口蹄疫病毒抗原表位和抗原位點的研究進展

吳磊，王建科，黨江平，焦良奎

（三門峽市動物疫病預防控制中心，河南三門峽472000）

口蹄疫病毒抗原表位和抗原位點的研究進展

吳磊，王建科，黨江平，焦良奎

（三門峽市動物疫病預防控制中心，河南三門峽472000）

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病。侵染對象是豬、牛、羊等主要畜種及其他家養(yǎng)和野生偶蹄動物。FMDV歸類為小RNA病毒科（picornaviridae），口蹄疫病毒屬（aphthovirus）。FMDV基因組為單股正鏈RNA，基因組的中部是一大的開放閱讀框（open reading fragment,ORF），編碼一多聚蛋白；多聚蛋白的裂解過程是由三種蛋白酶：Lpro、2A和3C來完成的,多聚蛋白經(jīng)3級裂解后，形成3～4種病毒結構蛋白（VP0或VP4、VP2，VP3，VP1）和8～9種非結構蛋白（Lab,Lb,2A,2B, 2C,3A,3B,3C和3D）。

免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個蛋白質抗原分子，而僅識別抗原肽分子上的一個特定部分即表位（Epitope），又稱為抗原決定簇（Antigenic determinant）。因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負責與抗體分子或免疫細胞表面的抗原受體結合，嚴格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的。

口蹄疫的四種結構蛋白構成了病毒的抗原位點，其抗原位點是指FMDV顆粒表面由幾個表位或抗原決定簇組成的一個區(qū)域，其中一個表位的改變可影響該區(qū)域內相鄰表位與相應單克隆抗體的反應?？乖稽c（antigen site）是決定抗原性在空間上相互獨立不重疊的蛋白結構小區(qū)或結構域，一個抗原位點上往往包含了多個相互關聯(lián)的抗原表位?？乖稽c分析是口蹄疫病毒研究領域中的一個熱點。

根據(jù)與抗原受體細胞結合不同，抗原表位分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位，B細胞表位可以是構象表位也可以是線性表位，位于抗原分子表面，沒有MHC（主要組織相容性復合體）限制性，不需要APC（抗原遞呈細胞）處理，但是B細胞對TD抗原的識別需要巨噬細胞和Th細胞參加；T細胞表位是線性表位，無構象依賴性，蛋白質分子變性處理不會影響T細胞表位，位于抗原分子任意部位，并且有MHC限制性，需要APC處理。

1 口蹄疫病毒結構蛋白的抗原表位和位點的研究進展

對于口蹄疫病毒抗原表位的研究已有很多年歷史，主要是針對口蹄疫病毒結構蛋白抗原表位的研究，其中對衣殼蛋白VP1的研究居多，VP1是主要的免疫原性抗原，包括該病毒的抗原表位。已經(jīng)證實VP1在實驗和自然宿主中都能誘導中和抗體的產(chǎn)生，RGD（arginine-glycine-aspartic acid）基序是口蹄疫病毒的VP1蛋白上高度保守的氨基酸序列，1989年，F(xiàn)ox利用合成肽技術指出145-147位的氨基酸序列RGD和來自VP1的203-213位殘基的C-末端的氨基酸是FMDV對BHK細胞的細胞吸附位點。1990年，Baxt等也利用合成肽技術研究發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒VP1的RGD基序在病毒與細胞受體位點的相互作用中起重要作用。在VP1的頂尖處高度保守的RGD三肽可以和整聯(lián)蛋白結合，并有助于口蹄疫病毒內陷進靶細胞。VP1的G-H環(huán)是已經(jīng)確定的特異細胞受體的配體，并且有助于中和抗體的誘導，對C型FMDV（C-S8c1菌株）進行研究，VP1的免疫顯性的G-H環(huán)，是細胞吸附的假定位點，主要的非連續(xù)性抗原表位（D表位）包括衣殼上互相鄰近的VP1，VP2和VP3的殘基，該表位位于病毒粒子立體構型的三重軸附近。2007年，Storey的研究表明，與βG-βH環(huán)RGD基序不同，口蹄疫SATI型病毒田間分離株Namibia（NAM/307/ 98）的VP1上的第二個RGD序列不能發(fā)揮BHK-21細胞中受體結合的配位子的作用。

口蹄疫病毒含有高度保守RGD的VP1已被鑒定是引起中和抗體產(chǎn)生的主要B細胞表位。1979年，Bachrach等用CNBr處理口蹄疫Al2株病毒VP1蛋白得到一個13kD大小的片段（55-179位氨基酸），用胰蛋白酶處理得到一個大小為16 kD的片段（1-144位氨基酸），實驗證實二者均具有免疫原性，能誘導免疫保護?？谔阋卟《続12亞型的VP1上有三個主要的抗原表位和一個次要表位，另外，還有一個表位在VP1和VP3上。1982年，Strohmaier等用不同種類的肽鏈內斷酶和化學試劑CNBr切割口蹄疫O1K病毒株純化的VP1蛋白，經(jīng)過實驗檢測，從而確定了其上具有免疫原性的氨基酸片段在138-154位和200-213位。Krebs和Baxt等進一步研究發(fā)現(xiàn)，口蹄疫O型病毒的VP1變異主要發(fā)生在140-160位和200-211位兩段抗原表位區(qū)，這兩個肽段是決定免疫原性的抗原決定簇，隨后逐步發(fā)現(xiàn)了結構蛋白VP2、VP3上的線性表位。

VP1的41-209位氨基酸是T細胞表位。2001年，F(xiàn)reiberg研究發(fā)現(xiàn)口蹄疫AsiaⅠ型病毒的VP1的1-20氨基酸組成的肽有抗原性但是不能誘導中和抗體的產(chǎn)生。Zamorano指出口蹄疫O1型病毒Campos的VP1序列（135-160位氨基酸殘基）不僅含有G-H環(huán)和B細胞表位，也包含免疫顯性T細胞表位，Wong HT證明VP1的141-160位氨基酸殘基含有至少一種T細胞表位。為了區(qū)分病毒全蛋白序列上的口蹄疫病毒特異性T細胞表位，利用覆蓋病毒全序列的442段十五肽進行淋巴細胞實驗，實驗證明，位于結構蛋白VP1的66-80位氨基酸殘基的肽段有淋巴細胞增殖反應和IFN-γ產(chǎn)生，是一個牛的A31血清型MHC特異性T細胞表位。

VP1攜帶誘導對口蹄疫病毒免疫反應的主要的抗原位點，其中兩個主要的B細胞抗原位點（141-160位氨基酸殘基和200-213位氨基酸殘基）誘導中和抗體的產(chǎn)生，另外VP1上有一個T細胞抗原位點包括21-40位氨基酸殘基。早在1982年，Bittlel和Pfaffca等利用免疫原性多肽首次確定了位于口蹄疫病毒結構蛋白VP1第140-160位氨基酸之間的G—H環(huán)內含有一個免疫原性位點，稱之為siteA，是口蹄疫病毒最主要的抗原位點。

結構蛋白VP4可以與MHC分子結合，VP4的20-35位存在T細胞表位。VP4的N-末端有一個T細胞位點。最近Gerner的研究表明，位于口蹄疫病毒VP4蛋白的表位可以被由DQA等位基因22021和DQB等位基因1301編碼的MHCⅡDQ分子遞呈，并且提出了這個特殊DQ分子的結合基序的首要證據(jù)。利用15肽和接種的雜種豬的外周血單細胞（PBMC）分析了口蹄疫病毒衣殼蛋白的病毒多肽VP4的T細胞表位。VP4的16-35殘基之間的免疫顯性區(qū)域被鑒定，其中20-34位殘基（VP4-0）和21-35位殘基（VP4-5）尤其對來自所有接種豬的PBMC呈現(xiàn)免疫刺激性。VP4的20-35位殘基區(qū)域是廣泛宿主的，免疫顯性的和異型T細胞抗原位點，該位點能為串聯(lián)排列的B細胞表位提供幫助。雜交動物中，MHC多態(tài)性影響合成肽的反應,VP4的20-34位殘基，至少被四個不同的MHC單倍體相關聯(lián)的識別，而且所有引起體外淋巴細胞增殖反應的肽段可以誘導TH1型反應，與涉及的MHC單倍體無關?？谔阋卟《窘Y構蛋白VP2,VP3和VP4上至少有10個未知的T細胞表位，特別是VP4的17-36氨基酸，VP2的113-132氨基酸和179-198氨基酸，VP3的129-148氨基酸在細胞轉移實驗中有效行使了Th細胞的功能。VP2的49-68位氨基酸，VP3的81-100位氨基酸和VP4的20-40位氨基酸包含的序列與T細胞表位的定位是一致的，VP2的54-72位氨基酸殘基是被FMDVO1K株識別的T細胞位點。蘭州獸醫(yī)研究所的周建華等運用同源模建得到口蹄疫OA/ 58株病毒VP2蛋白的三維空間結構，并找出該蛋白的B細胞抗原表位，表明該蛋白存在多個潛在的抗原表位，可能的蛋白質抗原表位區(qū)域是：1-23，40-63，71-78，82-91，102-106，113-119，131-138，148-154，166-177，189-196，212-218。

另外，在抗原位點的研究中單克隆抗體技術起了很重要的作用。1987年，謝慶閣等篩選了30多株單抗突變株確定了口蹄疫O型病毒至少有5個中和抗原位點。根據(jù)單抗和變種的結合以及中和方式，Butchaiah G等利用7個針對AsiaⅠ型的單抗篩選口蹄疫病毒的中和抑制突變株，確定了口蹄疫AsiaⅠ型病毒存在4個抗原位點；Mateu等實驗證實口蹄疫C型病毒主要有4個抗原位點；Thomas等實驗表明口蹄疫A10亞型病毒有2個主要位點和2個次要位點,兩個主要抗原位點中一個包含VP1的140-160序列，是胰酶敏感的，另一個主要位點是包括VP3上的部分殘基,非胰酶敏感性的；兩個次要位點分別位于接近VP1的169位和VP1的C末端；Baxt等實驗表明，A12亞型有1個主要位點和1個次要位點,位點1是一個免疫優(yōu)勢抗原位點，由VP1的三個表位和VP3上的第四個表位構成。位點2包含一個單一的表位，僅位于VP1上；Saiz等針對口蹄疫A5亞型病毒Spain-86株的五株中和單克隆抗體獲得一系列的中和抑制的突變株，體外和體內實驗證明變異株利用選擇性單克隆抗體完全可以抗拒中和作用。在交互中和實驗和結合實驗的基礎上，兩個中和性抗原位點被定位于病毒表面：一個位于VP1的C末端附近，顯示為一個線性表位，第二個位于VP2，顯示為兩個構象表位。親本和變異株的衣殼蛋白編碼區(qū)P1的RNA核苷酸測序表明VP1的198位有第一個位點的氨基酸變化，VP2的72位和79位在第二個位點有相關表位的變化。口蹄疫C型（分離的C-S8c1）病毒的三維結構被以3.5 ?分辨率結晶學判定，病毒粒子的主要椅式構象跟口蹄疫O 1型病毒的構象很像。VP1的免疫顯性的G-H環(huán)，通過基因和肽圖譜的方法抗原位點被鑒定位于衣殼上。一個非連續(xù)性的抗原位點（D位點）位于三重軸附近，并包含衣殼上互相鄰近的VP1，VP2和VP3的殘基。

2 口蹄疫病毒非結構蛋白抗原表位的研究進展

口蹄疫病毒非結構蛋白大多與病毒的復制和裝配有關，T細胞表位的鑒定和特點對于理解細胞免疫介導的保護是很重要的，很多口蹄疫病毒非結構蛋白上的T細胞表位已經(jīng)被鑒定。不同非結構蛋白中，多肽3A，3B和3C在體外實驗中給出最高的刺激性。一部分這些抗原肽的序列在不同的口蹄疫病毒血清型中是高度保守的。他們誘導主要組織相容性復合物的產(chǎn)生?？谔阋卟《?A蛋白與致病力和宿主范圍有關。3A的T細胞表位有誘導Th細胞活性的能力，并可以允許B細胞引起的抗口蹄疫病毒抗體的協(xié)同誘導，3A的21-35位存在T細胞表位。P3Dpol是口蹄疫病毒主要的交叉反應的免疫決定簇，引起異型T細胞反應。

上海交通大學的孫濤等采用基因分段克隆、表達結合蛋白質印跡篩選到了口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC上高結合力、保守的感染相關線性表位，分別位于3ABC蛋白上第106-155位和156-190位氨基酸，但仍不能確定起關鍵作用的氨基酸。這兩個表位可與感染口蹄疫不同血清型病毒動物的康復血清反應，但不與來自健康免疫動物和未接觸病毒動物的血清發(fā)生反應。實驗表明，用基因工程表達的多肽篩選抗原表位的方法是可行的。利用篩選噬菌體隨機肽庫（phage display random peptide library）方法，華中農(nóng)業(yè)大學的何玉龍等從噬菌體隨機十二肽庫中篩選能與FMDV-NSP 3ABC抗體特異性結合的抗原模擬表位，得到提示，含有LSXPS或LAFPX或LXFSP及LSFPS（X代表V、N、Y等氨基酸）的短肽可能在豬O型FMDV-NSP 3ABC抗原表位中起作用，第2位的S、第3位的F、第5位的S中的任意兩個氨基酸殘基與第1位的L位和第4位的P可能構成模擬表位的骨架結構。

口蹄疫病毒非結構蛋白3D抗體的檢測作為口蹄疫病毒感染的間接指示，已經(jīng)被用于血清流行病學的補充方法。為了發(fā)展一個檢測口蹄疫病毒抗體的敏感的cELISA方法，口蹄疫病毒-3D蛋白的免疫顯性表位通過肽矩陣分析被鑒定。牛3D的16-30位氨基酸是抗體結合表位。此種方法在新的診斷方法的發(fā)展中提供了特異性抗體產(chǎn)生的有用工具。

以獲得口蹄疫病毒3D蛋白T細胞識別的信息為目的，García-Briones利用實驗中感染了口蹄疫病毒的雜種豬的淋巴細胞和90個跨越整個3D序列的重疊肽進行了體外增殖實驗。2～3個肽的庫的應用允許可以被來自5個被分析動物中的至少4個的淋巴細胞高效識別的T細胞表位的識別。這個識別是異型的，因為抗肽段的反應加強了攜帶來自不同血清型的一株口蹄疫病毒分離株的動物的再感染。根據(jù)單株肽段得到的結果證明了根據(jù)抗原庫觀察到的抗原性。通過3D肽段體外刺激產(chǎn)生的淋巴細胞進行RT-PCR的細胞因子mRNAs的缺失揭示了IFN-γ mRNAs是最持續(xù)被誘導的。這也說明激活的T細胞屬于Th1亞群。這些結果表明，3D蛋白包括能被來自不同感染動物的豬T淋巴細胞高效識別的表位，都依靠初次和二次（異型的）的口蹄疫病毒感染。

為了區(qū)別口蹄疫病毒非結構蛋白3D上的特殊的T細胞表位，Gerner利用實驗中感染了口蹄疫病毒的兩株近親系小型豬（c/c和d/d單倍型）的淋巴細胞對十五肽進行了增殖實驗和IFN-γELISPOT實驗。c/c豬的淋巴細胞從3D的三個不同區(qū)域識別該多肽，d/d豬的淋巴細胞從兩個區(qū)域識別，其中一個靠近c/c豬的表位，由346-370位氨基酸殘基組成。d/d淋巴細胞對代表結構蛋白VP4的肽的反應顯示了另一個新的T細胞表位，反應的淋巴細胞表型的研究顯示CD4（+）CD8（+）MHCⅡ細胞，經(jīng)鑒定為活化的T-helper細胞。這是首次報道用近親系豬白細胞抗原（SLA）識別口蹄疫病毒特殊的T細胞表位。

目前對于口蹄疫病毒結構蛋白和非結構蛋白抗原表位和抗原位點的研究，不僅擴展了該病毒表位的表位譜系和更加清楚了解口蹄疫病毒抗原的結構，而且對于新型疫苗的研究，如亞單位疫苗，合成肽疫苗等的發(fā)展都有十分重要的意義?！?/p>