spo0A基因在艱難梭菌生長及芽孢形成中的作用

宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅

·論著·

spo0A基因在艱難梭菌生長及芽孢形成中的作用

宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅

目的 了解spo0A基因?qū)ζD難梭菌臨床分離株生長和芽孢產(chǎn)生的影響。方法 采用ClosTron敲除技術(shù)構(gòu)建艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因突變株，分光光度計檢測菌液濃度并繪制生長曲線，孔雀綠染色法計數(shù)芽孢和營養(yǎng)細胞。結(jié)果 艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因敲除突變株和敲除前親代株的48 h生長曲線無明顯差異，但突變株不再產(chǎn)生芽孢。結(jié)論 spo0A基因是艱難梭菌芽孢形成過程中的關(guān)鍵基因，但并非其生長過程中的主要基因。

艱難梭菌； 芽孢； spo0A基因； 生長曲線

艱難梭菌（Clostridium diff cile）為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫(yī)院獲得性腹瀉最主要的病原菌，約25 %～33 %抗生素相關(guān)性腹瀉以及90 %假膜性腸炎由艱難梭菌所致，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium diff cile infection， CDI）[1]。大多數(shù)的CDI發(fā)生在住院患者中，但近10年社區(qū)獲得CDI急劇上升，約占新發(fā)感染的1/3[2]。

芽孢是艱難梭菌在外界環(huán)境中的主要存在形式，也是艱難梭菌感染廣泛傳播的原因之一。DNA結(jié)合蛋白Spo0A是細胞從營養(yǎng)生長期進入芽孢形成時期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。對模式微生物枯草芽孢桿菌的研究表明，當(dāng)Spo0A的含量和磷酸化水平達到一定閾值后，芽孢形成才開始啟動[3-4]。有報道Spo0A在艱難梭菌持續(xù)感染和傳播中起重要作用[5-6]。本研究采用ClosTron技術(shù)構(gòu)建艱難梭菌spo0A基因突變株，對Spo0A在艱難梭菌臨床分離株生長和芽孢形成中的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 艱難梭菌臨床株C25分離自我院腹瀉患者糞便。經(jīng)鑒定該菌株為核糖體014型，產(chǎn)A毒素和B毒素。VPI10463為實驗室標準菌株，產(chǎn)A毒素和B毒素。大腸埃希菌感受態(tài)細胞HB101購自日本TaKaRa公司。pMTL007-E2質(zhì)粒為英國諾丁漢大學(xué)Nigel Minton惠贈。

1.1.2 主要試劑 Brucella瓊脂為美國BBL Microbiology system產(chǎn)品，蛋白胨-酵母基礎(chǔ)肉湯（TY肉湯）和SAB肉湯為英國OXOID公司產(chǎn)品。環(huán)絲氨酸、頭孢西丁等藥物購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。引物由DNA 2.0公司（美國）或上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TargeTron gene knockout system kit為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品?？兹妇G為中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。番紅染液為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建艱難梭菌spo0A基因突變株 在http：//www.clostron.com中選取合適的目的基因突變位點，生成IBS、EBS2、EBS1d、EBS Universal引物序列，由DNA2.0 公司合成上述引物序列并進行PCR，純化突變所需內(nèi)含子片段，按TargeTron gene knockout system kit說明書操作完成該內(nèi)含子片段與pMTL007-E2質(zhì)粒的重組。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coli HB101感受態(tài)細胞，氯霉素平皿篩選。將篩選后含有重組質(zhì)粒的大腸埃希菌與親代菌株混合培養(yǎng)進行接合實驗。用甲砜霉素-頭孢西丁-環(huán)絲氨酸平皿與紅霉素平皿篩選艱難梭菌接合子[5,7]。在含紅霉素的篩選平皿上隨機挑取6個接合子菌落，采用3對驗證引物進行PCR并測序。引物序列見表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and the corresponding oligonucleotide sequences in this study

1.2.2 繪制細菌生長曲線 純分后的艱難梭菌菌株在厭氧工作站中（Ruskinn，英國）37 ℃培養(yǎng)16 h后取1 mL菌液加入到150 mL預(yù)還原TY肉湯中，置于搖床上厭氧培養(yǎng)，記為0 h。前18 h中每隔3 h從厭氧培養(yǎng)TY肉湯中取樣3 mL，于紫外可見光分光光度計上測量D600值，之后于24 h、48 h取樣測量D600值，繪制生長曲線。

1.2.3 計算產(chǎn)芽孢率 分別于第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取上述菌液1 mL，離心3 000×g，10 min，留取沉淀，加入適量PBS和5 %孔雀綠水溶液等量混合，100℃加熱25 min，涂片，干燥，加熱固定，ddH2O沖洗玻片，直至流出的水無色為止，用0.5 %番紅溶液復(fù)染3 min，使用洗耳球吹去多余染液，吹干玻片。油鏡下芽孢呈綠色，菌體呈紅色。分別計數(shù)10個單獨的視野。產(chǎn)芽孢率= 芽孢數(shù)/（ 芽孢數(shù)+ 營養(yǎng)細胞數(shù)）×100 %。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌spo0Aspo0A突變株驗證

用Cd-spo0A-F1/Cd-spo0A-R1引物進行PCR后，瓊脂糖凝膠電泳顯示突變株擴增產(chǎn)物的長度較親代株長，測序結(jié)果證實該段序列中含有Ⅱ類內(nèi)含子。用ErmRAM-F/ErmRAM-R引物PCR后其測序結(jié)果證實了RAM片段在突變過程中發(fā)生重組。用插入序列一端引物EBS Universal和spo0A基因一端引物Cd-spo0A-R1進行PCR后結(jié)果則進一步證實了spo0A基因中有內(nèi)含子插入序列，突變株構(gòu)建成功，見圖1。

圖1 艱難梭菌spo0A突變株驗證Figure 1 PCR conf rmation of intron integration into spo0A gene

2.2 生長曲線

以實驗室標準菌株VPI10463為對照，可見VPI10463、C25與C25 spo0A突變株生長情況相似，在前9 h均處于指數(shù)生長期，12 h后進入穩(wěn)定生長期。各個時間點C25與C25 spo0A突變株菌液濃度也相仿，見圖2。

圖2 VPI10463， C25， C25 spo0A突變株生長曲線Figure 2 Growth curve of three Clostridium diff cile strains, VPI10463, C25 and C25 spo0A mutant

2.3 產(chǎn)芽孢率

VPI10463在48 h即開始有芽孢產(chǎn)生，產(chǎn)芽孢率0.3 %，而后隨時間增長產(chǎn)芽孢率增加。C25菌株在48 h開始有芽孢產(chǎn)生，產(chǎn)芽孢率0.1 %，而后隨時間增長產(chǎn)芽孢率亦增加。但C25 spo0A突變株至120 h均沒有芽孢產(chǎn)生，見圖3。

圖3 spo0A基因?qū)ρ挎弋a(chǎn)生的影響Figure 3 Effect of spo0A gene inactivation on sporulation capacity of C. diff cile

3 討論

艱難梭菌作為一種芽孢桿菌，可在惡劣的條件下產(chǎn)生芽孢，臨床上營養(yǎng)缺乏、抗生素暴露、消毒劑的使用均可能使之產(chǎn)生芽孢。因此芽孢是艱難梭菌傳播的主要形式，亦可能與艱難梭菌感染停藥后反復(fù)發(fā)作相關(guān)[8]。文獻報道歐美廣泛傳播的NAP1/BI/027菌株產(chǎn)芽孢能力明顯高于其他菌株，且該菌株感染更容易復(fù)發(fā)[9]。因此當(dāng)前很多研究者對艱難梭菌芽孢形成機制進行研究，以期為治療艱難梭菌感染提供新靶點和新思路。

Spo0A是近年來研究的熱點之一，其在營養(yǎng)細胞生長、芽孢產(chǎn)生、毒素分泌以及生物膜形成方面的作用均有報道[10]。但由于在艱難梭菌中基因敲除比較困難，因此基因功能研究明顯落后于其他病原菌，直至2007年Nigel Minton教授研發(fā)并共享ClosTron技術(shù)[11]。本課題組亦是在Nigel Minton惠贈關(guān)鍵質(zhì)粒后方成功敲除spo0A基因。

本研究發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除前后突變菌株與親代菌株的生長趨勢相仿，均在9 h后進入穩(wěn)定生長期，且各個生長階段吸光度值D600均相近，表明spo0A基因并非艱難梭菌C25菌株生長過程中的主要基因。雖Pettit等[6]研究顯示部分與細胞壁合成相關(guān)的基因也受Spo0A調(diào)控，但敲除spo0A基因?qū)τ谄D難梭菌營養(yǎng)細胞的生長并無明顯影響。

本研究中艱難梭菌臨床分離株C25和實驗室標準菌株VPI10463在TY肉湯中培養(yǎng)48 h即開始產(chǎn)生芽孢，之后隨著培養(yǎng)時間的延長產(chǎn)芽孢率明顯增加，但C25 spo0A突變株在整個研究階段均無芽孢產(chǎn)生，提示Spo0A是艱難梭菌芽孢產(chǎn)生的必要蛋白。這與其他研究者的結(jié)果相一致：Mackin等[12]、Underwood 等[7]和Deakin等[5]對spo0A基因敲除后的027、 078、630 Δerm的研究均發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除后突變株不產(chǎn)生芽孢。并且Deakin等[5]還發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除后突變株在小鼠中的傳播和持續(xù)感染均受到影響，可能與spo0A基因敲除后艱難梭菌芽孢產(chǎn)生障礙有關(guān)。

本研究的局限在于未進行spo0A基因回補試驗，且僅敲除核糖體型014菌株。今后將增加不同核糖體型別的研究菌株，特別是國內(nèi)主要的核糖體型017流行株；增加回補實驗及動物實驗，為了解Spo0A在艱難梭菌感染發(fā)病和傳播中的作用提供更多依據(jù)。

[1] LESSA FC， WINSTON LG， MCDONALD LC. Burden of Clostridium diff cile infection in the United States[J]. N Engl J Med，2015，372（24）：2369-2370.

[2] KHANNA S， PARDI DS， ARONSON SL， et al. The epidemiology of community-acquired Clostridium difficile infection： a population-based study[J]. Am J Gastroenterol，2012，107（1）：89-95.

[3] 孫靜，陳建華. 枯草芽孢桿菌形成芽孢時母細胞中基因表達的調(diào)控[J]. 生物技術(shù)，2007，17（3）：79-83.

[4] 劉燕，秦玉昌，潘寶海. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在芽孢形成過程中的幾個關(guān)鍵事件[J]. 生命科學(xué)，2005，17（4）：360-363.

[5] DEAKIN LJ， CLARE S， FAGAN RP， et al. The Clostridium diff cile spo0A gene is a persistence and transmission factor[J]. Infect Immun，2012，80（8）：2704-2711.

[6] PETTIT LJ， BROWNE HP， YU L， et al. Functional genomics reveals that Clostridium diff cile Spo0A coordinates sporulation，virulence and metabolism[J]. BMC Genomics，2014，15：160.

[7] UNDERWOOD S， GUAN S， VIJAYASUBHASH V， et al. Characterization of the sporulation initiation pathway of Clostridium difficile and its role in toxin production[J]. J Bacteriol，2009，191（23）：7296-7305.

[8] GERDING DN， JOHNSON S. Clostridium diff cile infection in 2010： advances in pathogenesis， diagnosis and management of CDI[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8（2）：67-68.

[9] MERRIGAN M， VENUGOPAL A， MALLOZZI M， et al. Human hypervirulent Clostridium difficile strains exhibit increased sporulation as well as robust toxin production[J]. J Bacteriol，2010，192（19）：4904-4911.

[10] PAREDES CJ， ALSAKER KV， PAPOUTSAKIS ET. A comparative genomic view of clostridial sporulation and physiology[J]. Nat Rev Microbiol，2005，3（12）：969-978.

[11] HEAP JT， CARTMAN ST， KUEHNE SA， et al. ClosTrontargeted mutagenesis[J]. Methods Mol Biol，2010，646：165-182.

[12] MACKIN KE， CARTER GP， HOWARTH P， et al. Spo0A differentially regulates toxin production in evolutionarily diverse strains of Clostridium diff cile[J]. PLoS One，2013，8（11）：e79666.

The role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile

SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile clinical isolates. Methods ClosTron gene knock-out system was used to knock out the spo0A gene of C. difficile strain C25. Bacterial growth curve was plotted by measuring D600with spectrophotometer in different phases of bacterial growth. Malachite green staining technique was used to count the number of vegetative cells and spores under optical microscope. The sporulation rate was calculated. Results The spo0A mutant and its C25 parental strain showed similar patterns of growth. However, after knock-out of spo0A gene, an asporogenous phenotype was built, while the parental strain could produce spores as usual. Conclusions The spo0A gene plays a key role in sporulation but not growth of C. diff cile strain.

Clostridium diff cile; sporulation; spo0A gene; growth curve

R378.8

A

1009-7708 ( 2017 )01-0033-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.006

2016-07-13

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金項目(30973594)。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

宋曉蕾（1988—），女，碩士研究生，主要從事感染性疾病的診斷治療。

陳軼堅，E-mail：chenyijian@fudan.edu.cn。