胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

孫養(yǎng)鵬 張志光

（中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510055）

·綜述·

胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

孫養(yǎng)鵬 張志光

（中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510055）

胚胎干細(xì)胞（ESCs）/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）因其有潛在成瘤性，制約了它的臨床應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)功能以及低免疫原性，且仍未發(fā)現(xiàn)它有成瘤性，因而成為干細(xì)胞治療頗具臨床應(yīng)用價(jià)值的種子細(xì)胞。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用合適的誘導(dǎo)方案可以從ESCs/iPSCs獲取MSCs，結(jié)合ESCs/iPSCs的無(wú)限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化將可能是獲取MSCs的一種數(shù)量充足且穩(wěn)定的新來(lái)源。本文將對(duì)目前ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的方法、機(jī)制以及新衍生的MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能、干性特征做一綜述。

胚胎干細(xì)胞；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）擁有無(wú)限的自我更新能力以及多胚層分化能力，可以在體外維持足量的細(xì)胞儲(chǔ)備。由于ESCs存在倫理爭(zhēng)論、免疫抑制以及潛在的成瘤性，限制了它在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)，來(lái)源于成體細(xì)胞的iPSCs擺脫了ESCs的倫理困境。同時(shí)，它擁有與ESCs相似的胚胎干細(xì)胞特性，使得其較ESCs具有更為優(yōu)越的臨床應(yīng)用前景。然而，其潛在的成瘤風(fēng)險(xiǎn)仍是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。研究表明，MSCs在移植的過(guò)程中具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)功能以及免疫耐受性[1]。MSCs能夠遷移到受損組織處，通過(guò)分泌細(xì)胞因子、化學(xué)因子以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白促進(jìn)組織損傷修復(fù)。且目前仍未有研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有成瘤性。因此，MSCs是干細(xì)胞治療頗具臨床應(yīng)用價(jià)值的種子細(xì)胞。MSCs存在于骨髓、脂肪組織、牙髓、滑膜、滑液以及肌肉等身體多處組織器官里。MSCs的獲取需選擇合適的供體，同時(shí)多數(shù)操作過(guò)程有創(chuàng)，且質(zhì)和量差異較大。因此，建立一種穩(wěn)定地、數(shù)量充足的MSCs獲取來(lái)源對(duì)于臨床應(yīng)用是必不可少的。

研究報(bào)道應(yīng)用合適的誘導(dǎo)方案可以從ESCs/ iPSCs獲取MSCs，ESCs/iPSCs的無(wú)限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化策略將可能是獲取臨床應(yīng)用級(jí)別MSCs的一種數(shù)量充足且穩(wěn)定的來(lái)源。目前，ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制不明，而且轉(zhuǎn)化方法較多，且轉(zhuǎn)化效率參差不齊，不同方法轉(zhuǎn)化而來(lái)的MSCs干細(xì)胞特征異質(zhì)性大。本文將對(duì)目前人ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的方法、分子機(jī)制以及新衍生的MSCs（ESCs/iPSCs-MSCs）的免疫功能特征，表型、分化潛能等干性特征做一綜述。

1 ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的方法

1.1 通過(guò)與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化：Trivedi等[2]將ESCs接種于鼠細(xì)胞OP9飼養(yǎng)層中共培養(yǎng)8天分離出了MSCs，同時(shí)在2周時(shí)利用CD34分選可獲得造血干細(xì)胞。

1.2 通過(guò)形成擬胚體再用低密度體外擴(kuò)增或者分選技術(shù)從擬胚體中分離出MSCs：Barbet等[3]先通過(guò)36天懸浮培養(yǎng)形成擬胚體，將擬胚體在纖原蛋白元包被板上貼壁培養(yǎng)4周，胰酶消化后，MSCs培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)于明膠包被板上，從而獲得MSCs。Villa-Diaz等[4]將ESCs懸浮培養(yǎng)7天，形成的擬胚體接種于明膠包被板，將貼壁細(xì)胞多次傳代培養(yǎng)后形成MSCs。Hong等[5]先將ESCs懸浮培養(yǎng)2天形成擬胚體，接種于多孔膜transwell上室，多孔膜允許帶有EMT標(biāo)志和MSCs標(biāo)志的細(xì)胞通過(guò)，從而獲得均一的MSCs。

1.3 引導(dǎo)ESCs/iPSCs克隆團(tuán)出現(xiàn)二維自然分化：通過(guò)低密度體外擴(kuò)增或者分選技術(shù)從分化細(xì)胞中分離出MSCs。Olivier等[6]通過(guò)機(jī)械分離胚胎干細(xì)胞克隆周圍分化細(xì)胞后，體外傳代培養(yǎng)，形成表皮樣細(xì)胞后，約50～180天再次進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)可獲得MSCs。Boyd等[7]應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM2-MV誘導(dǎo)ESCs分化，20～30天后將形成內(nèi)皮細(xì)胞后體外傳代2～3次可獲得MSCs。Gruenloh等[8]通過(guò)延長(zhǎng)ESCs培養(yǎng)基的更換時(shí)間誘導(dǎo)ESCs克隆分化，手動(dòng)挑去可見(jiàn)克隆團(tuán)，擴(kuò)增培養(yǎng)分化細(xì)胞，多次傳代培養(yǎng)后可獲得MSCs。Yen等[9]用MSCs培養(yǎng)基誘導(dǎo)ESCs分化增殖，應(yīng)用胰酶消化傳代，可獲得MSCs。Wang等[10]先將ESCs定向誘導(dǎo)成為滋養(yǎng)層細(xì)胞后，用重組酶TrypLE消化后傳代于明膠包被板，可形成MSCs。

1.4 聯(lián)合細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)單細(xì)胞狀ESCs/iPSCs發(fā)生轉(zhuǎn)化：Lai等[11]用胰酶將ESCs消化成單細(xì)胞后，接種于明膠包被板，在MSCs培養(yǎng)基中添加FGF2和PDGF AB或者添加FGF2和EGF，經(jīng)低密度傳代后可獲取均一的MSCs。Liu等[12]將ESCs和iPSCs用胰酶打散成單細(xì)胞后，接種于I型膠原包被板，用MSCs培養(yǎng)基添加維生素C、地塞米松和ROCK抑制劑Y-27632培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，胰酶消化傳代于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板，從而獲得MSCs。課題組[13]應(yīng)用胰酶將ESCs消化成單細(xì)胞后，接種于Matrigel包被板，MSCs培養(yǎng)基添加ROCK抑制劑Y-27632培養(yǎng)，胰酶多次消化傳代于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板，從而獲得MSCs。

1.5 單純細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)克隆團(tuán)塊狀ESCs/iPSCs發(fā)生轉(zhuǎn)化：Hynes等[14]先將iPSCs消化機(jī)械分離后，接種于明膠包被板，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)2周，重組酶TrypLE消化，按1：3傳代，第2代后，不用明膠包被板，傳至5～10代可形成均一MSCs。

1.6 單純添加細(xì)胞因子誘導(dǎo)單細(xì)胞狀ESCs/iPSCs發(fā)生轉(zhuǎn)化：Chen等[15]用擬胚體培養(yǎng)基添加TGF-β抑制劑SB431542誘導(dǎo)ESCs克隆分化，重組酶TrypleSelect消化成單細(xì)胞懸液，MSCs培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，可獲得MSCs。 1.7通過(guò)在ESCs/iPSCs中過(guò)表達(dá)基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化：Liu[16]等發(fā)現(xiàn)在ESCs過(guò)表達(dá)HOXB4，2周后可獲得36%CD73+MSCs，經(jīng)體外傳代3次后，可獲得均一的MSCs。

2 ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

目前，ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機(jī)制研究十有分有限。近期研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制IκB激酶（IKK）/NF-κB信號(hào)通號(hào)能抑制ESCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志，促進(jìn)其表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志，從而有效地促進(jìn)人ESCs向MSCs轉(zhuǎn)化。Chen等[15]報(bào)道抑制TGFβ/activin/nodal信號(hào)通路能促使ESCs向MSCs轉(zhuǎn)化。

3 ESCs/iPSCs-MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能

Wang等[10]研究中ESCs-MSCs能有效抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，與骨髓MSCs不同，IFNγ刺激不會(huì)上調(diào)其表達(dá)炎性介質(zhì)。同時(shí)，它還高表達(dá)免疫抑制配體PD-L1。研究發(fā)現(xiàn)iPSCs-MSCs通過(guò)旁分泌遷移抑制因子和生長(zhǎng)分化因子-15在蒽環(huán)霉素誘導(dǎo)的心肌病中起保護(hù)心肌作用。有報(bào)道iPSCs-MSCs能維持CD34+造血干細(xì)胞的自我更新和增殖能力，同時(shí)它能抑制CD4+細(xì)胞增殖，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中減少促炎因子的分泌，同時(shí)增加調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)ESCs-MSCs與BMMSCs相似，能抑制CD4+或者CD8+淋巴細(xì)胞增殖，但ESCs-MSCs抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解比BMMSCs強(qiáng)；同時(shí)它還能抑制NK細(xì)胞的毒性效應(yīng)，下調(diào)NK細(xì)胞激活受體NKp30和NKp46。

4 小結(jié)和展望

ESCs/iPSCs向MSCs轉(zhuǎn)化為臨床干細(xì)胞治療提供新的細(xì)胞來(lái)源。ESCs/iPSCs-MSCs細(xì)胞擁有與BMMSCs類似的免疫調(diào)節(jié)功能以及多向分化能力，同時(shí)無(wú)成瘤性，使得其在再生醫(yī)學(xué)中十分有前景。由于ESCs/iPSCs向MSCs的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)十分有限，目前ESCs/iPSCs向MSCs的方法呈多樣化且效率差參不齊，ESCs/iPSCs向MSCs的分子機(jī)制研究將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

［1］Nauta J，F(xiàn)ibbe WE.Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells［J］.Blood，2007，110（10）：3499-3506.

［2］Trivedi P，Hematti P.Simultaneous generation of CD34+ primitive hematopoietic cells and CD73+mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells cocultured with murine OP9 stromal cells［J］.Experimental hematology，2007，35（1）：146-154.

［3］Barbet R，Peiffer I，Hatzfeld A，et al.Comparison of gene expression in human embryonic stem cells，hESC drivedmesenchymal stem cells and human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Int，2011，2011：368192.

［4］Villa-diaz LG，Brown SE，Liu Y，et al.Derivation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells cultured on synthetic substrates［J］.Stem cells，2012，30（6）：1174-1181.

［5］Hong KS，Bae D，Choi Y，et al.A porous membrane mediated isolation of mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells［J］.Tissue Eng Part C Methods，2015，21（3）：322-329.

［6］Olivier EN，Rybicki AC，Bouhassira EE.Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells［J］.Stem cells，2006，24（8）：1914-122.

［7］Boyd NL，Robbins KR，Dhara SK，et al.Human embryonic stem cell-derived mesoderm-like epithelium transitions tomesenchymalprogenitorcells［J］.TissueEngineeringPart A，2009，15（8）：18971-907.

［8］Gruenloh W，Kambal A，Sondergaar D，et al.Characterization and in vivo testing of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells［J］.Tissue Engineering Part A，2011，17（11-12）：1517-1525.

［9］Yen ML，Hou CH，Peng KY，et al.Efficient derivation and concise gene expression profiling of human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitors（EMPs）［J］.Cell transplantation，2011，20（10）：1529-1545.

［10］Wang X，Lazorchak AS，Song L，et al.Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast-like stage［J］.Stem Cells，2016，34（2）：380-391.

［11］Lai RC，Choo A，Lim SK.Derivation and characterization of human ESC-derived mesenchymal stem cells［J］. Methods in Molecular Biology，2011，698（3）：141-150.

［12］Liu Y，Goldberg AJ，Dennis JE，et al.One-step derivation of mesenchymal stem cell（MSC）-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating［J］. PLoS One，2012，7（3）：e33225.

［13］Zheng YL，Sun YP，Zhang H，et al.Mesenchymal stem cells obtained from synovial fluid mesenchymal stem cell-derived induced pluripotent stem cells on a matrigel coating exhibited enhanced proliferation and differentiation potential［J］.PLoS One，2015，10（12）：e0144226.

Researching Advances in Embryonic Stem Cell/induced Pluripotent Stem Cell Transforming into Mesenchymal Stem Cells

Sun YangpengZhang Zhiguang
（Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China）

The application of embryonic stem cells（ESCs）/induced pluripotent stem cells（iPSCs）in clinical is limited because of its potential tumorigenicity.Mesenchymal stem cells（MSCs）possess multipotent differentiation capacity，immunoregulatory function and low immunogenicity.Furthermore，no tumorigenicity was observed so far.All the this make MSCs a promising cell source for cell based threapy in clinical application.Recent studies have found that MSCs could be obtained from ESCs/iPSCs through a suitable induction program.In addition，ESCs/iPSCs possess unlimited self-renewal capacity.Therefore，ESCs/iPSCs transforming to MSCs will likely be a promising，stable new cell source for obtaining sufficient MSCs.In This paper，we will present the programs about ESCs/iPSCs transforming to MSCs and the underlying mechanisms that were reported so far，meanwhile，the stemness characteristics and immunoregulatory function of these new MSCs were also reviewed.

Embryonic stem cells；Induced stem cells；Mesenchymal stem cells

R392

A學(xué)科分類代碼：32011

1001-8131（2017）03-0282-03

2016-10-08