LAMP和Xpert Mtb/RIF早期診斷肺結(jié)核傳染源的價值比較

張偉陽，鐘建平，楊國彪，金法祥，許文芳，王華鈞

（紹興市立醫(yī)院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗科）

·臨 床 經(jīng) 驗·

LAMP和Xpert Mtb/RIF早期診斷肺結(jié)核傳染源的價值比較

張偉陽1，鐘建平1，楊國彪1，金法祥2，許文芳2，王華鈞1

（紹興市立醫(yī)院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗科）

目的：評價DNA環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）技術和Xpert Mtb/RIF早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核傳染源的臨床應用價值。方法：采用Xpert Mtb/RIF檢測試劑盒、MGIT液體培養(yǎng)和LAMP技術對肺結(jié)核300份痰液標本進行檢測，其中涂陽標本100例。結(jié)果：肺結(jié)核涂陽標本100例，LAMP技術檢測結(jié)核分枝桿菌（MTB），陽性96例，陽性率為96.0%，Xpert Mtb/RIF檢測MTB，陽性97例，陽性率為97.0%，涂陽標本2種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。涂陰標本200例，LAMP技術檢測MTB，陽性107例，陽性率為53.5%，Xpert Mtb/RIF檢測MTB，陽性50例，陽性率為25.0%，涂陰標本2種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論：在診斷肺結(jié)核涂陽標本時，LAMP技術與Xpert Mtb/RIF的敏感性相似；診斷涂陰標本時，LAMP技術優(yōu)于Xpert Mtb/RIF。

抗酸桿菌；結(jié)核分枝桿菌；核酸擴增技術；診斷

結(jié)核病嚴重危害人類健康。近10年來，由于艾滋病的流行、移民和流動人口的增加、耐多藥結(jié)核桿菌的增多，以及不少國家和地區(qū)對結(jié)核病控制的忽視等因素，全球結(jié)核病形勢急劇惡化[1]。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，早期發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核傳染源是預防和控制結(jié)核病傳播的重要措施之一。本研究采用DNA環(huán)介導恒溫擴增試驗（loopmediatedisothermalamplifyication，LAMP）技術及XpertMtb/RIF試劑盒對MTB進行檢測，并與MGIT液體培養(yǎng)法比較各檢測法的應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源標本均來自我院2014年住院診斷為肺結(jié)核病的患者（男195例，女105例，平均年齡43.7歲），每人送檢一份合格痰標本，共300份，其中涂陽標本100例，涂陰標本200例。

1.2 試劑與儀器LAMP試劑（廣州華峰生物科技有限公司），GeneXpertMtb/RIF檢測儀及試劑盒（美國Cepheid公司），顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），低溫高速離心機（美國ThermoFisherScientific公司），生物安全柜（美國Nuaire公司）。

1.3 分枝桿菌菌株14株非MTB（包括胞內(nèi)分枝桿菌5株、鳥分枝桿菌3株、膿腫分枝桿菌1株、瘰疬分枝桿菌1株、堪薩斯分枝桿菌2株、海分枝桿菌1株、偶發(fā)分枝桿菌1株），均為本院臨床分離株，通過DNA微陣列芯片法進行菌種鑒定；H37RvMTB標準株1株來自浙江省結(jié)核病防治研究所。

1.4 檢驗方法每份痰標本同時進行MGIT液體培養(yǎng)、XpertMtb/RIF檢測及LAMP技術檢測。

1.5 MGIT液體培養(yǎng)采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NALC-NaOH）處理中和離心法培養(yǎng)MTB。

1.6 LAMP技術

1.6.1 DNA制備：根據(jù)痰液標本量，加入2倍體積4%NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化30min；吸取1mL液化液加入無菌1.5mL離心管中，15000r/min離心5min，棄上清；沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用于模板提?。环謩e加入100μLDNA提取液I和0.25μLProteinaseK，56℃溫浴30min，再沸水浴10min；加入12.5μLDNA提取液I I，混勻，12000r/min離心5min，上清即為DNA模板。

1.6.2 核酸擴增：取出HF管于室溫解凍。向上述反應管內(nèi)按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL；置65℃恒溫反應60min。反應結(jié)束，將HF管倒置甩動2次，再正置甩動2次，使工作液與顯色液充分混合，冷卻至室溫后觀察。

1.6.3 結(jié)果判讀：待檢標本反應管液體呈綠色，結(jié)果為MTB陽性；待檢標本反應管液體呈橙色，則報告MTB檢驗結(jié)果為陰性。

1.7 Xpert Mtb/RIF檢測檢測試劑由美國Cepheid公司研發(fā)，PCR檢測所需的3個步驟（DNA提取、擴增和檢測）自動化，WHO于2010年批準了該法的應用，按試劑說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學處理方法率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP和Xpert Mtb/RIF檢測結(jié)果涂陽標本100例，LAMP檢測MTB陽性率為96.0%，XpertMtb/ RIF檢測MTB陽性率為97.0%，2種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.15，P＞0.05），見表1。

表1 涂陽標本檢測MTB結(jié)果

涂陰標本200例，LAMP檢測MTB陽性率為53.5%，XpertMtb/RIF檢測MTB陽性率為25.0%，2種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（χ2=34.1，P＜0.01），見表2。

表2 涂陰標本檢測MTB結(jié)果

涂陰標本200例，LAMP技術檢測MTB的陽性率與MGIT液體培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=42.2，P＜0.01）；XpertMtb/RIF檢測與MGIT液體培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.5，P＞0.05）。

2.2 非MTB檢測結(jié)果LAMP技術和XpertMtb/RIF檢測14株非MTB（胞內(nèi)分枝桿菌5株，鳥分枝桿菌3株，膿腫分枝桿菌1株，瘰疬分枝桿菌1株，堪薩斯分枝桿菌2株，海分枝桿菌1株，偶發(fā)分枝桿菌1株），結(jié)果均未檢出。XpertMtb/RIF檢測MTBH37Rv標準株，結(jié)果MTB陽性，利福平耐藥基因rpoB未檢測到突變結(jié)果，即對利福平敏感；LAMP技術檢測MTBH37Rv標準株，結(jié)果陽性。

2.3 LAMP技術檢測結(jié)果300例痰液標本，陽性203例，陽性率為67.7%，檢測結(jié)果肉眼判斷，沒有靶序列DNA的則為橙色，含有靶序列DNA管中有大量的LAMP擴增產(chǎn)物而顯綠色，結(jié)果觀察見圖1。

3 討論

圖1 LAMP技術檢測結(jié)果（綠色為陽性，橙色為陰性）

結(jié)核病細菌學檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)[2]。痰涂片染色法臨床中應用最普遍，但敏感性低，漏檢率較高，且無法區(qū)分MTB和非MTB，也不能確定菌體是活菌還是死菌。隨著分子生物學技術的發(fā)展，建立在核酸擴增基礎上的檢測法推動更多科學研究，全球已經(jīng)開發(fā)了多種新型的結(jié)核病實驗室診斷新技術，其中LAMP技術反應2h即可完成核酸擴增，通過目測可以得到清晰的結(jié)果，不需要長時間的循環(huán)溫度，不需要PCR等昂貴的儀器，僅需要一恒溫設備，檢測成本大大降低。XpertMtb/RIF是WHO推薦的一種全新的結(jié)核病快速檢測方法，其采用熒光定量核酸擴增技術，檢測MTB利福平耐藥基因rpoB的81bp耐藥核心區(qū)是否發(fā)生突變，從而判斷受檢菌株是否對利福平耐藥。該檢測系統(tǒng)所需試劑價格昂貴，在結(jié)核病高發(fā)的發(fā)展中國家，其廣泛應用還存在困難。本研究結(jié)果顯示，XpertMtb/RIF檢測陽性147例，陽性率為49.0%，LAMP檢測陽性率為67.7%，明顯高于MGIT液體培養(yǎng)法，這與國內(nèi)外文獻[3-6]報道基本一致。

綜上所述，在診斷肺結(jié)核涂陽標本時，LAMP技術與XpertMtb/RIF的敏感性相似；診斷肺結(jié)核涂陰標本，LAMP技術優(yōu)于XpertMtb/RIF，且具有試劑成本低的優(yōu)勢。LAMP技術檢測過程僅需2h，能早期診斷和鑒別診斷肺結(jié)核，預防非耐藥結(jié)核病進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幗Y(jié)核病，阻止和減少耐藥MTB在社區(qū)中的播散。因此，LAMP技術是一種簡便、快速、靈敏度高的結(jié)核分枝桿菌檢測技術。

[1] 金法祥, 王華鈞, 許文芳, 等. 4種新方法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2015, 25(21): 3638-3639.

[2] 戴廣明, 曹以誠, 杜正平, 等. 結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法的評價[J]. 中國防癆雜志, 2011, 33(1): 47-51.

[3] 金法祥, 王華鈞, 孫小軍. DNA環(huán)介導恒溫擴增試驗檢測結(jié)核分枝桿菌的研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志, 2011, 21 (12): 2639-2640.

[4] IWAMOTO T, SONOBE T, HAYASHI K. Loop-mediated isothermal amplification for direct of mycobacterium tuberculosis complex, M.avium, and M.intracellulare in sputum samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6)∶ 2616-2666.

[5] PANDEY B D, POUDEL A, YODA T, et al. Development of an in-house Loop-mediated isothermal amplifyication (LAMP) assay for detection of Mycobacterium tuberculosis and evaluateon in sputum samples of Neaplese patients[J]. J Med Microbiol, 2008, 57(4)∶ 439-443.

[6] LAIFANGBAM S, SINGH H L, SINGH N B, et al. A comparative study of fuorescent microscopy with Ziehl-Neelsen staining and culture for the diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. Kathmandu Univ Med J, 2009, 7(27)∶ 226-230.

（本文編輯：丁敏嬌）

Clinical application of LAMP and Xpert Mtb/RIF in early detection of pulmonary tuberculosis infection

ZHANG Weiyang1, ZHONG Jianping1, YANG Guobiao1, JIN Faxiang2, XU Wenfang2, WANG Huajun1. 1.Department of Infectious Diseases, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000; 2.Department of Clinical Laboratory, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000

Objective:To compare the clinical application of DNA loop mediated isothermal amplifcation (LAMP) technology and Xpert MTB/RIF in early detection of the infectious source of pulmonary tuberculosis.Methods:Three hundred TB sputum samples were detected using Xpert Mtb/RIF detection, MGIT liquid culture and LAMP technology, of which 100 cases of smear-positive specimens, 200 cases of smear-negative specimens.Results:In 100 cases of TB smear-positive specimens, the positive rate was 96.0% with LAMP technology, and the positive rate was 97.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＞0.05). In 200 cases of smear-negative specimens, the positive rate was 53.5% with LAMP technology, and the positive rate was 25.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＜0.01).Conclusion:In the diagnosis of smear positive specimens, the sensitivity of LAMP technology and Mtb RIF/Xpert was similar. In the diagnosis of smear negative specimens, LAMP technology is better than Mtb Xpert/RIF.

acid fast bacilli; mycobacterium tuberculosis; nucleic acid amplifcation techniques; diagnosis

R446.5

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.013

2016-05-31

紹興市衛(wèi)生計生科技計劃成果轉(zhuǎn)化項目（2016ZH003）。

張偉陽（1965-），男，浙江新昌人，主任醫(yī)師。

金法祥，主任技師，Email：sxjfx0575@126.com。