豬腦死亡對血清ET—1及TNF—α、IL—1β、IL—6表達影響的初步研究

鄭鵬斌　萬晨光　馮學泉++馬景鑑　陳立　唐纓　牛寧寧　史源

【摘要】 目的：探討“漸進式”顱內加壓法誘導豬腦死亡對血清中ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6表達的影響。方法：雄性長白豬12頭，隨機分為兩組，對照組：顱內置入顱內壓探頭及水囊導管，但不進行顱內加壓；腦死亡組：顱內置入顱內壓探頭及水囊導管，根據(jù)顱內壓和平均動脈壓的關系，調整加壓強度建立腦死亡模型，并通過呼吸、循環(huán)維持腦死亡狀態(tài)12 h，并檢測血清ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6水平。結果：腦死亡組ET-1水平從腦死亡0 h即逐漸升高，TNF-α、IL-1β、IL-6從腦死亡后6 h開始升高，上述因子水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：腦死亡時TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子升高相對遲緩，而ET-1水平發(fā)生變化較早，靈敏度高，這可能與其作為前炎癥介質有關。

【關鍵詞】 腦死亡； 炎癥因子； 內皮素-1

Preliminary Study of Effect of Brain Death on Serum ET-1，TNF-α，IL-1β and IL-6 Expression in Pigs/ZHENG Peng-bin，WAN Chen-guang，F(xiàn)ENG Xue-quan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：006-010

【Abstract】 Objective：To investigate the influence of brain dead induced by “progressive” intracranial compression on the expression of ET-1，TNF-α，IL-1βand IL-6 in serum.Method：Twelve male Landraces were randomly assigned into two groups，the control group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，but without compression.And the brain-dead group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，according to the relationship between intracranial pressure and mean arterial pressure，adjust the intensity of intracranial compression to establish the brain death model，and through the respiration and circulation to maintain brain death status 12 h.The serum levels of ET-1，TNF-α，IL-1β，IL-6 were detected by radioimmunological analyzer.Result：The serum level of ET-1 in the brain death group was gradually increased from the beginning of brain death，TNF-α，IL-1β，IL-6 increased from 6 h after brain death，and the above factors were significantly different compared with those in the control group（P<0.05）.Conclusion：The results of this experiment show that in brain death TNF-α，IL-1β，IL-6 and other cytokines increased relatively slow，but ET-1 levels changes earlier with high sensitivity，which may be related to as proinflammatory mediators.

【Key words】 Brain death； Inflammatory factor； ET-1

First-authors address：The First Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.002

腦死亡是一個極其復雜的病理生理過程，且涉及多系統(tǒng)、器官。在分子水平探求該過程中某些因子的變化，有助于揭示腦死亡的分子病理機制，無論對重型顱腦損傷的救治還是腦死亡器官移植供體的保護，均具有重要的理論價值[1-2]。研究表明，腦死亡可激發(fā)機體發(fā)生急性非特異性炎癥反應從而影響著各個器官的功能，即腦死亡狀態(tài)下，細胞介質大量釋放及免疫功能的過度激活是腦死亡從局部病變迅速發(fā)展為全身急性炎癥反應綜合征，進而引起多系統(tǒng)器官衰竭的重要機制[3-4]。本研究旨在初步探討腦死亡對一些常見炎癥因子表達的影響，為模擬臨床常見腦損傷情況，本實驗采取在實時顱內壓監(jiān)測下“漸進式”顱內加壓法誘導豬腦死亡，并檢測血清中炎癥介質（包括ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達水平及其變化規(guī)律，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康清潔雄性長白豬12頭，體重（39.6±5.2）kg。隨機均分為兩組，即對照組（A組）：顱內置入顱內壓探頭及水囊導管，但不進行顱內加壓；腦死亡組（B組）：顱內置入顱內壓探頭及水囊導管，根據(jù)顱內壓（ICP）和平均動脈壓（MAP）的關系，調整顱內加壓強度建立腦死亡模型，并通過呼吸、循環(huán)維持腦死亡狀態(tài)12 h。

1.2 主要試劑及儀器 ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒，MP150 16通道生理信號記錄分析儀，顱內壓監(jiān)護儀，顱內壓監(jiān)測探頭，多功能呼吸麻醉機，F(xiàn)oley 14F水囊導管。

1.3 麻醉方法 術前禁食12 h，禁水6 h。麻醉開始前10 min臀大肌肌肉注射地西泮0.4 mg/kg、阿托品0.03 g/kg、鹽酸胺碘酮15 g/kg行基礎麻醉，豬仰臥位固定，行氣管插管并連接多功能麻醉機（通氣參數(shù)：潮氣量9～13 mL/kg，吸氧濃度50%～90%，吸呼比1∶2，呼吸頻率15～20次/min，以2%～3%濃度的七氟烷持續(xù)麻醉，并間斷靜注維庫溴銨維持肌肉松弛。尾脫毛連氧飽和探頭。

1.4 術中監(jiān)測 麻醉滿意后立即連接多功能監(jiān)護儀監(jiān)測心率（HR）和脈搏血氧飽和度。頸部手術暴露左側頸外動脈及頸內靜脈和右側頸外靜脈之后，分別穿刺置管，并且建立有創(chuàng)動脈壓（IABP）、中心靜脈壓（CVP）檢測及補液通路。膀胱造瘺置尿管接尿袋并固定。

1.5 模型建立 對Pratschke等[5]采用經典腦死亡模型進行改良，在實時顱內壓監(jiān)測條件下，建立穩(wěn)定的豬腦死亡模型[6]。具體步驟如下：俯臥位固定豬，于雙眼連線與矢狀線交點后1 cm處行顱骨錐孔直徑約2 cm，分離硬腦膜，F(xiàn)oley 14F水囊導管置于硬腦膜外并連接壓力注射泵以備注水加壓。于置水囊導管孔后2 cm左側旁開1.5 cm處再行顱骨錐孔并置入Codman顱內壓監(jiān)測探頭，外接ICP監(jiān)護儀。于左右眶緣后2 cm處對稱置入2支電極，參考電極固定在豬耳緣上并連接腦電圖機，記錄豬腦電（EEG）變化。然后以2.0 mL/min經Foley 14F水囊導管行顱內加壓，直至ICP持續(xù)大于MAP，停止注水加壓，60 min后停止所有麻醉維持藥物，繼續(xù)觀察EEG并初步判定是否腦死亡。

1.6 腦死亡判定標準 參考《腦死亡判定標準與技術規(guī)范（成人質控版）》[7]擬定豬腦死亡判定標準如下：（1）深昏迷，排除麻醉、低溫等導致的可逆性昏迷；（2）瞳孔對光反射、角膜反射均消失；（3）激發(fā)試驗證實無自主呼吸，靠呼吸機維持通氣；（4）腦電圖呈靜息電位。

1.7 腦死亡狀態(tài)維持 根據(jù)血流動力學、出入量、血氧飽和度等變化給予對癥處理，維持豬腦死亡狀態(tài)生命體征接近臨床腦死亡供體的要求[8-9]，即MAP>60 mm Hg，CVP 10～12 mm Hg，血氧飽和度≥95%，體溫≥35 ℃。

1.8 觀察指標 于顱內加壓前（T1）、腦死亡0 h（T2）、腦死亡1 h（T3）、腦死亡3 h（T4）、腦死亡6 h（T5）、腦死亡后12 h（T6）6個時間點采血，靜置離心后留取血清，置于-80 ℃保存待測。由廣州瑞博生物科技有限公司檢測各組樣本血清中ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組動物MAP與ICP變化 在整個實驗過程中，A組動物MAP和ICP變化小，各時間點間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；顱內加壓前，兩組MAP比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；顱內加壓過程中，B組因ICP增高出現(xiàn)Cushing反應，且MAP較A組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；腦死亡狀態(tài)下，B組MAP雖然較A組有所降低，但兩組比較差異無統(tǒng)學意義（P>0.05）。見表1和2。

2.2 兩組血清ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化 在整個實驗過程中，B組血清ET-1水平在腦死亡時開始升高，然而血清TNF-α、IL-1β、IL-6在腦死亡后6 h才開始升高，且上述介質水平與A組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；B組相鄰時間點各炎癥介質水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。A組血清各炎癥介質水平變化差異小，各時間點間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3～6。

3 討論

目前，動物腦死亡模型建立方法很多（如硬腦膜外加壓法、顱內制造血腫法、頸內動脈結扎法等），但應用最廣泛的是顱內加壓法建立的腦死亡模型，而顱內加壓方式又分為爆發(fā)式[10]和漸進式[5]。爆發(fā)式腦死亡模型是指在極短時間內迅速加壓直至腦死亡，該模型常常導致難治性低血壓而使動物腦死亡狀態(tài)無法長時間維持。而經典的Pratschke漸進式腦死亡模型是指根據(jù)血流動力學變化緩慢間斷的進行顱內加壓逐漸導致腦死亡。大量統(tǒng)計表明，臨床腦死亡患者不管是腦血管意外還是重型顱腦損傷所導致的顱內持續(xù)高壓通常不是在短時間內造成的，而是在較長的一段時間后逐漸形成的。因此，改良的緩慢間斷顱內加壓法與臨床腦死亡的發(fā)生發(fā)展最為相似，而本研究是對Pratschke等采用的經典腦死亡模型進行改良[2]，在實時顱內壓監(jiān)測條件下，建立穩(wěn)定的豬腦死亡模型，即在建立模型過程中，使顱內壓不低于平均動脈壓，導致腦血流量灌注嚴重不足，引起腦代謝障礙和腦脊液循環(huán)障礙，最終造成腦嚴重缺血缺氧及腦水腫而發(fā)生腦死亡。在顱內壓增高過程中，腦組織因缺血缺氧等理化因素，刺激交感神經合成和分泌大量兒茶酚胺，進而引發(fā)“交感風暴”，出現(xiàn)血壓增高、心率加快等現(xiàn)象，而后實驗動物出現(xiàn)Cushing反應[11]（即血壓升高、心跳減慢等），此時腦血流量自動調節(jié)功能已喪失[10，12]。筆者發(fā)現(xiàn)在實時顱內壓監(jiān)測狀態(tài)下建立的腦死亡模型無論是在建立模型中還是腦死亡狀態(tài)下的生命體征均較其他方法更加平穩(wěn)，這可能與在實時顱內壓監(jiān)測條件下建立腦死亡模型時，根據(jù)顱內壓和平均動脈壓的變化調整顱內加壓強度從而避免了因盲目加壓所造成的顱內壓大幅度波動有關。

腦死亡可促進細胞介質大量釋放及免疫功能的過度激活，而發(fā)生急性非特異性炎癥反應和免疫應答反應，導致腦死亡從局部病變迅速發(fā)展為全身炎癥綜合征，從而嚴重影響著腦死亡供體器官的功能及其移植的預后[2-3，13]。國外學者Skrabal等[1]在研究動物腦死亡與炎癥介質的關系時，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中均明顯升高，IL-1β、IL-6在心肺腎組織中均明顯升高，然而TNF-α僅在肺組織中顯著升高。Barklin[4]卻發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6、IL-10在腦死亡組心肝腎組織中的表達水平和對照組比較無明顯差異。Amado等[14]在研究18例腦死亡患者血清炎癥介質水平的變化規(guī)律時，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β的表達水平無明顯，而IL-6的表達水平卻顯著升高。孫振濤等[15]和朱長舉[16]通過采用改良的緩慢間斷顱內加壓法建立腦死亡模型來研究豬腦死亡與炎癥的關系時發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中的表達水平自腦死亡后3 h就已經顯著升高了，而筆者在研究探討豬腦死亡與炎癥介質的關系時，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6血清的表達水平自腦死亡后6 h才開始逐漸升高。這可能是因為在實時顱內壓監(jiān)測條件下建立腦死亡模型時，根據(jù)顱內壓和平均動脈壓的變化調整顱內加壓強度，不僅避免了顱內壓升高過快或過高所造成不必要的腦組織損傷，而且避免了因顱內壓波動過度造成的血流動力學的大幅度波動有關，因為上述兩者均可導致機體血流動力學紊亂，各個組織器官灌注不足等進而發(fā)生炎癥反應。

除了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥反應常見檢測指標，筆者對最強的縮血管活性肽，內皮素-1（endothelin-1，ET-1），也進行了檢測。ET-1是由21個氨基酸組成的，主要由內皮細胞合成和分泌，也廣泛存在于各個臟器組織細胞內。近年來研究發(fā)現(xiàn)ET-1在炎癥反應中發(fā)揮著不可取代的促炎作用。Foitzik等[17]和Paulino等[18]在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)內皮素可介導小鼠體內的單核細胞、中性粒細胞及淋巴細胞等合成和分泌大量炎癥介質，誘導全身炎癥反應以及多器官功能衰竭。黃瑩等[19]在重癥急性胰腺炎SD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)血清內皮素水平顯著升高。李莉等[20]在研究腦死亡大鼠肝功能時發(fā)現(xiàn)血清ET-1在腦死亡時就開始升高，并隨著腦死亡時間的延長而逐漸升高。筆者在研究探討豬腦死亡血清ET-1水平的變化時，發(fā)現(xiàn)血清ET-1水平在判定腦死亡時就已經明顯升高，而且較TNF-α、IL-1β、IL-6等典型炎癥因子水平升高提前，這是因為在顱內壓增高過程中，動物發(fā)生應激反應促進ET-1分泌，而ET-1又作為前炎癥因子可誘導白細胞等合成和分泌炎癥介質而激發(fā)急性非特異性炎癥反應，同時這些炎癥介質又可通過正反饋作用促進ET-1的合成和分泌以及誘導其他多種炎癥介質的分泌，可見ET-1用于檢測腦死亡所介導的炎癥反應較其他炎癥介質更靈敏。

綜上所述，腦死亡時炎癥反應及炎癥因子表達與腦死亡過程的快、慢密切相關，本實驗采取實時顱內壓監(jiān)測下“漸進式”顱內加壓法建立的腦死亡模型不僅更加穩(wěn)定，而且急性非特異性炎癥反應發(fā)生相對遲緩且較輕。就本實驗檢測的指標而言，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子升高相對遲緩，ET-1水平升高較早，靈敏度高，這可能與其作為前炎癥介質有關。

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（收稿日期：2016-11-16） （本文編輯：程旭然）