用ITS區(qū)的不同引物對(duì)香蕉枯萎病菌的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，也進(jìn)一步證明了引物的特異性。所以，為了提高物種鑒定的準(zhǔn)確性，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大分子鑒定方法在菌物鑒定中的研究和應(yīng)用，并綜合各方面的資料和研究者的經(jīng)驗(yàn)，以克服單一方法的局限性。

3.3 苜蓿根腐病的生物防治

苜蓿根腐病為土傳性病害，在苜蓿生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期只要條件適宜，土壤中的病原均可以侵染寄主，致防治困難。近年來植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌的拮抗作用成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，對(duì)其做了廣泛的研究并取得了良好的效果。內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物體內(nèi)[31]，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和腸桿菌屬(Eterobacter)內(nèi)生細(xì)菌最為常見[32]。內(nèi)生細(xì)菌可以通過誘發(fā)植物自身的抗病潛能而增強(qiáng)植物的抗病性，其自身還可以合成多種物質(zhì)來促進(jìn)植物生長(zhǎng)，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物來抑制植物病原菌生長(zhǎng)，且其存在于宿主體內(nèi)，可以長(zhǎng)期發(fā)揮作用，相對(duì)于其他生防因子有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可能會(huì)對(duì)防治困難的土傳根腐病有更好的防治作用。Bacon等[33]分離的玉米內(nèi)生枯草芽孢桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢有相同的生態(tài)位，枯草芽孢桿菌能在玉米體內(nèi)迅速定殖，可有效降低串珠鐮孢毒素的積累。郭榮君等[34]利用營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)平板篩選法，篩選到2株可完全抑制尖孢鐮孢和茄鐮孢菌絲生長(zhǎng)的枯草芽孢桿菌，對(duì)真葉期大豆根腐病有很好的防治效果。本試驗(yàn)從高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌中篩選了該病原菌的拮抗細(xì)菌并進(jìn)行了鑒定，以期為其生物防治提供菌種資源，但該研究?jī)H在室內(nèi)進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，還需對(duì)其抑菌機(jī)制、拮抗細(xì)菌的定殖動(dòng)態(tài)及其防效等進(jìn)一步研究，為研制對(duì)苜蓿根腐病具有良好防治效果的生物菌肥制劑奠定基礎(chǔ)。

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Identification of alfalfa root rot caused byFusariumchlamydosporumand screening of antagonistic bacterial strains

BAI Yu-Jing, YAO Yu-Ling, ZHANG Zhen-Fen, YANG Cheng-De*, XUE Li

CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

To identify the causal pathogens of alfalfa root rot with strong pathogenicity, pathogens were isolated from alfalfa (Medicagosativa) plants with alfalfa root rot growing in Wuwei City, Gansu Province. The pathogens were identified based on their morphology and by molecular methods. The results showed that the strain MXGF7 caused acute root rot of alfalfa. Most of its macroconidia were fusiform or sickle-shaped (3.3-4.7 μm×14.8-32.0 μm), and its microconidia were fusiform or dumbbell-shaped (2.9-4.2 μm×8.4-18.2 μm). The ITS sequence and the Fu3/Fu4 specificity gene sequence of the pathogenic fungus shared 99% similarity with those ofFusariumchlamydosporum, and so the pathogenic fungus was identified asF.chlamydosporum. We isolated 123 endophytic bacterial strains from alpine grassland in the Eastern Qilian Mountains, and evaluated their ability to antagonize the pathogenic strain ofF.chlamydosporum. Sixty-one of the bacterial strains showed an antifungal ratio greater than 55%. The most antagonistic bacterium, strain 265ZY3, was identified asBacillusamyloliquefaciensbased in its morphology and 16S rDNA gene sequence.

alfalfa root rot;Fusariumchlamydosporum; endophytic bacteria; identification

10.11686/cyxb2016111

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-14；改回日期：2016-04-19

國家自然科學(xué)基金(No.31460639),草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))開放課題項(xiàng)目(CYzs-2011011),甘肅省農(nóng)牧廳科技支撐項(xiàng)目和甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA130)資助。

柏玉晶(1989-), 女, 甘肅白銀人, 碩士。E-mail: 1345491709@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

柏玉晶, 姚玉玲, 張振粉, 楊成德, 薛莉. 紫花苜蓿根腐病原——厚垣鐮刀菌的鑒定及其拮抗菌的篩選. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(2): 78-87.

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