LY294002對(duì)高糖培養(yǎng)原代足細(xì)胞snail表達(dá)的影響

賈苗　謝玉賢　邱宏　李冰燕

【摘要】 目的：探討磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球足細(xì)胞snail表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的機(jī)制提供依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)大鼠原代腎小球足細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光法鑒定。足細(xì)胞分化完全后同步化，分為正常糖組、甘露醇對(duì)照組、高糖組、高糖+LY294002（2 mg/L）組，培養(yǎng)上述細(xì)胞48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot法半定量檢測(cè)snail的表達(dá)。結(jié)果：高糖可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，細(xì)胞體積變大，snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。與高糖組相比，高糖+LY294002（2 mg/L）組可部分抑制高糖導(dǎo)致的snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論：PI3K抑制劑可部分阻斷高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞snail表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 高糖； 足細(xì)胞； PI3K抑制劑； snail

Effect of LY294002 on Snail of Glomerular Podocytes under High Glucose Condition in Rats/JIA Miao，XIE Yu-xian，QIU Hong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：027-030

【Abstract】 Objective：To evaluate the effect of the blocker of PI3K LY294002 on the expression of snail in high glucose-induced podocyte cell.Method：The glomeruli were isolated and gathered for primary culture.The cells were randomized into normal glucose（NG） group，high glucose（HG） group，mannitol control（MG） group，HG+LY294002（2 mg/L）group. The culture was continued for 48 h.The expression of snail was observed with Western blot methods.Result：Compared with NG group，the podocytic-process retraction and partial effacement and intercellular junction losing appeared in HG group，the expression of snail was increased（P<0.05）.Compared with HG group，there was a down-regulation of the expression of snail（P<0.05）.Conclusion：PI3K inhibitor protects podocytes by partly inhibiting the expression of snail.

【Key words】 Glucose； Podocytes； LY294002； Snail

First-authors address：The Peoples Hospital of Suzhou National New & Hi-tech Industrial Development Zone，Suzhou 215129，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.007

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 是生物體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)激酶。其主要的下游是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、凋亡、增殖與分化等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。snail作為一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其可以與E-cadherin啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合，從而使上皮細(xì)胞粘附分子E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，使上皮細(xì)胞間的粘附性降低，參與上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[3]。目前關(guān)于snail在腎病方面的研究多集中在腎小管上，對(duì)足細(xì)胞的研究較少。本研究通過(guò)觀察LY294002對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠原代足細(xì)胞snail表達(dá)的影響，旨在為糖尿病腎病的診療提供新的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 雄性SD大鼠200～220 g購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)2007000580977，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼SCXK（滬）2012-0002。兔抗snail、synaptopodin購(gòu)自美國(guó)Abcam，LY294002購(gòu)自Sigma-Aldrich Corporation，DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI無(wú)糖培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物ITS、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠腎小球足細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 采用差異過(guò)篩法分離大鼠腎小球，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4-5]。無(wú)菌取腎后分離腎皮質(zhì)后輕柔研磨并逐層分別通過(guò)80、150、200目篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上的腎小球，并將其接種于細(xì)胞瓶中，采用翻轉(zhuǎn)法培養(yǎng)，放置于37 ℃ 5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4.5 h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)使其正常放置。第7～8天后，首次傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)7 d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后行倒置相差顯微鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)，并采用synaptopodin鑒定足細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 使用正常糖培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d至足細(xì)胞分化完全，相互間形成廣泛連接，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使各組細(xì)胞同步化。按下述分組分別更換不同培養(yǎng)基繼續(xù)生長(zhǎng)48 h。（1）正常濃度葡萄糖組（NG，GS 5 mmol/L）；（2）甘露醇對(duì)照組（MG，甘露醇30 mmol/L）；（3）高糖組（HG，GS 30 mmol/L）；（4）HG+LY294002（GS 30 mmol/L+ LY294002 2 mg/L）

1.2.3 Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá) 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取各組蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度后分別放于-70 ℃保存。每組樣本取50 μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后在冰盒中電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉37 ℃恒溫箱中封閉2 h，再分別加入兔抗snail（1∶200稀釋）、GAPDH多克隆抗體，4 ℃冰箱搖床上孵育過(guò)夜。洗膜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。WB條帶信號(hào)強(qiáng)度采用Lab Work45圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，測(cè)定各個(gè)條帶的積分光密度值（IOD），以snail與內(nèi)參GAPDH條帶的IOD比值代表其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間兩兩比較采用LSD方法分析，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果及鑒定 消化傳代后的足細(xì)胞呈星形，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核較增殖狀態(tài)明顯增大，最大直徑可達(dá)500 μm，自細(xì)胞體伸出樹(shù)枝樣突起，常見(jiàn)雙核，相鄰細(xì)胞間形成連接，7 d后呈完全分化狀態(tài)，見(jiàn)圖1～3。免疫熒光鑒定顯示表達(dá)synaptopodin，見(jiàn)圖4。

2.2 實(shí)驗(yàn)組觀察結(jié)果 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：HG組培養(yǎng)12、24、48h均出現(xiàn)足突回縮，直至足突消失及失去細(xì)胞間連接，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而加重，尤以48h最明顯。

2.3 LY294002對(duì)snail蛋白表達(dá)的影響 與正常糖組比較，高糖組snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。與高糖組相比，高糖+LY294002（2 mg/L）組可部分抑制高糖導(dǎo)致的snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），見(jiàn)圖5和6。

3 討論

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年提高，其主要的微血管并發(fā)癥糖尿病腎?。―KD）也已成為發(fā)達(dá)國(guó)家及我國(guó)發(fā)達(dá)城市終末期腎病的最主要原因，嚴(yán)重危害人類健康，并占國(guó)家財(cái)政支出的重要一部分。2型糖尿病腎病患者腎臟病理變化包括系膜增生、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、基底膜增厚，最終發(fā)展成腎小球硬化和廣泛間質(zhì)纖維化[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，DKD的主要發(fā)病機(jī)制為足細(xì)胞病，足細(xì)胞損傷和脫失在糖尿病腎病發(fā)生中的作用舉足輕重[6]。大量研究表明，在足細(xì)胞脫失前存在足細(xì)胞損傷[7]。足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均起源于胚胎中胚層的間葉細(xì)胞，故盡管足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，但仍然具備在病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)分化成間葉細(xì)胞的可能，其轉(zhuǎn)分化后可獲得分泌功能，從而使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌過(guò)多，導(dǎo)致腎小球硬化并最終發(fā)展至纖維化[8]。上皮細(xì)胞改變其形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椋。┏衫w維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程稱為上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（EMT）[9-10]。典型的上皮通常只有一層細(xì)胞，上皮細(xì)胞具有極性而且細(xì)胞與細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接、間隙連接、黏合連接等規(guī)則排列，從而阻止細(xì)胞從上皮分離、轉(zhuǎn)移。然而，由于間質(zhì)細(xì)胞間缺少穩(wěn)定的細(xì)胞連接，從而形態(tài)不規(guī)則，具有移動(dòng)能力。EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間以及與細(xì)胞外基質(zhì)的連接，導(dǎo)致細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基膜的分離并且獲得間質(zhì)樣細(xì)胞的生物特征，最終能夠從原發(fā)組織中轉(zhuǎn)移。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、粘連性以及轉(zhuǎn)移能力都將發(fā)生顯著變化[11-12]。EMT導(dǎo)致腎臟纖維化是腎臟長(zhǎng)期損傷或正常傷口愈合過(guò)程中功能失調(diào)，導(dǎo)致過(guò)量的ECM沉積。snail家族屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子，于1984年首次在黑腹果蠅胚胎中發(fā)現(xiàn)。snail基因在腫瘤侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)[13]通過(guò)在雞胚胎上施行Slug功能缺失實(shí)驗(yàn)，首次證明snail基因家族具有觸發(fā)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的作用。

snail可通過(guò)其鋅指區(qū)域與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)E盒主鏈上的CAGGTG序列結(jié)合而發(fā)揮其下調(diào)E-cadherin的作用，從而啟動(dòng)EMT的關(guān)鍵步驟[3]。另外，snail能通過(guò)P13K信號(hào)通路及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶9（MMP 9）轉(zhuǎn)錄，從而使表達(dá)snail的細(xì)胞獲得侵襲特性。

目前snail與腎臟纖維化的研究主要集中在腎小管上皮細(xì)胞中，其在多種腎病模型的腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腎臟纖維化[14-15]。對(duì)于DKD足細(xì)胞snail表達(dá)情況鮮有研究，本實(shí)驗(yàn)觀察到高糖環(huán)境下足細(xì)胞大量表達(dá)snail，與已有的研究結(jié)果一致[16-20]。逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞功能損傷可能延緩或減輕DN的進(jìn)展，因此探討足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制，并進(jìn)一步干預(yù)并阻斷該過(guò)程至關(guān)重要。PI3K/Akt信號(hào)通路參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，該過(guò)程主要與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，其促進(jìn)有絲分裂的靶點(diǎn)主要是Akt活化后產(chǎn)生的下游分子，包括mTOR、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）、真核啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白（4EBPS）等，同時(shí)通過(guò)磷酸化CDK1（p21Cip1與p27Kip1），正調(diào)控cyclin/CDK，因此阻斷該信號(hào)通路的活化將抑制細(xì)胞的增殖。PI3K催化亞基p110的靶向抑制LY294002可以阻斷3-磷酸肌醇的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷此通路的活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]。

本研究通過(guò)LY294002阻斷PI3K的通路，可降低高糖環(huán)境下足細(xì)胞snail的表達(dá)，說(shuō)明PI3K信號(hào)通路可能參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。本研究初步探討了PI3K信號(hào)通路與snail在高糖環(huán)境下足細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系，為今后臨床DKD的防治提供了新的干預(yù)思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Hers I，Vincent E E，Tavare J M.Akt signaling in health and disease[J].Cell Signal，2011，23（10）：1515-1527.

[2] Xu N，Lao Y，Zhang Y，et al.Akt：a double-edged sword in cell proliferation and genome stability[J].J Oncol，2012，2012：951 724.

[3] Chen X，Xiao W，Liu X，et al.Blockade of Jagged/Notch pathway abrogates transforming growth factor β2-induced epithelial-mesenchymal transition in human retinal pigment epithelium cells[J].Curr Mol Med，2014，14（4）：523-534.

[4] Ni L，Saleem M，Mathieson P W.Podocyte culture： tricks of the trade [J].Nephrology（Carlton），2012，17（6）：525-531.

[5] Shankland S J，Anders H J，Romagnani P.Glomerular parietal epithelial cells in kidney physiology， pathology， and repair[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2013，22（3）：302-309.

[6] Fu J，Lee K，Chuang P Y，et al.Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease[J].Am J Physiol Renal Physiol，2015，308（4）：F287-297.

[7] Jain S，De Petris L，Hoshi M，et al.Expression profiles of podocytes exposed to high glucose reveal new insights into early diabetic glomerulopathy[J].Lab Invest，2011，91（4）：488-498.

[8] Mora-Fernández C，Domínguez-Pimentel V，de Fuentes M M，et al.Diabetic kidney disease： from physiology to therapeutics[J].J Physiol，2014，592（18）：3997-4012.

[9] Reidy K，Kang H M，Hostetter T，et al.Molecular mechanisms of diabetic kidney disease[J].J Clin Invest，2014，124（6）：2333-2340.

[10] Brosius F C，Coward R J.Podocytes， signaling pathways， and vascular factors in diabetic kidney disease[J].Adv Chronic Kidney Dis，2014，21（3）：304-310.

[11] Komers R.Rho kinase inhibition in diabetic kidney disease[J].Br J Clin Pharmacol，2013，76（4）：551-559.

[12] Fernández B，Elewa U，Sánchez-Ni?o M D，et al.2012 update on diabetic kidney disease： the expanding spectrum， novel pathogenic insights and recent clinical trials[J].Minerva Med，2012，103（4）：219-234.

[13] Barrallo-Gimeno A，Nieto M A.The Snail genes as inducers of cell movement and survival：implications in development and cancer[J].Development，2005，132（14）：3151-3161.

[14] Ohnuki K，Umezono T，Abe M，et al.Expression of transcription factor snail and tubulointerstitial fibrosis in progressive nephropathy[J].Nephrol，2012，25（2）：233-239.

[15] Xu X Y，Chai J J，Chen Y P，et al.Hirsutella sinensis Attenuates Aristolochic Acid-Induced Renal Tubular Epithelial-Mesenchymal Transition by Inhibiting TGF-β1 and Snail Expression[J].PLoS One，2016，11（2）：e0 149 242.

[16] Bai X，Geng J，Zhou Z，et al.MicroRNA-130b improves renal tubulointerstitial fibrosis via repression of Snail-induced epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy[J].Sci Rep，2016，6：20 475.

[17] Meng F D，Li Y，Tian X，Ma P，et al.Synergistic effects of snail and quercetin on renal cell carcinoma Caki-2 by altering AKT/mTOR/ERK1/2 signaling pathways[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（6）：6157-6168.

[18] Izawa G，Kobayashi W，Haraguchi M，et al.The ectopic expression of Snail in MDBK cells does not induce epithelial-mesenchymal transition[J]. Int J Mol Med，2015，36（1）：166-172.

[19] Wei M G，Sun W，He W M，et al.Ferulic Acid Attenuates TGF-β1-Induced Renal Cellular Fibrosis in NRK-52E Cells by Inhibiting Smad/ILK/Snail Pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：619 720.

[20] Lin T C，Liu Y P，Chan Y C，et al.Ghrelin promotes renal cell carcinoma metastasis via Snail activation and is associated with poor prognosis[J].J Pathol，2015，237（1）：50-61.

（收稿日期：2016-11-18） （本文編輯：程旭然）