高效液相色譜法檢測生鮮乳中三聚氰胺

林品言

（湖南省常德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，湖南常德415000）

高效液相色譜法檢測生鮮乳中三聚氰胺

林品言

（湖南省常德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，湖南常德415000）

文章建立了紫外檢測器—高效液相色譜法測定生鮮乳中三聚氰胺的方法。經(jīng)過陽離子交換固相萃取柱凈化后的樣品采用高效液相色譜法測定。采用C18色譜柱，以離子對試劑緩沖液—乙腈（85:15）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為240nm，柱溫為40℃。結(jié)果表明，三聚氰胺在1.0～100μg/mL的濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=82422x+64465，相關(guān)系數(shù)r為0.9997，回收率在91.7%～103.4%之間，方法檢出限為0.3mg/kg，方法的定量限約為1.0 mg/kg。該方法具有操作簡單，靈敏高，重復(fù)性好，回收率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于生鮮乳中三聚氰胺的分析測定。

生鮮乳；三聚氰胺；高效液相色譜法

三聚氰胺化學(xué)式為C3H6N6，俗稱密胺，蛋白精，它是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水?？扇苡诩状肌⒓兹?、乙酸等，不溶于丙酮、醚類、對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物[1]。然而由于三聚氰胺分子中含有大量的氮元素，而傳統(tǒng)的“凱氏定氮法”測食品中的蛋白質(zhì)含量時很難區(qū)分這類偽蛋白氮的存在，2008年國內(nèi)三鹿奶粉事件的曝光，均是由于違法添加三聚氰胺所致，給廣發(fā)人民群眾的健康造成了很大的危害，引起了社會各界對奶制品安全的關(guān)注。

目前食品中三聚氰胺的檢測方法主要有：高效液相色譜法[2]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[3～4]、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]以及電化學(xué)檢測法[8～9]等。本文采用高效液相色譜法紫外檢測器測定生鮮乳中三聚氰胺含量，操作步驟簡單，準(zhǔn)確度、靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；紫外檢測器；CP153C電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；GP-125BE干燥培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TG16K-II高速離心機(jī)：長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；摩爾原子超純水：上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；DL-01抽濾裝置；12道SPE固相萃取裝置；量筒；容量瓶；具塞離心管。

1.2 藥品與試劑

三聚氰胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1.00mg/mL）：北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈（色譜純）：上海安譜；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸（分析純）：湖南匯虹試劑有限公司；辛烷磺酸鈉（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1.3 溶液的配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：取三聚氰胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別用流動相稀釋成 1、10、25、50、100μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（使用時現(xiàn)配）。

離子對試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，用20g/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0后，定容至1L備用。

三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混合后備用。

氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；流動相：離子對試劑緩沖液:乙腈=85:15；檢測波長：240nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃。

取25μg/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，標(biāo)準(zhǔn)色譜如圖1所示。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖1中12.013min為三聚氰胺色譜峰，可以看出三聚氰胺有較好的分離，峰形尖銳，對稱性好。

1.5 樣品前處理

稱取2g（精確至0.01g）生鮮乳于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min，再振蕩提取10min，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL水混勻后做待凈化液。

用PCX陽離子交換固相萃取柱凈化：（1）活化及平衡：按順序加入3mL甲醇、3mL水。（2）上樣：加入待凈化液。（3）按順序加入3mL水、3mL甲醇，吹干，棄去流出液。（4）洗脫：加入6mL5%的氨化甲醇。收集洗脫液于離心管中，在50℃下用氮?dú)獯蹈伞埩粑镉? mL流動相定容，渦旋混合1min，測樣前過0.2μm微孔濾膜。供HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=82422x+64465，相關(guān)系數(shù) r為0.9997。結(jié)果表明，三聚氰胺在1.0～100μg/mL的濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。

圖2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，加入3個不同濃度的牛奶三聚氰胺測定添加回收率，對每個樣品重復(fù)測定3次，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出：最低回收率為91.7%，最高為103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤3.48%。

表1 生鮮乳中三聚氰胺的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3 靈敏度的測定

將適量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液添加到空白生鮮乳中，按1.5項的方法處理后進(jìn)行色譜分析，每組樣品平行測定5次，按3倍信噪比計算，方法檢出限為0.3mg/kg（方法的定量限約為1.0 mg/kg）。

2.4 樣品檢測結(jié)果

對常德地區(qū)的三個地區(qū)的9個生鮮乳樣用建立好的高效液相色譜法進(jìn)行檢測，測得結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，該9個生鮮乳中所含的三聚氰胺含量均符合國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

表2 生鮮乳中三聚氰胺的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用陽離子交換固相萃取凈化樣品，離子對試劑緩沖溶液：乙腈85:15為流動相的高效液相色譜-紫外檢測器檢測生鮮乳中三聚氰胺含量。該方法操作簡單、靈敏度和精密度高、檢測線性范圍寬，加標(biāo)回收率良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的生鮮乳三聚氰胺檢測的需要。□

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TS252.1

A

1006-4907（2017）01-0044-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.01.020

2017-01-12

林品言（1985～），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)樾笄菟a(chǎn)品檢測。