糖尿病心肌病患者血清APE1的表達改變和意義

郭潤民　吳子君　黃瑞娜

【摘要】 目的：探討脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE1）在糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）患者血清的表達改變和意義。方法：收集對照、糖尿病和DCM患者血清，ELISA法檢測血清APE1的表達，F(xiàn)AM熒光標(biāo)記法檢測血清APE1的酶活性。結(jié)果：與對照組、糖尿病組相比，DCM組患者血清APE1的表達明顯增加，而其DNA核酸內(nèi)切酶活性顯著降低。結(jié)論：表達增加而DNA修復(fù)功能減退的APE1可能參與糖尿病心肌病的發(fā)病過程。

【關(guān)鍵詞】 糖尿病心肌病； 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1； DNA修復(fù)功能

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and significance of APE1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1） in diabetic cardiomyopathy（DCM） patients.Method：Levels of APE1 in serum were assayed by ELISA kit.Enzymic activity of serum APE1 in DCM patients was measured using FAM labeled fluorescence assay.Result：Serum levels of APE1 were dramatically elevated in DCM patients compared with the control group and the diabetes group，endonuclease activity of APE1 significantly lower than those of the control group and the diabetes group.Conclusion：Elevated serum APE1 with its DNA repair dysfunction might be involved in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy.

【Key words】 Diabetic cardiomyopathy； Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1； DNA repair function

First-authors address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.002

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病獨立于高血壓、冠心病及心臟瓣膜病變的一種心臟并發(fā)癥，是糖尿病患者心血管疾病高發(fā)生率及高病死率的重要原因[1-2]。氧化應(yīng)激、DNA氧化性損傷、心肌細胞凋亡等因素與DCM發(fā)病密切相關(guān)，其中氧化應(yīng)激及DNA氧化性損傷是DCM的主要發(fā)病機制之一[3-4]。

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE1；即氧化還原因子-1，redox factor-1，ref-1），是維持細胞內(nèi)氧化還原平衡和修復(fù)DNA氧化性損傷的雙功能蛋白酶[5-9]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：APE1在肺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤的發(fā)病中可能有重要作用，也與神經(jīng)退行性疾病、腦卒中以及冠心病的發(fā)病及嚴(yán)重程度關(guān)系密切[10-12]。然而，在DCM心肌損傷中的具體作用及機制尚不清。因此，本研究擬DCM患者血清APE1表達改變和意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 DCM診斷標(biāo)準(zhǔn)與血液樣本采集 選擇2013年7月-2016年7月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康者60例，單純糖尿病患者60例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[1-2]報道，具體如下：確診糖尿病病程5年以上；心臟擴大、心力衰竭、心絞痛或心律失常存在；冠脈造影排除冠狀動脈血管病變；無其他原因的心肌病和心臟病。排除急性腦梗死患者、自身免疫性疾病、使用激素或免疫抑制劑者、發(fā)病前2周有炎癥、感染性疾病、依從性差不能完成相關(guān)指標(biāo)測定的患者。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過，均獲得參與本研究所有患者的知情同意書。采集DCM患者空腹外周靜脈血10 mL，將其置于不含抗凝劑的收集管中，室溫靜置30 min后，4000 r/min離心20 min，離心留取上清低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雙抗體夾心ELISA法檢測血清APE1的表達 取DCM患者血清100 μL加入預(yù)先用APE1抗體包被的酶標(biāo)板中，37 ℃孵育90 min，然后吸出培養(yǎng)基，加入APE1抗體繼續(xù)孵育60 min，經(jīng)TBS漂洗3次，加入生物素標(biāo)記的二抗，反應(yīng)30 min，采用TMB法顯色，經(jīng)終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀記錄各孔450 nm的吸光度（A）。取3孔的平均數(shù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算APE1的表達。

1.3 FAM熒光標(biāo)記法檢測血清APE1的核酸內(nèi)切酶活性 首先，寡脫氧核糖核苷酸（寡核苷酸）帶有熒光基團（6-FAM基團）和淬滅基團（Dabcyl熒光淬滅基團）在FAM（BHQ1）-GCA CTXAAG AAT TCA CGC C A T GTC GAA ATT CTT AAG TGC–Dabcyl的5和3末端，X或者是四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF），或者是胸腺嘧啶殘基（作為對照），上海生工合成（上海生工，中國）。本寡核苷酸具有5和3末端互補形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)雙鏈核酸。熒光基團可被鄰近的淬滅基團淬滅，具有99%的淬滅效能。20 μL 500 nM 890-FAM（BHQ1） oligo和20 μL APE1蛋白樣品加入96孔板?；旌虾?，分別于0、5、10、15、20、25、30、40 min采用LB 940 Multimode Microplate Reader（Berthold Mithras，德國）測定，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般資料 選擇2013年7月-2016年7月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的糖尿病心肌病患者30例（DCM組），健康者60例（對照組），單純糖尿病患者60例（糖尿病組），三組患者一般資料比較，見表1。

2.2 糖尿病心肌病患者血清APE1表達的改變 血清APE1水平測定采用ELISA方法，與對照組、糖尿病組相比，DCM患者血清APE1的表達明顯增加，見圖1。

2.3 糖尿病心肌病患者血清APE1核酸內(nèi)切酶活性的改變 血清APE1核酸內(nèi)切酶活性測定采用FAM標(biāo)記的熒光方法，與對照組、糖尿病組相比，DCM患者血清APE1的DNA核酸內(nèi)切酶活性顯著降低，見圖2。

3 討論

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病引起的心臟并發(fā)癥，獨立于高血壓、冠心病及心臟瓣膜病變，機制主要是心肌代謝紊亂所致的心肌細胞死亡，臨床表現(xiàn)為心肌收縮和舒張功能下降、心律失常甚至心力衰竭[1-2]。近年來，全球糖尿病的發(fā)病率逐年升高，DCM是糖尿病患者心血管疾病高發(fā)生率及高病死率的重要病因，它的防治有待解決。已有研究表明：氧化應(yīng)激、DNA損傷、心肌細胞凋亡等是DCM發(fā)病機制，但其詳細的發(fā)病機制尚未明確[3-4]。

高糖、高脂和高胰島素等代謝紊亂能引起心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，ROS可以直接或間接攻擊蛋白質(zhì)、脂類和DNA，形成8羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）和AP位點（apurinic/apyrimidinic sites）等DNA氧化性損傷產(chǎn)物，脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1）是針對DNA氧化損傷進行堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）的關(guān)鍵修復(fù)酶，在哺乳動物細胞中，APE1 承擔(dān)了大于95%的AP核酸內(nèi)切酶活性[5-9]。APE1在肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤的發(fā)病與預(yù)后密切相關(guān)，也與神經(jīng)退行性疾病、腦卒中以及冠心病的發(fā)病及疾病嚴(yán)重程度關(guān)系密切[6-9]。APE1在腫瘤組織的高表達與部分腫瘤患者預(yù)后差呈正相關(guān)，這可能與APE1參與腫瘤細胞耐藥、血管形成、放療耐受等有關(guān)[13-17]。前期有報道顯示：糖尿病及其并發(fā)癥患者氧化應(yīng)激及DNA損傷增加（如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等），并且與血糖控制和預(yù)后關(guān)系緊密[18-20]；然而，DCM患者DNA損傷和APE1表達及活性的變化尚未見報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)：DCM患者血清APE1的表達明顯增加，而其DNA核酸內(nèi)切酶活性顯著降低。

但是，血清APE1表達及其酶活性改變與DCM患者心肌損傷之間的關(guān)系還需要深入探討，如在DCM動物和細胞模型的驗證APE1表達及功能，深入分析APE1表達及功能與DCM患者心功能和心肌損傷的直接關(guān)聯(lián)，這將有助于闡明APE1在DCM心肌損傷中的直接作用和相關(guān)機制。

綜上所述，APE1表達增加而DNA修復(fù)功能減退可能參與糖尿病心肌病心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。深入研究APE1表達及功能變化在DCM發(fā)病中的具體作用及機制，以及與DCM診斷和預(yù)后的關(guān)系，均將有助于闡明DCM的發(fā)病機制和找到DCM的防治新策略。

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（收稿日期：2016-09-30） （本文編輯：程旭然）