激活TGR5通過CaN/NFAT3途徑減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大*

馮 健， 吳 丹， 陳旭昕， 鐘 毅， 劉應(yīng)才， 李家富

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000； 2中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100048)

激活TGR5通過CaN/NFAT3途徑減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大*

馮 健1△， 吳 丹1▲， 陳旭昕2， 鐘 毅1， 劉應(yīng)才1， 李家富1

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100048)

目的： 觀察激活G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(GPBAR1,又稱TGR5)對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大的影響，并探討鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)/活化T細(xì)胞核因子3(NFAT3)信號途徑在其中的作用。方法: 原代培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞，采用圖像分析系統(tǒng)測定細(xì)胞表面積，BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，通過RT-PCR及Western blot方法檢測TGR5、CaN及NFAT3的mRNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果: 成功培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞。高糖明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積及細(xì)胞蛋白含量的增加(P<0.05)，同時CaN及NFAT3的表達(dá)也增加(P<0.05)。激活TGR5或給予CaN抑制劑環(huán)孢素A均能抑制高糖引起的心肌細(xì)胞肥大及NFAT3表達(dá)增加(P<0.05)。給予TGR5干擾慢病毒可阻斷TGR5對心肌細(xì)胞肥大的上述改善作用(P<0.05)。結(jié)論: 激活TGR5能減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其機制可能與抑制CaN/NFAT3信號通路有關(guān)。

G蛋白偶聯(lián)受體； TGR5； 心肌細(xì)胞肥大； 高糖； 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶； 活化T細(xì)胞核因子3

長期的糖尿病可導(dǎo)致糖尿病性心肌病，出現(xiàn)心肌肥厚及心肌纖維化，最終出現(xiàn)心力衰竭及惡性心律失常，導(dǎo)致患者死亡[1]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)是一種鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白磷酸酶，心肌細(xì)胞內(nèi)CaN被活化后，引起其底物活化T細(xì)胞核因子3(nuclear factor of activated T-cells 3，NFAT3)去磷酸化入核，增加促心肌肥厚基因的表達(dá)，導(dǎo)致心肌肥厚。近來研究表明CaN/NFAT3信號途徑在高糖導(dǎo)致的心肌肥厚中也發(fā)揮著重要的作用[2]。

G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G-protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1; 又稱Takeda G-protein-coupled receptor 5， TGR5)是最近發(fā)現(xiàn)的膽汁酸膜蛋白偶聯(lián)受體，其在血脂異常、肥胖、糖尿病等代謝性疾病方面起著重要的調(diào)控作用，可能是多種代謝性疾病治療的重要藥物靶點[3-4]。但其在糖尿病性心肌病方面的作用尚不是很清楚。因此，本實驗以小鼠心肌細(xì)胞為研究對象，給予高糖刺激，建立糖尿病心肌病離體細(xì)胞模型，探討TGR5對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響及其與CaN/NFAT3信號途徑之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

出生0～3 d的乳小鼠，雌雄不限，SPF級，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2013-17，使用許可證號為SYXK(川)2013-181。

2 主要試劑

抗TGR5抗體及抗CaN抗體(Santa Cruz)；抗NFAT3抗體(CST)；RT-PCR試劑盒及引物合成(TaKaRa)；環(huán)孢素A(cyclosporin A, CsA)和INT-777(Med Chem Express)；澳洲胎牛血清(Bovogen)；多聚賴氨酸和DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和葡萄糖(Sigma)；Ⅱ型膠原酶(Gibco)；α-actinin(武漢博士德生物工程有限公司)；胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

3 方法

3.1 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分組 小鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)參照我們之前的實驗方法進(jìn)行[5]。細(xì)胞鑒定后，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，換無BrdU的完全培養(yǎng)基，以后每隔48 h換液1次。將原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞分為5組：正常組：給予5 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞；高糖組：給予33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞48 h；高糖+INT-777組：同時加入高糖33 mmol/L及TGR5特異性激動劑INT-777(30 μmol/L)，培養(yǎng)48 h；高糖+CsA組：先給予CaN抑制劑CsA(5 μmol/L)預(yù)處理1 h，再加入高糖培養(yǎng)48 h；高糖+INT-777+TGR5 shRNA組：先給予TGR5干擾慢病毒感染細(xì)胞后，再加入高糖及INT-777培養(yǎng)48 h。

3.2 心肌細(xì)胞表面積和總蛋白的測定 每組心肌細(xì)胞隨機選取6個視野，每個視野選取10個細(xì)胞進(jìn)行表面積測量。利用圖像分析軟件描記和測量單個細(xì)胞的表面積。去除培養(yǎng)液，用PBS液清洗3遍，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清，采用BCA法測量各組細(xì)胞的總蛋白含量。

3.3TGR5干擾慢病毒感染細(xì)胞TGR5 shRNA由上海漢恒生物科技有限公司設(shè)計并合成，以慢病毒包裝。細(xì)胞濃度約每孔2×107個，分別接種于6孔板內(nèi)，正常培養(yǎng)3 d，當(dāng)貼璧細(xì)胞達(dá)到90%，取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，6孔板中每孔即加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，并往培養(yǎng)基里加入終濃度為5 mg/L的polybrene，取TGR5 shRNA慢病毒原液100 μL加入培養(yǎng)孔混勻，繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱中感染4 h，4 h培養(yǎng)完成后取出，直接往含病毒的培養(yǎng)基中再加入1 mL新鮮培養(yǎng)基(含終濃度為5 mg/L的polybrene)，感染后第2天，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液(不含polybrene)，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，感染72 h后，根據(jù)分組給予不同刺激因素，進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測細(xì)胞基因表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后，提取各組總RNA，按照每10 cm2加入1 mL Buffer RLT裂解液，充分裂解心肌細(xì)胞，按1 mL TRIzol reagent裂解液加入200 μL氯仿抽提，70%的乙醇等體積混勻，經(jīng)去蛋白液、漂洗液提純回收總RNA，采用紫外分光光度計(A260/A280)及2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度和純度的檢測，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。?00 ng的總RNA加入5× RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶和ddH2O共10 μL逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1 μL的DNA加入對應(yīng)的上下游特異性引物(序列見表1)、2×Taq PCR Master Mix及ddH2O，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，取10 μL的擴增產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以目的基因與GAPDH的比值表示。

表1 RT-PCR引物序列

F: forward; R: reverse.

3.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 參照我們此前的實驗方法進(jìn)行[6]。細(xì)胞干預(yù)24 h后提取各組心肌細(xì)胞總蛋白或核蛋白，測定樣品濃度，灌膠并上樣后，電泳槽電泳，轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)的 I 抗及 II 抗，顯影并用凝膠掃描成像，進(jìn)行圖像分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGR5在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)情況

TGR5干擾慢病毒感染心肌細(xì)胞后，提取細(xì)胞mRNA和蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，TGR5干擾慢病毒組TGR5的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of TGR5 in the mouse cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖1 小鼠心肌細(xì)胞TGR5的mRNA和蛋白表達(dá)

2 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞表面積和總蛋白的影響

各組細(xì)胞給予刺激因素干預(yù)后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小，BCA法測總蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞表面積明顯增大，總蛋白含量明顯增加(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細(xì)胞表面積減小，總蛋白含量明顯減少(P<0.05)。與高糖+INT-777組比較，給予TGR5干擾慢病毒后，心肌細(xì)胞表面積增大，總蛋白含量增加(P<0.05)，見表2。

表2 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積和總蛋白的影響

Table 2.The effects of TGR5 activation on high glucose (HG)-induced changes of the surface area and protein content in the cardiomyocytes (Mean±SD.n=3)

GroupSurfacearea(μm2)Proteincontent(μg/dish)Control380．87±103．1323．45±0．86HG1188．52±59．17?30．48±0．73?HG+INT?777572．89±55．56#23．51±0．57#HG+CsA625．88±104．45#24．11±0．25#HG+INT?777+TGR5shRNA1129．75±66．23&30．24±0．63&

*P<0.05vscontrol; #P<0.05vsHG;&P<0.05vsHG+INT-777.

3 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞CaN的mRNA及蛋白表達(dá)的影響

各組細(xì)胞給予刺激因素干預(yù)后，提取各組細(xì)胞mRNA或蛋白，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞CaN的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細(xì)胞CaN的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。與高糖+INT-777組比較，給予TGR5干擾慢病毒后，CaN mRNA和蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖2。

4 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞NFAT3核蛋白表達(dá)的影響

各組細(xì)胞給予刺激因素干預(yù)后，提取各組細(xì)胞核蛋白(實驗均重復(fù)3次)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組心肌細(xì)胞NFAT3核蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組和高糖+CsA組心肌細(xì)胞NFAT3核蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。與高糖+INT-777組比較，給予TGR5干擾慢病毒后，NFAT3核蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The effects of TGR5 activation on the mRNA (A) and protein (B) expression of CaN in the mouse cardiomyocytes induced by HG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group;&P<0.05vsHG+INT-777 group.

圖2 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞CaN mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of TGR5 activation on the protein expression of NFAT3 in the mouse cardiomyocytes induced by HG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group;&P<0.05vsHG+INT-777 group.

圖3 激活TGR5對高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞NFAT3核蛋白表達(dá)的影響

討 論

糖尿病性心肌病是糖尿病的常見并發(fā)癥，心肌肥厚是其主要特征之一。心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞表面積的增大及細(xì)胞蛋白含量的增加[7]。多種病理性刺激因素均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、蛋白質(zhì)合成及促肥厚基因的表達(dá)增加，包括高糖[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)給予心肌細(xì)胞以33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h能導(dǎo)致細(xì)胞的肥大[10]。因此，本研究采用33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)乳小鼠心肌細(xì)胞48 h，從而建立糖尿病心肌病離體細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)上述處理后，心肌細(xì)胞表面積及細(xì)胞總蛋白明顯增加，表明在此條件下高糖能成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

TGR5是近來發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白偶聯(lián)的膽汁酸受體，具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用。大量的基礎(chǔ)研究表明TGR5激活能調(diào)節(jié)脂肪代謝，減輕體重；改善胰島素抵抗；改善血管炎癥反應(yīng)、損傷狀態(tài)；延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展等[11-13]。因此，我們推測激活TGR5可能在高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予TGR5特異性激動劑INT-777，能明顯減輕高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞表面積及蛋白含量的增加；給予TGR5干擾慢病毒，消除了INT-777的上述改善作用，說明激活TGR5能改善高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

CaN/NFAT信號途徑在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)著重要的地位，激活CaN/NFAT信號途徑是導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大發(fā)生的重要分子機制之一。近來研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)基能導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積的增加，同時伴有CaN及NFAT3 mRNA和蛋白表達(dá)的增加，且這種變化隨著糖濃度的增加而增加，提示高糖可能是通過激活CaN/NFAT3信號途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)高糖能導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大及CaN、NFAT3表達(dá)的增加，這與此前的報道研究一致。因此，抑制CaN/NFAT3信號途徑將有利于改善心肌細(xì)胞肥大。在本研究中，我們繼續(xù)探討了激活TGR5抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用是否與CaN/NFAT3有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，INT-777明顯抑制了高糖導(dǎo)致的CaN mRNA和蛋白表達(dá)的增加，而給予TGR5慢病毒后，消除了上述抑制作用，證明了TGR5與CaN之間的關(guān)系。CaN激活能導(dǎo)致胞漿內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子NFAT3去磷酸化后入核，再與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。因此隨后的研究發(fā)現(xiàn)，INT-777也抑制了高糖導(dǎo)致的NFAT3核蛋白表達(dá)，其抑制效果與CsA(CaN抑制劑)相似。同時給予TGR5慢病毒感染后，INT-777的抑制作用明顯消除了。

綜上所述，本研究表明激活TGR5能抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其機制可能與抑制CaN/NFAT3信號通路有關(guān)。上述研究為TGR5激動劑在糖尿病心肌病中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

[1] 黃 波， 吳 陽， 薛 萊， 等. PPARβ及NO在高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(2):261-266.

[2] Asadi F, Razmi A, Dehpour AR, et al. Tropisetron inhibits high glucose-induced calcineurin/NFAT hypertrophic pathway in H9c2 myocardial cells[J]. J Pharm Pharmacol, 2016, 68(4):485-493.

[3] Stepanov V, Stankov K, Mikov M. The bile acid membrane receptor TGR5: a novel pharmacological target in metabolic, inflammatory and neoplastic disorders[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2013, 33(4):213-223.

[4] Pols TW, Noriega LG, Nomura M, et al. The bile acid membrane receptor TGR5: a valuable metabolic target[J]. Dig Dis, 2011, 29(1):37-44.

[5] 吳 丹， 馮 健， 莫顯剛， 等. 改良的乳小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(4):62-67.

[6] Feng J, Zhang P, Chen X, et al. PI3K and ERK/Nrf2 pathways are involved in oleanolic acid-induced heme oxygenase-1 expression in rat vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(6):1524-1531.

[7] Tham YK, Bernardo BC, Ooi JY, et al. Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure: signaling pathways and novel therapeutic targets[J].Arch Toxicol, 2015, 89(9):1401-1438.

[8] 周慶峰， 劉純慧， 王洪新. 海膽黃多糖SEP抑制高糖高胰島素誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大[J]. 中國藥理學(xué)通報，2015, 31(6):844-847.

[9] 唐雪嬌， 肖 驊， 張 磊， 等. 芳香烴受體在體外高糖環(huán)境誘導(dǎo)心肌肥大過程中的表達(dá)[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(10):1744-1749.

[10]孟哲穎， 王 玉， 林艷端， 等. 成纖維細(xì)胞生長因子21對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2015, 35(1):23-28.

[11]Kumar DP, Rajagopal S, Mahavadi S, et al. Activation of transmembrane bile acid receptor TGR5 stimulates insulin secretion in pancreatic β cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 427(3):600-605.

[12]Katsuma S, Hirasawa A, Tsujimoto G. Bile acids promote glucagon-like peptide-1 secretion through TGR5 in a murine enteroendocrine cell line STC-1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 329(1):386-390.

[13]Bala V, Rajagopal S, Kumar DP, et al. Release of GLP-1 and PYY in response to the activation of G protein-coupled bile acid receptor TGR5 is mediated by Epac/PLC-ε pathway and modulated by endogenous H2S[J]. Front Phy-siol, 2014, 5:420.

[14]徐小紅， 阮駱陽， 田小華， 等. 高糖激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路致H9c2細(xì)胞肥大[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 31(11):2016-2020.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Activation of TGR5 reduces high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy by inhibiting CaN/NFAT3 signaling

FENG Jian1, WU Dan1, CHEN Xu-xin2, ZHONG Yi1, LIU Ying-cai1, LI Jia-fu1

(1DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China.E-mail: 415623fj@163.com)

AIM: To investigate the role of G-protein-coupled bile acid receptor 1(GPBR1; also known as TGR5) activation in high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy and calcineurin (CaN)/nuclear factor of activated T-cells 3 (NFAT3) signaling. METHODS: Primarily cultured mouse cardiomyocytes were used in the study. The cell surface areas of the cardiomyocytes were measured by an image analysis system. The cell protein content was detected by BCA method. The expression of TGR5, CaN and NFAT3 at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: The mouse cardiomyocytes were successfully cultured. High glucose significantly induced the increases in the cell surface area, the cell protein content and the expression of CaN and NFAT3 (P<0.05) in the cardiomyocytes. TGR5 activation or a CaN antagonist cyclosporin A inhibited high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy and the expression of CaN and NFAT3 (P<0.05). These effects of TGR5 activation were abolished byTGR5 gene interference (P<0.05). CONCLUSION: TGR5 activation reduces high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy by inhibiting CaN/NFAT3 signaling.

G-protein-coupled receptors; TGR5; Cardiomyocyte hypertrophy; High glucose; Calcineurin; Nuclear factor of activated T-cells 3

1000- 4718(2017)02- 0239- 05

2016- 09- 12

2016- 11- 09

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 31300946； No. 81300050)；瀘州市人民政府-瀘州醫(yī)學(xué)院科技戰(zhàn)略合作科技項目(No. 2013LZLY-J22)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.008

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△通訊作者 Tel： 0830-3165311； E-mail： 415623fj@163.com

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