LY294002對高糖培養(yǎng)原代足細(xì)胞snail表達(dá)的影響

賈苗　謝玉賢　邱宏　李冰燕

【摘要】 目的：探討磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球足細(xì)胞snail表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的機(jī)制提供依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)大鼠原代腎小球足細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光法鑒定。足細(xì)胞分化完全后同步化，分為正常糖組、甘露醇對照組、高糖組、高糖+LY294002（2 mg/L）組，培養(yǎng)上述細(xì)胞48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot法半定量檢測snail的表達(dá)。結(jié)果：高糖可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，細(xì)胞體積變大，snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。與高糖組相比，高糖+LY294002（2 mg/L）組可部分抑制高糖導(dǎo)致的snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論：PI3K抑制劑可部分阻斷高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞snail表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 高糖； 足細(xì)胞； PI3K抑制劑； snail

Effect of LY294002 on Snail of Glomerular Podocytes under High Glucose Condition in Rats/JIA Miao，XIE Yu-xian，QIU Hong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：027-030

【Abstract】 Objective：To evaluate the effect of the blocker of PI3K LY294002 on the expression of snail in high glucose-induced podocyte cell.Method：The glomeruli were isolated and gathered for primary culture.The cells were randomized into normal glucose（NG） group，high glucose（HG） group，mannitol control（MG） group，HG+LY294002（2 mg/L）group. The culture was continued for 48 h.The expression of snail was observed with Western blot methods.Result：Compared with NG group，the podocytic-process retraction and partial effacement and intercellular junction losing appeared in HG group，the expression of snail was increased（P<0.05）.Compared with HG group，there was a down-regulation of the expression of snail（P<0.05）.Conclusion：PI3K inhibitor protects podocytes by partly inhibiting the expression of snail.

【Key words】 Glucose； Podocytes； LY294002； Snail

First-authors address：The Peoples Hospital of Suzhou National New & Hi-tech Industrial Development Zone，Suzhou 215129，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.007

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 是生物體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)激酶。其主要的下游是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞代謝、凋亡、增殖與分化等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。snail作為一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其可以與E-cadherin啟動子上的E-box結(jié)合，從而使上皮細(xì)胞粘附分子E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，使上皮細(xì)胞間的粘附性降低，參與上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[3]。目前關(guān)于snail在腎病方面的研究多集中在腎小管上，對足細(xì)胞的研究較少。本研究通過觀察LY294002對高糖培養(yǎng)的大鼠原代足細(xì)胞snail表達(dá)的影響，旨在為糖尿病腎病的診療提供新的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 雄性SD大鼠200～220 g購自上海斯萊克實驗動物中心，質(zhì)量合格證號2007000580977，實驗動物使用許可證號碼SCXK（滬）2012-0002。兔抗snail、synaptopodin購自美國Abcam，LY294002購自Sigma-Aldrich Corporation，DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI無糖培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物ITS、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠腎小球足細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 采用差異過篩法分離大鼠腎小球，方法參見文獻(xiàn)[4-5]。無菌取腎后分離腎皮質(zhì)后輕柔研磨并逐層分別通過80、150、200目篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上的腎小球，并將其接種于細(xì)胞瓶中，采用翻轉(zhuǎn)法培養(yǎng)，放置于37 ℃ 5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4.5 h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來使其正常放置。第7～8天后，首次傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)7 d，待細(xì)胞長滿瓶底后行倒置相差顯微鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)，并采用synaptopodin鑒定足細(xì)胞。

1.2.2 實驗分組 使用正常糖培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d至足細(xì)胞分化完全，相互間形成廣泛連接，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使各組細(xì)胞同步化。按下述分組分別更換不同培養(yǎng)基繼續(xù)生長48 h。（1）正常濃度葡萄糖組（NG，GS 5 mmol/L）；（2）甘露醇對照組（MG，甘露醇30 mmol/L）；（3）高糖組（HG，GS 30 mmol/L）；（4）HG+LY294002（GS 30 mmol/L+ LY294002 2 mg/L）

1.2.3 Western-blot法檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá) 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取各組蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后分別放于-70 ℃保存。每組樣本取50 μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后在冰盒中電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉37 ℃恒溫箱中封閉2 h，再分別加入兔抗snail（1∶200稀釋）、GAPDH多克隆抗體，4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。WB條帶信號強(qiáng)度采用Lab Work45圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，測定各個條帶的積分光密度值（IOD），以snail與內(nèi)參GAPDH條帶的IOD比值代表其蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間兩兩比較采用LSD方法分析，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果及鑒定 消化傳代后的足細(xì)胞呈星形，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核較增殖狀態(tài)明顯增大，最大直徑可達(dá)500 μm，自細(xì)胞體伸出樹枝樣突起，常見雙核，相鄰細(xì)胞間形成連接，7 d后呈完全分化狀態(tài)，見圖1～3。免疫熒光鑒定顯示表達(dá)synaptopodin，見圖4。

2.2 實驗組觀察結(jié)果 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：HG組培養(yǎng)12、24、48h均出現(xiàn)足突回縮，直至足突消失及失去細(xì)胞間連接，隨培養(yǎng)時間延長而加重，尤以48h最明顯。

2.3 LY294002對snail蛋白表達(dá)的影響 與正常糖組比較，高糖組snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05）。與高糖組相比，高糖+LY294002（2 mg/L）組可部分抑制高糖導(dǎo)致的snail表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），見圖5和6。

3 討論

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年提高，其主要的微血管并發(fā)癥糖尿病腎病（DKD）也已成為發(fā)達(dá)國家及我國發(fā)達(dá)城市終末期腎病的最主要原因，嚴(yán)重危害人類健康，并占國家財政支出的重要一部分。2型糖尿病腎病患者腎臟病理變化包括系膜增生、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、基底膜增厚，最終發(fā)展成腎小球硬化和廣泛間質(zhì)纖維化[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，DKD的主要發(fā)病機(jī)制為足細(xì)胞病，足細(xì)胞損傷和脫失在糖尿病腎病發(fā)生中的作用舉足輕重[6]。大量研究表明，在足細(xì)胞脫失前存在足細(xì)胞損傷[7]。足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均起源于胚胎中胚層的間葉細(xì)胞，故盡管足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，但仍然具備在病理條件下轉(zhuǎn)分化成間葉細(xì)胞的可能，其轉(zhuǎn)分化后可獲得分泌功能，從而使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌過多，導(dǎo)致腎小球硬化并最終發(fā)展至纖維化[8]。上皮細(xì)胞改變其形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椋。┏衫w維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程稱為上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（EMT）[9-10]。典型的上皮通常只有一層細(xì)胞，上皮細(xì)胞具有極性而且細(xì)胞與細(xì)胞之間通過緊密連接、間隙連接、黏合連接等規(guī)則排列，從而阻止細(xì)胞從上皮分離、轉(zhuǎn)移。然而，由于間質(zhì)細(xì)胞間缺少穩(wěn)定的細(xì)胞連接，從而形態(tài)不規(guī)則，具有移動能力。EMT過程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間以及與細(xì)胞外基質(zhì)的連接，導(dǎo)致細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基膜的分離并且獲得間質(zhì)樣細(xì)胞的生物特征，最終能夠從原發(fā)組織中轉(zhuǎn)移。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞時，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、粘連性以及轉(zhuǎn)移能力都將發(fā)生顯著變化[11-12]。EMT導(dǎo)致腎臟纖維化是腎臟長期損傷或正常傷口愈合過程中功能失調(diào)，導(dǎo)致過量的ECM沉積。snail家族屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子，于1984年首次在黑腹果蠅胚胎中發(fā)現(xiàn)。snail基因在腫瘤侵潤、轉(zhuǎn)移及胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)[13]通過在雞胚胎上施行Slug功能缺失實驗，首次證明snail基因家族具有觸發(fā)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的作用。

snail可通過其鋅指區(qū)域與E-cadherin啟動子區(qū)E盒主鏈上的CAGGTG序列結(jié)合而發(fā)揮其下調(diào)E-cadherin的作用，從而啟動EMT的關(guān)鍵步驟[3]。另外，snail能通過P13K信號通路及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶9（MMP 9）轉(zhuǎn)錄，從而使表達(dá)snail的細(xì)胞獲得侵襲特性。

目前snail與腎臟纖維化的研究主要集中在腎小管上皮細(xì)胞中，其在多種腎病模型的腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腎臟纖維化[14-15]。對于DKD足細(xì)胞snail表達(dá)情況鮮有研究，本實驗觀察到高糖環(huán)境下足細(xì)胞大量表達(dá)snail，與已有的研究結(jié)果一致[16-20]。逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞功能損傷可能延緩或減輕DN的進(jìn)展，因此探討足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制，并進(jìn)一步干預(yù)并阻斷該過程至關(guān)重要。PI3K/Akt信號通路參與多種細(xì)胞的生長與增殖，該過程主要與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，其促進(jìn)有絲分裂的靶點(diǎn)主要是Akt活化后產(chǎn)生的下游分子，包括mTOR、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）、真核啟動因子4E結(jié)合蛋白（4EBPS）等，同時通過磷酸化CDK1（p21Cip1與p27Kip1），正調(diào)控cyclin/CDK，因此阻斷該信號通路的活化將抑制細(xì)胞的增殖。PI3K催化亞基p110的靶向抑制LY294002可以阻斷3-磷酸肌醇的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷此通路的活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[1]。

本研究通過LY294002阻斷PI3K的通路，可降低高糖環(huán)境下足細(xì)胞snail的表達(dá)，說明PI3K信號通路可能參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。本研究初步探討了PI3K信號通路與snail在高糖環(huán)境下足細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系，為今后臨床DKD的防治提供了新的干預(yù)思路。

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（收稿日期：2016-11-18） （本文編輯：程旭然）