喹諾酮類耐藥福氏志賀菌的相關(guān)耐藥基因研究

張雯霞， 張 玨， 陳洪友， 屠麗紅， 陳 敏

·論著·

喹諾酮類耐藥福氏志賀菌的相關(guān)耐藥基因研究

張雯霞1， 張 玨1， 陳洪友2， 屠麗紅2， 陳 敏2

目的 了解2010－2014年上海市各區(qū)縣醫(yī)院139株福氏志賀菌的耐藥性，探討福氏志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。方法 用紙片擴(kuò)散法測定菌株對14種抗菌藥物的敏感性，用環(huán)丙沙星E試驗(yàn)條測定其最低抑菌濃度；采用PCR法檢測DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位（gyrA）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ C亞單位（parC）基因的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR），同時對質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶變異基因aac（6'） -Ib-cr進(jìn)行篩選。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序。結(jié)果 福氏志賀菌對氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸的耐藥率都達(dá)到了90 %以上，對環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到了40.3 %，同時有30.2 %菌株對頭孢吡肟產(chǎn)生了耐藥。gyrA和parC基因的突變率分別為98.6 %和97.8 %。gyrA基因存在Ser83、Asp87和His211 3個位點(diǎn)的突變，parC基因只檢測到Ser80 1個位點(diǎn)的突變；共檢測到9株qnrS和6株aac（6'） -Ib-cr喹諾酮耐藥質(zhì)粒。結(jié)論 上海地區(qū)福氏志賀菌耐藥情況嚴(yán)重。QRDR相關(guān)基因突變率高，Asp87的突變對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥起著主導(dǎo)作用，而耐藥質(zhì)粒起著重要的輔助作用。

志賀菌； 喹諾酮類； 耐藥基因

細(xì)菌性痢疾是全世界范圍內(nèi)流行的最常見的腹瀉性疾病之一，亞洲每年感染志賀菌的患者約

1.25 億例，死亡人數(shù)達(dá)1.4萬例[1]。合理的抗菌治療可有效減輕癥狀，降低并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險。氟喹諾酮類藥物一直是臨床治療細(xì)菌性痢疾的一線抗菌藥物。然而隨著此類藥物的廣泛應(yīng)用，志賀菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增加，特別是福氏志賀菌的耐藥情況更加嚴(yán)重。為了解福氏志賀菌的耐藥情況和對喹諾酮藥物的耐藥機(jī)制，本研究對2010―2014年從上海各區(qū)縣醫(yī)院臨床分離的139株福氏志賀菌進(jìn)行了抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，并對喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR）相關(guān)基因，即DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位（gyrA）、拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣC亞單位（parC）進(jìn)行檢測，對質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'） -Ib-cr進(jìn)行篩選。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集上海市各區(qū)縣醫(yī)院2010－2014年從門診腹瀉患者中分離得到139株福氏志賀菌，經(jīng)法國生物梅里埃VITEK2生化鑒定儀鑒定，并用日本Denka Seiken生研公司的志賀菌診斷血清進(jìn)行血清學(xué)確認(rèn)。PMQR基因PCR篩選的qnrA、qnrB、qnrS和aac （6'） -Ib-cr陽性對照株均由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所贈送。

1.1.2 儀器和試劑 藥敏紙片、MH瓊脂、E試驗(yàn)條購自英國OXOID公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司； TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、TaKaRa DL2000 DNA Maker、Agarose瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司；溴化乙錠（EB）購自美國Sigma公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器包括PCR基因擴(kuò)增儀（Bio-Rad DNA Engine Dyad）、脈沖場凝膠電泳儀（Bio-Rad CHEF Mapper）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad GEL Doc2000）。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗(yàn) 藥物敏感性試驗(yàn)采用改良的紙片擴(kuò)散法和最低抑菌濃度法?？咕幬锇ò逼S西林、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、阿莫西林-克拉維酸、氯霉素、頭孢西丁、萘啶酸、諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、磺胺復(fù)合物等14種。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，結(jié)果判斷參照2015年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增試驗(yàn) 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，PCR法檢測QRDR相關(guān)基因gyrA、parC和PMQR基因qnrA、qnrB、qnrS、aac（ 6'） -Ib-cr。引物序列長度及退火溫度見表1[3-8]，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 1 min，54～61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃，4 min。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染液染色，在紫外燈下觀察結(jié)果，且采用GEL Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像，出現(xiàn)與陽性對照相當(dāng)?shù)哪康臈l帶即判為陽性。

1.2.3 DNA測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物原液送上海邁浦生物科技有限公司雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在GenBank中經(jīng)BLAST進(jìn)行比對分析。gyrA、parC以福氏志賀菌F2a 301（GenBank中的參比號為AE005674）作為參比菌株。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)

139株福氏志賀菌對14種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示志賀菌的耐藥情況嚴(yán)重，對氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸的耐藥率在90 %以上，分別為94.2 %、95.0 %、93.5 %和98.6 %。對喹諾酮類抗菌藥物環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到了40.3 %，同時有30.2 %菌株對第四代頭孢菌素頭孢吡肟產(chǎn)生了耐藥，見表2。

2.2 QRDR相關(guān)基因的突變分析

139株福氏志賀菌中， 137株菌株發(fā)生了gyrA基因的突變，突變率達(dá)到了98.6 %；有136株菌株發(fā)生了parC基因的突變，突變率達(dá)到了97.8 %。gyrA基因檢測到Ser83、Asp87和His211這3個位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中Ser83→Leu位點(diǎn)突變的有137株，Asp87→Asn位點(diǎn)突變有48株，Asp87→Gly位點(diǎn)突變有15株，His211→Tyr位點(diǎn)突變有131株。ParC基因只檢測到Ser80這一個位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中有132株表現(xiàn)為Ser80→Ile位點(diǎn)突變，4株表現(xiàn)為Ser80→Arg的位點(diǎn)突變。

139株菌株中，僅有2株未檢測到QRDR任何氨基酸的突變，其環(huán)丙沙星的MIC分別為0.006和0.016 mg/L，見表3。發(fā)生氨基酸突變的137株福氏志賀菌中有136株呈現(xiàn)出gyrA和parC 2個亞基的同時突變，僅有1株只表現(xiàn)為gyrA基因的突變。其中有45株菌株有g(shù)yrA基因的Ser83、Asp87、His211 3個位點(diǎn)和parC基因Ser80位點(diǎn)的同時突變，占32.4 %，其環(huán)丙沙星的MIC為2～24 mg/L；最為普遍的是gyrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80這3個位點(diǎn)的突變，占50.4 %（70/139），其環(huán)丙沙星的MIC為0.19～32 mg/L。

56株環(huán)丙沙星耐藥的福氏志賀菌中，有44株表現(xiàn)為Ser83、Asp87、His211和Ser80這4個位點(diǎn)的同時突變，占81.5 %，而在環(huán)丙沙星敏感菌株中沒有出現(xiàn)4個位點(diǎn)的同時突變。64株環(huán)丙沙星敏感的福氏志賀菌中，有90.6 %的菌株表現(xiàn)為Ser83、His211和Ser80這3個位點(diǎn)的同時突變。所有環(huán)丙沙星敏感的菌株均未出現(xiàn)gyrA基因的Asp87位點(diǎn)的突變。

表1 喹諾酮類耐藥相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying the genes related to quinolone resistance

表2 139株福氏志賀菌對14種抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of 139 strains of Shigella f exneri to 14 antimicrobial agents（%）

表3 志賀菌QRDR氨基酸突變和喹諾酮類藥物耐藥性關(guān)系Table 3 Relationship of amino acid mutations in QRDR and resistance to quinolones

2.3 喹諾酮耐藥質(zhì)粒的鑒定

139株福氏志賀菌中，檢測到9株qnrS和6株aac （6'） -Ib-cr喹諾酮耐藥質(zhì)粒，分別占6.5 %和

4.3 %，見表4，未檢測到qnrA和qnrB基因。qnrS測序結(jié)果在NCBI GenBank上進(jìn)行同源性比對，其基因核苷酸序列均與注冊號為KP773319的qnrS1基因序列號同源性為100 %。攜帶有PMQR基因的菌株，其環(huán)丙沙星的MIC為0.5～32 mg/L，同時均伴有g(shù)yrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80這3個位點(diǎn)的突變，除了菌株SH12-13和SH12-33同時伴有g(shù)yrA基因的Ser83、Asp87、His211 3個位點(diǎn)和parC基因Ser80位點(diǎn)的突變。

3 討論

氟喹諾酮類一直是臨床治療細(xì)菌性痢疾的常用抗菌藥物，隨著氟喹諾酮類藥物在臨床以及農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的長期使用，其耐藥率近年來有明顯的上升趨勢。最近美國CDC通過對2014年5月到2015年2月的宋內(nèi)志賀菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到了87 %[9]。本研究顯示，福氏志賀菌對環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別達(dá)到了40.3 %、27.3 %和11.5 %。這就提示我們有必要對志賀菌進(jìn)行長期的耐藥監(jiān)測，以指導(dǎo)臨床進(jìn)行有效用藥。

氟喹諾酮類的耐藥主要是DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的QRDR發(fā)生突變所致[10-11]，通常在gyrA基因的Ser83和Asp87氨基酸殘基突變的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)生parC基因的Ser80和Glu84氨基酸殘基的替換才會導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對喹諾酮類藥物高水平耐藥[12]。本研究對139株福氏志賀菌的研究發(fā)現(xiàn)，所有菌株gyrA基因的83位絲氨酸都被亮氨酸所替換，并且同時存在其他位點(diǎn)的突變，除了SH10-35和SH14-1這2株未檢測到QRDR任何氨基酸的突變，其環(huán)丙沙星的MIC分別為0.006和0.016 mg/L。gyrA基因除了Ser83和Asp87這2個位點(diǎn)突變之外，同時檢測到His211這個位點(diǎn)的突變，其突變率達(dá)到了94.2 %（131/139）。His211→Tyr的氨基酸改變是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，烏拉圭于2014年在福氏志賀菌中最新檢測到這個位點(diǎn)的突變[13]，在國內(nèi)未曾有過報道?？梢姡虾５貐^(qū)福氏志賀菌在QRDR區(qū)氨基酸的突變率極高。

64株環(huán)丙沙星敏感菌株中，均未檢測到gyrA基因Asp87這個位點(diǎn)的突變；56株環(huán)丙沙星耐藥菌株中，只有9株未檢測到Asp87的突變?？梢夾sp87這個位點(diǎn)的突變對喹諾酮類的耐藥起著主導(dǎo)作用。首先是gyrA基因Ser83發(fā)生突變，如果聯(lián)合His211或/和parC基因Ser80的突變，菌株對于喹諾酮類的敏感率就會下降。一旦發(fā)生gyrA基因Asp87的突變就很有可能導(dǎo)致菌株對喹諾酮類的耐藥。之前的研究表明gyrA基因中Ser83和Asp87的雙重突變與福氏志賀菌對喹諾酮類的耐藥密切相關(guān)[14]，我們的結(jié)論與之相符。本研究中發(fā)現(xiàn)，64株環(huán)丙沙星敏感的福氏志賀菌中，有90.6 %的菌株表現(xiàn)為Ser83、His211和Ser80這3個位點(diǎn)的同時突變，如果再合并Asp87氨基酸的突變，那就會導(dǎo)致菌株對喹諾酮類的耐藥。

PMQR是近10年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌耐藥機(jī)制，耐藥質(zhì)粒是染色體之外，具有獨(dú)立自主遺傳功能的雙鏈DNA，通過接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座及整合等方式進(jìn)行水平傳播，并可編碼一種或多種抗菌藥物的耐藥性，從而傳播耐藥性。目前已報道的PMQR包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6'）-Ib-cr和qepA。其中攜帶qnr基因的喹諾酮耐藥質(zhì)粒在世界范圍流行。在杭州，15株喹諾酮耐藥的志賀菌中檢測到5株攜帶qnrS耐藥質(zhì)粒，2株攜帶aac（6'）-Ib-cr耐藥質(zhì)粒[10]。在安徽，53.8 %（14/26）志賀菌檢測到喹諾酮耐藥質(zhì)粒，其中qnrA1、qnrS1、qnrS2、aac（6'） -Ib-cr和qepA分別占30.8 %、11.5 %、3.8 %、19.2 %和11.5 %[15]。在河南，293株志賀菌中檢測到6株攜帶有qepA基因，19株攜帶有aac（6'）-Ib-cr基因，分別占2.05 %和6.48 %[3]。本研究中，139株福氏志賀菌中檢測到qnrS基因和aac（6'）-Ib-cr各9和6株，分別占6.5 %和4.3 %，未檢測到qnrA和qnrB基因?？梢?，攜帶有喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的志賀菌在中國存在的年代已久，因其能夠進(jìn)行水平傳播，故質(zhì)粒所介導(dǎo)的耐藥菌株在不斷的擴(kuò)散和蔓延。同時，PMQR基因?qū)θ旧w介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥起重要的輔助作用，使細(xì)菌更容易發(fā)生高水平的耐藥[16]。在本研究中，9株87位沒有氨基酸改變卻對環(huán)丙沙星耐藥的菌株中有7株攜帶有喹諾酮耐藥質(zhì)粒aac（6'）-Ib-cr或qnrS1，更加證實(shí)了這一結(jié)論。也有研究表明，在各耐藥質(zhì)粒中，qnrS基因在菌株的耐藥中起到主導(dǎo)作用[17-18]。我們的試驗(yàn)結(jié)果也與之相符：9株攜帶有qnrS耐藥質(zhì)粒的菌株其環(huán)丙沙星的MIC均要高于攜帶有aac（6'）-Ib-cr耐藥質(zhì)粒的菌株，除了有1株菌株SH10-48，其環(huán)丙沙星的MIC達(dá)到了32 mg/L，而其攜帶的是aac（6'）-Ib-cr耐藥質(zhì)粒，可能是這株菌株同時存在著其他耐藥機(jī)制，導(dǎo)致對喹諾酮類藥物的高度耐藥，值得我們進(jìn)一步去研究和探討。

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Genes conferring quinolone resistance in Shigella f exneri

ZHANG Wenxia, ZHANG Jue, CHEN Hongyou, TU Lihong, CHEN Min. （Department of Clinical Laboratry, Shanghai Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditionaly Chinese Medicine, Shanghai 201203, China）

Objective To investigate the antimicrobial resistance prof le of Shigella f exneri in Shanghai from 2010 to 2014 and examine the mechanism of f uoroquinolone resistance. Methods Kirby-Bauer method was used to determine the susceptibility of the S. f exneri strains to 14 antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ciprof oxacin was tested by E-test. Mutations within quinolone resistance determining regions (QRDR) of gyrA and parC and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes, qnrA, qnrB, qnrS and aac(6')-Ib-cr were identif ed by polymerase chain reaction (PCR). All the products were subjected to sequencing analysis. Results More than 90 % of the 139 S. f exneri isolates were resistant to ampicillin, streptomycin, tetracycline, and nalidixic acid, 40.3 % to ciprof oxacin and 30.2 % to cefepime, respectively. Genetic mutation of gyrA and parC was found in 98.6 % and 97.8 % of the strains, respectively. Three point mutations (Ser83, Asp87 and His211) were detected in gene gyrA and one point mutation (Ser80) was found in in gene parC. Plasmid-mediated resistant gene qnrS was found in 9 strains and aac(6')-Ib-cr in 6 strains. Conclusions The antibiotic resistance of S. f exneri is serious in Shanghai. The mutation rate within QRDR is high. Point mutation in Asp87 of gyrA is the main mechanism of quinolone resistance. The plasmid-mediated quinolone-resistant genes also play an important supplementary role.

Shigella; quinolone; resistant gene

R378.22

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0046-06

10.16718/j.1009-7708.2017.01.009

2016-01-15

2016-02-19

上海市公共衛(wèi)生重點(diǎn)學(xué)科衛(wèi)生微生物學(xué)（12GWZX 0801）。

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201203；2. 上海市疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌檢測實(shí)驗(yàn)室。

張雯霞（1981—），女，碩士，主管技師，主要從事腸道致病菌耐藥機(jī)制研究。

陳敏，E-mail：chenmin@scdc.sh.cn。