豬圓環(huán)病毒二型Capsid表面五倍軸loops的研究進展

劉思遠

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)逆向疫苗研究中心&功能蛋白組學(xué)實驗室，湖南長沙410128）

豬圓環(huán)病毒二型Capsid表面五倍軸loops的研究進展

劉思遠1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)逆向疫苗研究中心&功能蛋白組學(xué)實驗室，湖南長沙410128）

豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的核苷酸序列高度同源，但兩者的Cap蛋白結(jié)構(gòu)存在較大差異且PCV1不致病。通過近年來研究兩者Cap蛋白結(jié)構(gòu)的文獻以及比對PCV1與PCV2病毒顆粒表面五倍軸的三段loops氨基酸序列及蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬展示結(jié)果，觀察Loop BC，Loop DE以及Loop HI的潛在功能和作用，本綜述目的在于進一步揭示PCV2 virus-like particles(VLPs)組裝及其細胞入侵分子機理，有助于PCV2疫苗及藥物載體等的研究與開發(fā)，為PCV2疫苗、藥物載體等研究與開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；Cap蛋白；loops的結(jié)構(gòu)；五倍軸

豬圓環(huán)病毒屬于豬圓環(huán)病毒科（Circoviridae），圓環(huán)病毒屬，是最小的病毒之一，PCV的基因大小為1759～1768 bp,分為PCV1與PCV2兩種血清型，其中PCV1不致病，但PCV2每年都給世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PCV1最早在上個世紀70年代被發(fā)現(xiàn)做為非致病性的細胞污染物在豬腎上皮細胞（PK15）中存在。均包含了ORF1和ORF2這2個主要的開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF），其中ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep和Rep’蛋白，與宿主聚合酶的共同參與病毒基因的滾環(huán)復(fù)制，ORF2則反向編碼病毒的唯一功能衣殼蛋白即Cap蛋白。

60個單亞基Cap蛋白可以組裝成一個直徑大小為17～20nm正二十面體的衣殼蛋白組裝體（capsid）。根據(jù)2011年P(guān)CV2的capsid晶體結(jié)構(gòu)分析指出，Cap蛋白質(zhì)由8個β折疊片和（β-strands）折疊一個典型的jellyroll結(jié)構(gòu)，與此同時，Cap蛋白還含有7個loops結(jié)構(gòu)，這7個loop結(jié)構(gòu)將上述8個β-strands連接在一起，在capsid的組裝與穩(wěn)定中起到很大作用，其次，在Cap蛋白的NH2端有一段富含正電荷氨基酸殘基的核定位信號區(qū)（Nuclear Localization Signal,NLS）被包裹在核衣殼內(nèi)部，參與病毒的基因組包裝。

通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，病毒的核衣殼表面大部分被loops占領(lǐng)，且在病毒的生長進化中l(wèi)oop也是突變率最高的區(qū)域，同時經(jīng)比對可見PCV1與PCV2的loop區(qū)也存在巨大的差異。由于PCV2是無囊膜病毒，在于宿主細胞相互作用及隨后細胞的內(nèi)吞（internalization）過程中，參與中和抗體識別反應(yīng)的抗原表位也多包含了病毒核衣殼表面的關(guān)鍵氨基酸。

近年來，我們對這些loop的功能作用知之甚少，有待深入研究，本文對近年來與Capsid表面最高峰Loop BC區(qū)域相關(guān)的文章進行了研究整理，以此為PCV2的功能結(jié)構(gòu)研究與新型疫苗的開發(fā)提供參考。

1. Cap蛋白的研究進展

1.1 PCV2的基因組結(jié)構(gòu)

PCV2分為三個主要基因亞型（subtypes）: PCV2a,PCV2b和PCV2c。PCV2a和PCV2b是目前世界主要流行的毒株，而PCV2c主要在丹麥報道過。根據(jù)病毒基因組的差異，PCV2a又可以分為2A、2B、2C、2D、2E五簇 (clusters)，PCV2b可以分為1A、1B、1C三簇。PCV2病毒顆粒平均大小在12～23 nm，是目前世界發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一。被認為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PWMS)及圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcine Circovirus-associated Disease,PCVAD）主要病原體。

PCV2病毒基因組以O(shè)RF1與ORF2為主，其中ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白即Rep與Rep’蛋白。Cap基因是PCV2的ORF2區(qū)域的基因，該基因位于PCV2病毒DNA的反向互補連上，大概含有699～702個核苷酸序列，編碼病毒的唯一的功能結(jié)構(gòu)蛋白即Cap蛋白，其蛋白重量為27.8 Ku，作為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白也是中和抗體識別的主要抗原，可利用Cap蛋白研究病毒的致病性和免疫原性，也是研制疫苗與病毒血清學(xué)診斷的的靶向蛋白。

Khayat指出，Cap蛋白經(jīng)過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達后再純化，60個Cap蛋白質(zhì)可在體外自行組裝為一顆病毒樣顆粒（Virus-like Particle, VLP），并且可在電鏡下觀察到17～20nm之間的VLPs完整形態(tài)，其形態(tài)大小均與野生型病毒顆粒一致。Cap蛋白的這種特性有助于開發(fā)PCV2的亞單位疫苗與病毒快速檢測ELISA試劑盒。

1.2 Cap蛋白的氨基酸組成與結(jié)構(gòu)研究

Cap基因的結(jié)構(gòu)精簡，由233-234個氨基酸經(jīng)過正確折疊構(gòu)成一個Cap蛋白，一個Cap蛋白亞基包含了Loop BC,Loop CD,Loop DE，Loop EF，Loop FG，Loop GH,Loop HI等7個長短不一的loops結(jié)構(gòu)，還包括富含正電荷氨基酸的氮端在內(nèi)的8個β-strands。當(dāng)60個Cap蛋白組裝成capsid后可見，大部分的loops區(qū)域都位于核衣殼蛋白的表面，而大部分β-strands區(qū)域則被包裹在核衣殼內(nèi)部。

通過PCV1與PCV2兩種血清型的氨基酸序列比對可見，PCV1與PCV2在ORF1中同源性很高。與ORF1相反，兩者的氨基酸序列在ORF2中差異性很大，尤其是在各個loop區(qū)域，再結(jié)合PCV1與PCV2的Cap蛋白的3D結(jié)構(gòu)圖分析，同樣表明了PCV1與PCV2存在明顯的結(jié)構(gòu)差異，由于兩者在loop結(jié)構(gòu)上存在差異進而影響了Cap蛋白的組裝，所以也會在整個病毒的核衣殼蛋白表面產(chǎn)生明顯的差異?？梢娺@些loop結(jié)構(gòu)不僅對維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有著很大的作用還可能對病毒的組裝和免疫存在影響，然而我們對這些loops的具體作用機制和潛在功能還尚未研究透徹。

2 Capsid上五倍軸loops的主要作用

2.1 PCV1與PCV2在五倍軸的差異

PCV1與PCV2在病毒核衣殼表面五倍軸處存在很多不同，三段富有差異性的loops結(jié)構(gòu)在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)以及潛在功能上都有不同。首先，在氨基酸序列比對結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PCV的Loop BC區(qū)域都不存在負電荷氨基酸，且PCV1與PCV2的Loop BC區(qū)域存在很大的差異。據(jù)王乃東等報道，PCV1的Loop BC由8個氨基酸組成而PCV2由9個氨基酸組成，兩者間除了第58位的賴氨酸，以及第65位脯氨酸以及第66位的絲氨酸相同之外，59-64位的氨基酸殘基均不相同。通過蛋白質(zhì)3D模擬軟件預(yù)測兩者的構(gòu)像差異分析可見PCV1的Loop BC要較小和且平緩，Loop BC區(qū)域的組合圖也有明顯的非重疊區(qū)域。說明，PCV1與PCV2在Loop BC的氨基酸組成與蛋白構(gòu)象上都存在極大的差異，位于表面第一高峰的Loop BC也許參與中和抗體所識別的抗原表位構(gòu)成。

Loop HI位于Loop BC與Loop DE之間，由簡短的5個氨基酸殘基組成，但在PCV1與PCV2中存在很大的差異性，兩者在Loop DE中除了第204位的天冬氨酸一致外沒有相同的氨基酸，且天冬氨酸在PCV1與PCV2中都高度保守。值得注意的還有，PCV2中含有206-208位的IYD基團而PCV1沒有。由此可見，PCV2的Loop HI可能參與病毒的磷酸化以及有病毒入侵細胞過程中的作用。

5個Loop DE緊密相連組成了五倍軸的中心區(qū)域，PCV2的 Loop DE由 10個氨基酸殘基（108CSPITQGDRG117）組成且高度保守。與PCV2相比較，PCV1的Loop DE氨基酸組成存在可變氨基酸（108RDPITS(K/N)(E/Q)RG117），然而兩者在loop結(jié)構(gòu)表面上差異微小[3]，且PCV2中第108位的半胱氨酸是經(jīng)典的維持蛋白三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氨基酸，而PCV1中第108位卻是賴氨酸。在PCV1與PCV2中如此不同的Loop DE到底起到了什么作用尚未可知，2012年Wu等報道，PCV2 Cap蛋白質(zhì)中唯一半胱氨酸能參與亞基間二硫鍵的形成，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，位于Loop DE的半胱氨酸在PCV2 VLPs體外組裝和結(jié)構(gòu)維持中起到關(guān)鍵作用，從而推測PCV2中的Loop DE可能與病毒的組裝與解組裝有關(guān)。

2.2 Loop BC上潛在的抗原表位

據(jù)劉昌明、孟香金等報道，通過構(gòu)建突變體PCV2的感染性克隆來篩選構(gòu)成病毒空間構(gòu)像表位的關(guān)鍵氨基酸的實驗證實，Loop BC區(qū)域有2個正電荷氨基酸可被PCV2的單克隆抗體所識別，分別是第59位的賴氨酸，第60位的精氨酸。然而當(dāng)這三個氨基酸突變?yōu)闊o功能性氨基酸（丙氨酸）后，PCV2的拯救病毒便不可再被PCV2單克隆抗體識別，該實驗證明，Loop BC區(qū)域是病毒構(gòu)像表位的重要組成部分，且在突變后會影響病毒的感染力與免疫原性。

2.3 PCV2的capsid表面五倍軸loops的相互作用

Loop BC位于第58位至第66位氨基酸之間，Loop DE位于第108位至第117位氨基酸之間，Loop HI位于第204位至第208位氨基酸之間。通過分析Cap蛋白的空間構(gòu)象，雖然在線性距離上Loop BC，Loop HI與Loop DE三者相距較遠，但在Cap蛋白的空間構(gòu)象上三者卻距離相近甚至Loop DE第208位帶負電的天冬氨酸與Loop BC第58位的賴氨酸相互靠近。5個Loop BC，5個Loop DE與5個Loop HI組成了一個capsid的五倍軸，其中Loop BC位于衣殼蛋白表面最高峰鏈接Loop HI形成一個“王冠”形狀圍繞住Loop DE。所以在蛋白結(jié)構(gòu)上，這三個loops距離相近且有交叉相互作用。再者，楊毅等在2016年報道指出，在Loop BC與Loop HI之間存在多處磷酸化位點，一旦病毒進入體內(nèi)后被磷酸化極有可能發(fā)生病毒結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，從而可能會進一步參與病毒DNA的釋放。

3 展望

PCV1與PCV2兩者的同源性接近76%，大部分的差異存在于兩者的ORF2區(qū)域，兩者相對應(yīng)的Cap蛋白構(gòu)像存在明顯差異。PCV1不致病，但PCV2是一種強大的致病源且會造成世界養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失，所以，從病毒的基本蛋白結(jié)構(gòu)入手，分析對比PCV1與PCV2的Capsid中富有差異性的loop結(jié)構(gòu)，針對性的選取關(guān)鍵loops區(qū)域作為研究對象意義重大。綜上所述，對PCV2病毒Cap蛋白質(zhì)及其capsid結(jié)構(gòu)與功能的研究對于揭示PCV2的分子致病機理以及對PCV2疫苗的研究、設(shè)計和開發(fā)等都具有非常重要的科學(xué)和臨床意義。特別是通過比較PCV1和PCV2 Cap在基因組及蛋白質(zhì)組的差異，有望揭示PCV2相關(guān)疾病的分子致病機理?！?/p>

[1]Alarcon P,Rushton J,Wieland B.Cost of post-weaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus type-2 subclinical infection in England-an economic disease model[J].Prev Vet Med, 2013,110:88-102.

[2]Gilliland S M,Forrest L,Carre H,et al.Investigation of porcine circovirus contamination in human vaccines[J].Biologicals,2012,40: 270-277.

[3]Wang N,Zhan Y,Wang A,Zhang L,et al.In silico analysis of surfacestructurevariation ofPCV2 capsid resultingfrom loop mutations of its capsid protein (Cap)[J].J Gen Virol,2016,97(12): 3331-3344.

[4]Beach N M,Cordoba L,Kenney S P,et al.Productive infection of human hepatocellular carcinoma cells by porcine circovirus type 1[J]. Vaccine,2011,29:7303-7306.

[5]Arteaga-Troncoso G,Guerra-Infante F,Rosales-Montano L M,et al. Ultrastructural alterations in human blood leukocytes induced by porcine circovirus type 1 infection[J].Xenotransplantation,2005,12: 465-472.

[6]Segales J,Kekarainen T,Cortey M.The natural history of porcine circovirus type 2:from an inoffensive virus to a devastating swine disease?[J].Vet Microbiol,2013,165:13-20.

[7]Nawagitgul P,Morozov I,Bolin S R,et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].J Gen Virol,2000,81:2281-2287.

[8]Cheung A K.The essential and nonessential transcription units for viral protein synthesis and DNA replication of porcine circovirus type 2[J].Virology,2003,313:452-459.

[9]Khayat R,Brunn N,Speir JA,et al.The 2.3-angstrom structure of porcine circovirus 2[J].J Virol,2011,85:7856-7862.

[10]Liu LJ,Suzuki T,Tsunemitsu H,et al.Efficient production of type 2 porcine circovirus-like particles by a recombinant baculovirus[J]. Arch Virol,2008,153:2291-2295.

[11]Wu PC,Lin WL,Wu CM,et al.Characterization of porcine circovirus type 2 (PCV2)capsid particle assembly and its application to virus-like particle vaccine development[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,95:1501-1507.

[12]Jeong J,Park C,Choi K,et al.Comparison of three commercial one-dose porcine circovirus type 2 (PCV2)vaccines in a herd with concurrent circulation of PCV2b and mutant PCV2b[J].Vet Microbiol, 2015,177:43-52.

S852.65

A

1006-4907（2017）01-0046-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.01.021

2017-02-01

劉思遠（1992～），女，漢族，研究生在讀，515970802@qq.com。