硫化氫對低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠P47phox表達(dá)的影響

單 芳 劉雨娟 曹玉青 孫應(yīng)彪

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，甘肅 張掖 734000)

硫化氫對低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠P47phox表達(dá)的影響

單 芳 劉雨娟 曹玉青1孫應(yīng)彪2

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，甘肅 張掖 734000)

目的 觀察硫化氫H2S對低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠P47phox表達(dá)的影響。方法 36只體重(180±20)g健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為常氧組、低氧組、低氧+硫氫化鈉(NaHS)組，每組12只。低氧16 d后分別檢測其平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心室肥厚情況和肺血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化。采用Western印跡檢測肺動(dòng)脈組織P47phox的表達(dá)水平。結(jié)果 與常氧組比較，低氧組mPAP明顯升高，右室/(左室+室間隔)比值顯著增加(P<0.01)；部分肌型動(dòng)脈百分比明顯升高，非肌型動(dòng)脈百分比明顯降低(P<0.05)；肺動(dòng)脈組織P47phox表達(dá)升高(P<0.05)。與低氧組比較，低氧+ NaHS組mPAP、右室/(左室+室間隔)比值均明顯降低(P<0.01)；肺小血管中肌型動(dòng)脈、部分肌型動(dòng)脈百分比明顯降低，非肌型動(dòng)脈百分比明顯升高(P<0.05)；肺動(dòng)脈組織P47phox表達(dá)明顯降低 (P<0.01)。結(jié)論 H2S可能通過抑制大鼠肺動(dòng)脈組織P47phox表達(dá)而調(diào)節(jié)低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建和HPH的形成。

硫化氫；肺動(dòng)脈高壓；低氧； P47phox

低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)是慢性低氧性肺部疾病的一種常見并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制至今尚未闡明。肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷會導(dǎo)致肺動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞增生、肥大和凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)增加，使肺血管結(jié)構(gòu)重建，產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓。P47phox是產(chǎn)生活性氧的因子之一，其表達(dá)異常與肺動(dòng)脈高壓形成密切相關(guān)。硫化氫H2S 是新近發(fā)現(xiàn)的又一種新型氣體信使分子，具有舒張血管、改善內(nèi)皮損傷、阻止平滑肌細(xì)胞增殖的作用〔1〕。有關(guān)H2S對HPH 大鼠肺動(dòng)脈組織P47phox表達(dá)的影響，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本文通過觀察H2S對低氧大鼠肺血管結(jié)構(gòu)重建相關(guān)指標(biāo)及肺動(dòng)脈組織P47phox 表達(dá)水平的變化，探討H2S 在HPH 大鼠發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康成年雄性SD大鼠36只，體重(180±20)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。NaHS試劑購自杭州上虞京新藥業(yè)有限公司；P47phox一抗，Santa Cruz Biotechnology；二抗，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 36只大鼠隨機(jī)分為3組：常氧組(n=12)；低氧組(n=12)，放入常壓低氧艙內(nèi)，每天間斷給予缺氧6 h，連續(xù)16 d〔2〕；低氧+NaHS組(n=12)，操作同低氧組，只是每天腹腔注射1次NaHS (15 μmol/kg)，連續(xù)16 d。

1.3 大鼠肺動(dòng)脈壓力及右心室肥厚程度測定 于第17天，經(jīng)腹腔注射1%戊巴妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，選擇右側(cè)頸動(dòng)脈插管測定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。摘取大鼠右室、左室和室間隔，稱其濕重，計(jì)算右室/(左室+室間隔)比值，判斷右心室肥厚情況。

1.4 肺血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察 切取右側(cè)肺葉，10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片(厚度4 μm/張)，常規(guī)制備病理切片，采用彈力纖維Schmorl染色法，400倍光鏡觀察并測定在肺小血管中肌型動(dòng)脈(MA)、部分肌型動(dòng)脈(PMA)及非肌型動(dòng)脈(NMA)所占的比例。

1.5 肺中型動(dòng)脈和小型動(dòng)脈組織P47phox的表達(dá) 采用Western印跡測定肺中型動(dòng)脈和小型動(dòng)脈組織P47phox的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠mPAP和右室/(左室+室間隔)比值的變化 表1可見，與常氧組比較，低氧組mPAP顯著升高(P<0.01)，右室/(左室+室間隔)比值明顯升高(P<0.01)；低氧+NaHS組mPAP及右室/(左室+室間隔)比值無明顯變化(P>0.05)。與低氧組比較，低氧+NaHS組mPAP及右室/(左室+室間隔)比值明顯降低 (P<0.01)。

2.2 大鼠肺小血管不同肌化程度的變化 表2可見，與常氧組比較，低氧組大鼠肺小血管MA、PMA百分比明顯升高，而NMA百分比明顯降低(P<0.05)，提示肺血管結(jié)構(gòu)重建。與低氧組比較，低氧+NaHS組肺小血管中MA、PMA百分比明顯降低，NMA百分比明顯升高(P<0.05)，提示肺血管重建明顯降低。

表1 各組大鼠mPAP、右室/(左室+室間隔) 比值比較

與常氧組比較：1)P<0.01；與低氧組比較：2)P<0.01，下表同

表2 各組大鼠肺小管不同肌化程度比較±s,n=12，%)

圖1 各組大鼠肺MA和小型動(dòng)脈中P47phox的表達(dá)

2.3 大鼠肺MA和小型動(dòng)脈中P47phox的表達(dá)水平 圖1可見，與常氧組(0.51±0.09)比較，低氧組肺MA和小型動(dòng)脈組織中P47phox的蛋白表達(dá)水平明顯升高(0.79±0.05，P<0.05)。與低氧組比較，低氧+NaHS組(0.61±0.08,P<0.01)肺MA和小型動(dòng)脈組織中P47phox的蛋白表達(dá)水平則明顯降低。

3 討 論

缺氧所致的肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重塑，是HPH發(fā)生、發(fā)展和維持的形態(tài)基礎(chǔ)，而HPH是慢性肺源性心臟病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)〔3〕。本文結(jié)果說明低氧是形成HPH、右心室肥厚和肺血管重建的重要原因之一。

活性氧簇(ROS)的過度產(chǎn)生可引起肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)和肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重塑，在慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔4〕。NAD(P)H 氧化酶是中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS主要來源，在缺血性損害等過程中發(fā)揮重要作用。NAD(P)H氧化酶主要由5個(gè)亞基組成，包括2個(gè)膜亞基：gp91phox、p22phox和3 個(gè)胞質(zhì)亞基：p47phox、p40pox、p67phox。當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后,胞質(zhì)亞基P47phox被磷酸化激活，與p67phox結(jié)合并向胞膜轉(zhuǎn)位，與胞膜亞基結(jié)合組成有氧化活性的復(fù)合體，將氧催化為超氧自由基(-O2-)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列ROS，造成細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在低氧大鼠中P47phox表達(dá)增加，給予外源性H2S后，肺動(dòng)脈內(nèi)皮組織中P47phox表達(dá)減低，表明H2S對肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。目前，有關(guān)H2S調(diào)節(jié)HPH的機(jī)制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，給敲除P47phox 基因的大鼠血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)，其ROS 的產(chǎn)生量明顯減小〔5〕，同樣用抗-P47phxo 抗體能抑制血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)的超氧陰離子的產(chǎn)生〔6〕。本文結(jié)果表明P47phox可能參與了低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。低氧可引起P47phox 發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生，而ROS直接參與對肺動(dòng)脈內(nèi)皮組織氧化損傷，導(dǎo)致肺動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞增生、肥大和凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)增加，使肺血管結(jié)構(gòu)重建，產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓。研究證實(shí)〔7〕，H2S可以增加NAD(P)H還原型與氧化型的比例，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，H2S可能使低氧中 NAD(P)H還原型增強(qiáng)，下調(diào)低氧中P47phox表達(dá)，減少ROS生成，從而保護(hù)肺動(dòng)脈免受氧化損傷。也有研究表明H2S可以通過增加谷胱甘肽(GSH)來減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷〔8〕。GSH能夠清除人體內(nèi)的自由基，作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。

總之，H2S可能通過干擾 NAD(P)H 氧化酶生成通路的某些環(huán)節(jié),降低P47phox 的表達(dá)水平，使ROS生成減少，從而有效地保護(hù)肺動(dòng)脈內(nèi)皮組織，減輕肺血管結(jié)構(gòu)重建，抑制肺動(dòng)脈高壓形成。

1 Zhao WM,Zhang J,Lu Y,etal.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous kATP channel opener〔J〕.EMBO J,2001;20(21):6008-16.

2 薛全福,謝劍鳴,邵茂剛，等.常壓缺氧性大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的建立〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,1989;12(6):350-2.

3 Clini E，Cremona G，Campama M,etal.Production of endogenous nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease and patients with cor pulmonale:correlates with echo-doppler assessment〔J〕.Am J Respir Crit Care,Med，2000;162(2):444.

4 湯娜娜，劉先勝,徐永健，等.活性氧在慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的作用〔J〕.國際呼吸雜志,2008;28(5):318-20.

5 Takeya R,Ueno N,Sumimoto H,etal.Regulation of superoxide producing NADPH oxidases in nonphagocytic cells〔J〕.Methods Enzymol,2006;406(406):456-68.

6 Schieffer B,Luchtefeld M,Braun S,etal.Role of NAD(P)H oxidase inangiotensinⅡ-induced JAK/STAT signaling and cytokine induction〔J〕.Circ Res,2000;87(12):1195-201.

7 Deplancke B,Gaskins HR.Hydrogen Sulfide induces serum-independent cell cycle entry nontransformed rats intestinal epithelial cells〔J〕.FASEB J,2003;17(10):1310-2.

8 YuKa Kimura,Hideo Kimura.Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress〔J〕.FASEB J,2004;18(10):1165-76.

〔2015-09-25修回〕

(編輯 曹夢園)

劉雨娟(1982-)，女，碩士，副教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

單 芳(1973-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)生理學(xué)教學(xué)研究。

R36

A

1005-9202(2017)03-0571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.020

1 河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室

2 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理研究所