光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物的代謝工程藍藻研究現(xiàn)狀

倪俊，陶飛，許平

上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240

光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物的代謝工程藍藻研究現(xiàn)狀

倪俊，陶飛，許平

上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240

許平，微生物代謝國家重點實驗室副主任，上海交通大學特聘教授，美國國家發(fā)明家科學院（NAI）院士，美國生物醫(yī)學工程院（AIMBE）會士。擔任SCI期刊如《Engineering in Life Sciences》編輯和《Scientific Reports》、《Process Biochemistry》、《Bioprocess and Biosystems Engineering》、《Biodegradation》等雜志的編委。近年主要從事環(huán)境與工業(yè)微生物技術的研究，在污染環(huán)境的生物修復天然食品添加劑發(fā)酵和生物催化生產(chǎn)技術等方面取得多項原創(chuàng)性的重要成果。E-mail：pingxu@sjtu.edu.cn

藍藻是植物天然產(chǎn)物光合生產(chǎn)的理想平臺，它們不僅具有遺傳背景簡單、營養(yǎng)需求低和高CO2固定效率等優(yōu)勢，還可以解決生物法制備天然產(chǎn)物所面臨的植物源酶適配性、還原力供應和對昂貴底物依賴等限制因素。介紹了近年來利用藍藻光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物及前體物質(zhì)的最新研究進展和發(fā)展趨勢，分析了藍藻生產(chǎn)天然產(chǎn)物的優(yōu)勢，為進一步開發(fā)天然產(chǎn)物的光合平臺提供指導，并對產(chǎn)業(yè)化發(fā)展方向進行了展望。

藍藻；植物天然產(chǎn)物；合成生物學；代謝工程；光合微生物

植物次生代謝物在其生長發(fā)育、環(huán)境適應、抵御病蟲害等方面發(fā)揮著重要作用，根據(jù)其合成路徑的差異，可以分為生物堿類、萜類、苯丙烷類。這些天然產(chǎn)物通常具有特殊生物活性，被廣泛應用于醫(yī)藥、輕化工、食品及農(nóng)藥等領域[1]。目前有75%抗感染性疾病藥物和超過60%的抗癌藥來源于天然產(chǎn)物或其類似物，這些天然產(chǎn)物大多屬于植物次生代謝物[2]。如紫杉醇是目前最有效的天然抗癌藥物之一，青蒿素是一種抗瘧疾藥。植物天然產(chǎn)物主要從天然植物中提取，但是由于種植面積有限、生長慢、化合物含量低和分子類似物多等限制，使得產(chǎn)量難以滿足市場需求[3]?；瘜W合成法產(chǎn)量較高，但副產(chǎn)物多導致分離相對困難，生產(chǎn)過程也會給環(huán)境帶來較大壓力[4]。同時，化學法獲得的天然產(chǎn)物通常價格較低，如合成香蘭素一般在15美元/千克左右，而天然香蘭素價格約比其高300倍[5]。

合成生物學和代謝工程是未來生物技術經(jīng)濟的主要推動力，為生物法制備天然產(chǎn)物帶來了新契機，其具有環(huán)境友好、生產(chǎn)周期短、易于工業(yè)化放大生產(chǎn)、產(chǎn)量相對較高、產(chǎn)物易于分離純化和不依賴于氣候、土地等諸多優(yōu)勢[6]。生物法制備植物天然產(chǎn)物通常依賴昂貴的前體物質(zhì)，較高底物成本限制了其應用。近年，在微生物中人工設計合成途徑，利用葡萄糖等廉價碳源合成植物天然產(chǎn)物已成為現(xiàn)實[7]。然而，植物源酶適配性、還原力和能量供應等限制因素的存在，使得生產(chǎn)效率并不高。同時，底物成本依然是生產(chǎn)成本不可忽視的部分。因此，盡管生物法制備香蘭素發(fā)展較快，但實現(xiàn)經(jīng)濟可持續(xù)的生產(chǎn)仍是巨大的挑戰(zhàn)，而光合微生物的引入為天然產(chǎn)物生產(chǎn)帶來了新契機。

1 藍藻是植物天然產(chǎn)物生產(chǎn)的理想宿主

光合微生物藍藻用于光合生產(chǎn)有許多優(yōu)勢，如細胞結構簡單、易于基因操作、生長速度較快、不受氣候和土地限制等[8]。尤為重要的是，藍藻具有較高的太陽能利用效率，比大多數(shù)微生物的營養(yǎng)需求低，僅需要太陽能、水、CO2、N和P等無機營養(yǎng)，不依賴于有機碳源[9]。這使得其得到廣泛的關注，并用于生產(chǎn)生物燃料和大宗化學品，如正丁醇、異丁醛、2,3-丁二醇、脂肪酸和異丙醇等[10]。

藍藻在生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物方面有著許多與生俱來的獨特優(yōu)勢。在植物天然產(chǎn)物的合成過程中，涉及到許多植物酶，其中細胞色素P450單加氧酶對苯丙烷類、生物堿類和萜類等天然產(chǎn)物的合成至關重要。然而，許多真核生物的 P450單加氧酶都是膜結合蛋白，難以在大腸桿菌等大多數(shù)原核微生物中異源表達，因為這類微生物缺少內(nèi)生的膜系統(tǒng)[11]。藍藻與大多數(shù)原核微生物不同，其細胞內(nèi)擁有類囊體膜系統(tǒng)，使得植物源P450單加氧酶可以功能性的表達。先前的研究也證實了這一點，Xue等[12]在藍藻Synechocystis sp. PCC6803中功能性表達了 擬南芥（Arabidopsis thaliana）P450對香豆酸-3-羥化酶，成功將對香豆酸轉(zhuǎn)化為咖啡酸。經(jīng)過免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)對香豆酸氫化酶定位于工程菌的類囊體。Ni等[13]在藍藻Synechococcus elongatus PCC7942中表達了相同的P450單加氧酶，利用分離出的類囊體測定了對香豆酸氫化酶的酶活，進一步確定了植物P450在藍藻中的功能性表達。值得注意的是，藍藻有許多代謝途徑與植物相近，在大多數(shù)藍藻基因組中也存在P450序列，如Synechocystis PCC6803中的cyp120A1/slr0574[14]，Anabaena sp. PCC7120中有6個P450基因[15]。此外，植物天然產(chǎn)物的合成通常需要消耗大量還原力和能量，而大腸桿菌等大多數(shù)微生物中還原力和能量不足以支撐這些天然產(chǎn)物的合成。但藍藻光合作用的效率要高于陸生植物，可以利用太陽能產(chǎn)生大量的ATP和NADPH，從而利用這些化學能和還原力推動許多天然產(chǎn)物的合成[16]。

2 利用藍藻生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物

基于合成生物學和代謝工程的理念，在光合微生物中可以設計和重構植物天然產(chǎn)物的合成途徑，已經(jīng)成功生產(chǎn)了多種植物天然產(chǎn)物及前體物質(zhì)（表1）。這些外源途徑通?；谒{藻的光合作用，與初級代謝相連接（圖1）。

2.1 萜類化合物

萜類化合物是異戊二烯（C10H16）的聚合體及其含氧的飽和程度不等的衍生物，是許多中草藥中的有效成分，同時也是化妝品和食品工業(yè)不可缺少的原料。其中，萜類的單體異戊二烯是重要的工業(yè)原料，可通過聚合合成橡膠、塑料以及萜烯類化合物[32]。Lindberg等[17]在藍藻 Synechocystis sp. PCC6803中表達了葛麻姆（Pueraria montana）中的 異戊二烯合酶基因（ ispS），成功獲得了異戊二烯，通過對ispS進行密碼子優(yōu)化和啟動子psbA2的使用，使得產(chǎn)率達到 2.1μg/[（g DCW）·h]。Bentley等[18]在 Synechocystis sp. PCC6803中表達了糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中甲羥戊酸途徑（MVA pathway）的7個基因，使碳流更多引向異戊二烯的前體異戊烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸酯（DMAPP）。異源表達異戊二烯合酶基因后，相比于僅含有自身非甲羥戊酸途徑（MEP pathway）的Synechocystis sp. PCC6803，MVA途徑的引入可以使得異戊二烯的光合產(chǎn)量提高約2.5倍。Gao等[19]將不同來源的異戊二烯合酶引入S. elongatus PCC7942，發(fā)現(xiàn)藍桉樹（Eucalyptus globulus）來源的ispS比其他來源的基因在藍藻中可溶性表達更好。隨后，他們利用動態(tài)代謝流分析揭示MEP途徑的瓶頸，構建了異戊二烯焦磷酸異構酶（IDI）和IspS融合酶并高表達了 1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因（dxs）和4-羥基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶基因（ispG），重組菌株可以在21d光合生產(chǎn)1.26g/L異戊二烯。檸檬烯是一種重要的萜類香料，并且具有顯著的生物活性，用途廣泛。Kiyota等[20]在Synechocystis sp. PCC6803中表達了荊芥（Schizonepeta tenuifolia）的 檸檬烯合酶基因（lms），重組菌株每天可以光合生產(chǎn)41μg/L檸檬烯。通過過表達MEP途徑中的dxs、crtE和ipi基因來增加檸檬烯合成的底物牻牛兒基焦磷酸（GPP）的供應，使得檸檬烯的光合產(chǎn)量提高了1.4倍。Halfmann等[21]在Anabaena sp. PCC7120中表達了北美云杉（Sitka spruce）的檸檬烯合酶基因，同時引入了DXP操縱單元（dxs-ipphp-gpps）來高表達MEP途徑的限速酶，重組菌株的檸檬烯產(chǎn)率可達到3.6μg/（L·O.D.·h） 左右。Davies等[22]在Synechococcus sp. PCC 7002中表達了留蘭香（Mentha spicata）的檸檬烯合酶基因或者巨冷杉（Abies grandis）的α- 紅沒藥烯合酶基因（bis），分別可以得到4mg/L的 檸檬烯和0.6mg/L的 紅沒藥烯，生產(chǎn)過程中，十二烷膜的使用可能會解除反饋抑制，使得檸檬烯和紅沒藥烯的產(chǎn)量進一步提高。Bentley等[23]在Synechocystis sp. PCC6803中表達密碼子優(yōu)化后的薰衣草（Lavandula angustifolia）β-水芹烯合酶基因，重組菌可以光合合成133mg/g DCW水芹烯。Formighieri等[24]將β-水芹烯合酶與占細胞內(nèi)總蛋白20%的藻青蛋白β亞基在Synechocystis sp. PCC6803中進行融合表達，同時引入甲羥戊酸途徑和牻牛兒基焦磷酸合酶，使得進入萜類合成途徑的碳流增加，重組菌可以在48h內(nèi)光合生產(chǎn)10mg/g DCW水芹烯。Reinsvold等[25]將青蒿（Artemisia annua）的β-石竹烯合酶基因在Synechocystis sp. PCC6803中表達，光合合成了約4mg/g DCW的石竹烯。Halfmann等[26]在Anabaena sp. PCC7120中表達了密碼子優(yōu)化的法呢烯合酶基因，光合生產(chǎn)了法呢烯，產(chǎn)率達到（69.1±1.8）μg/（L·O.D.·d）。Kudoh等[27]在Synechocystis sp. PCC6803中過表達了1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因，使得多烯色素類胡蘿卜素的含量比野生型菌株提高了1.5倍。

表1 基因工程藍藻生產(chǎn)的植物天然產(chǎn)物

圖1 藍藻中重構植物天然產(chǎn)物合成途徑

2.2 苯丙烷類化合物

苯丙烷類化合物及其衍生物涵蓋了植物中多數(shù)的天然芳香族化合物，這類化合物可以廣泛用于藥物、保健品、調(diào)味劑、香料和激素等[33]。Xue等[12]在藍藻Synechocystis sp. PCC6803中表達了擬南芥的對香豆酸氫化酶基因（ref8），將對香豆酸轉(zhuǎn)化為7.2mg/L的咖啡酸，證實藍藻可以功能性表達植物P450單加氧酶，適于合成其他微生物難以生產(chǎn)的植物天然產(chǎn)物。Xue等[28]在Synechocystis sp. PCC6803表達了西班牙糖絲菌（Saccharothrix espanaensis）的酪氨酸解氨酶基因（sam8），使得藍藻初級代謝的酪氨酸進入苯丙烷類合成途徑，得到大量對香豆酸脫羧產(chǎn)物4-乙烯基苯酚的聚合物，在對藍藻自身的漆酶基因（slr1573）進行敲除后，重組菌株在添加葡萄糖的情況下成功合成82.6mg/L的對香豆酸。Ni等[13]的研究表明大多數(shù)苯丙烷類物質(zhì)可以在藍藻中順利合成，他們在S. elongatus PCC7942中表達比較了不同來源酪氨酸解氨酶的活性，同時，引入解反饋的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因（aroGfbr），使得碳流更多進入芳香化合物的合成，在不添加有機碳源的情況下，重組菌株可以在12d內(nèi)光合合成128.2mg/L的對香豆酸。擬南芥中對香豆酸-3-羥化酶的編碼基因（ref8）和咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因（comt）的依次引入，使得重組菌可以分別光合合成4.7mg/L咖啡酸和6.3mg/L阿魏酸。隨后，歐芹（Petroselinum crispum）中對香豆酰輔酶A連接酶基因（4cl）分別與矮牽牛（Petunia hybrida）中查耳酮合酶基因（chs）、落花生（Arachis hypogaea）中芪合酶基因（sts）和水稻（Oryza sativa）中姜黃素合酶基因（cus）進行融合表達，并分別引入對香豆酸生產(chǎn)菌株，光合合成了柚皮素、白藜蘆醇和雙去甲氧基姜黃素；淺藍菌素可以抑制脂肪酸的合成，從而增加這些苯丙烷類合成所需丙二酰CoA的供給，使得柚 皮素、白藜蘆醇和雙去甲氧基姜黃素產(chǎn)量分別達到4.6mg/L，7.1mg/L和4.1mg/L。

2.3 其他天然產(chǎn)物

除了萜類和苯丙烷類化合物，藍藻還用作光合合成其他多種植物天然產(chǎn)物。Takahama等[29]在S. elongatus PCC7942表達了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）中的乙烯形成酶基因（efe），光 合合成了約512μg/（L·O.D.·h）的乙烯。Jindou等[30]利用嗜熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum）和解纖維醋弧菌（Acetivibrio cellulolyticus）中的黏合錨定蛋白將番茄（Solanum lycopersicum）中的兩個乙烯形成酶進行連接，并在S. elongatus PCC7942中進行表達，光合合成約3.9μg/（L·O.D.·h）的乙烯。J acobsen等[31]在Synechococcus sp. PCC7002中表達了大腸桿菌的磷酸甘露醇脫氫酶基因（mtlD）和艾美球蟲（Eimeria tenella）的甘露醇磷酸酶基因（mlp），每天可以光合生產(chǎn)0.15g/L的甘露醇。將糖原合成途徑失活后，甘露醇的產(chǎn)量可以提高3.2倍。Dong等[34]在Synechococcus sp. PCC7002中表達了S ynechocystis sp. PCC6803中的Δ15去飽和酶和Δ6去飽和酶，當表達Δ15去飽和酶時，α-亞麻酸的量比野生型提高了5.4倍；表達Δ6去飽和酶時，重組菌可以同時光合合成γ-亞麻酸（GLA）和亞麻油酸（SDA）；共表達Δ15去飽和酶和Δ6去飽和酶可以使得亞麻油酸的量占到總脂肪酸量的11.64%。

3 適于植物天然產(chǎn)物光合生產(chǎn)的定向改造

許多藍藻已經(jīng)可以進行外源基因表達，成功光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物，以下介紹藍藻生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物時，值得考慮的幾點因素。糖原是藍藻中碳的主要儲存形式，當藍藻在缺氮培養(yǎng)時，糖原可占細胞干重的60%[35]。因此，將糖原合成途徑阻斷，可以使得碳更多流向產(chǎn)物合成。如Jacobsen等[31]在Synechococcus sp. PCC7002中表達了甘露醇的合成途徑，使得甘露醇達到細胞干重的10%，當阻斷糖原合成途徑時，甘露醇的量提高到細胞干重的32%。漆酶存在于許多物種，可以將多種酚類化合物氧化為不穩(wěn)定的自由基，發(fā)生水合、聚合和歧化等非酶促反應[36]。盡管關于藍藻中漆酶功能的研究較少，但這些酶可能會對苯丙烷類物質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。如Xue等[28]對Synechocystis sp. PCC6803中潛在的漆酶基因slr1573進行了敲除，使得含有酪氨酸解氨酶基因的重組菌株對香豆酸的產(chǎn)量提高了25倍。光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物時，重組藍藻的穩(wěn)定性也應該加以考慮，有一些研究表明重組藍藻并不穩(wěn)定。Takahama等[29]在生產(chǎn)乙烯的重組S. elongatus PCC7942中發(fā)現(xiàn)乙烯合酶基因中的重復序列被截短，使得基因失去功能。Kusakabe等[37]在S. elongatus PCC7942中表達了丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）和大腸桿菌中異丙醇合成的4個基因，他們重復發(fā)現(xiàn)atoD基因發(fā)生突變，導致酶活降低。天然產(chǎn)物的生產(chǎn)過程通常需要涉及P450單加氧酶，這類酶需要還原力的驅(qū)動，可以將這些酶與電子傳遞鏈相連接，以提高效率。Lassen等[38]對高粱（Sorghum bicolor）P450單加氧酶CYP79A1進行了研究，他們將CYP79A1的催化區(qū)域與Synechococcus sp. PCC 7002的光合體系I亞單元相連接，錨定至類囊體，光合電子傳遞鏈推動了酶促反應的進行，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為羥基苯乙醛肟。

4 展 望

藍藻作為合成生物學的底盤具有一系列良好的特質(zhì)，已經(jīng)用于合成生物燃料和大宗化學品[39-40]。然而，由于這類物質(zhì)低廉的價格，使得相關技術的工業(yè)化進展緩慢。歐洲藻類生物質(zhì)協(xié)會預計，藻類生物燃料從實驗室走向工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)還需要10～15年的時間。植物天然產(chǎn)物的相對經(jīng)濟價值通常遠遠高于生物燃料等化學品，光合生產(chǎn)高值植物天然產(chǎn)物可以避免成本高而難于商業(yè)化應用的問題[41]。近年來，藍藻光合生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物已經(jīng)獲得了令人振奮的進展，然而，藍藻光合效率的優(yōu)化和合成產(chǎn)物的外排等方面仍需要進一步研究。同時，功能基因組學、代謝模型構建等系統(tǒng)生物學手段也有助于藍藻代謝網(wǎng)絡的改造。隨著合成生物學和代謝工程的不斷發(fā)展，藍藻可以更加高效地合成價值高昂的植物天然產(chǎn)物，人類對于健康和環(huán)境的日益關注會使得相關研究走向大規(guī)模工業(yè)化應用，這也將為生物燃料和大宗化學品的規(guī)?；咝a(chǎn)奠定基礎。

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Photosynthetic production of plant natural products in genetically engineered cyanobacteria

NI Jun，TAO Fei，XU Ping

School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Cyanobacteria are photosynthetic microorganisms that have several advantages for producing plant natural products, such as simple input requirement, high solar conversion eff ciency, and being tractable for genetic engineering. Moreover, they can solve some limitations in biosynthesis of plant natural products, such as diff cult to express plant enzymes, require the addition of organic carbon feedstocks, and an inadequate supply of NADPH. The research progresses and development trend of the photosynthetic production of plant natural products are introduced. The review analyses the advantages of photosynthetic production of plant natural products in genetically engineered cyanobacteria, and supplies guidance for biosynthesis of natural products. Future developments of industrialization in photosynthetic production of plant natural products are prospected.

cyanobacteria; plant natural products; synthetic biology; metabolic engineering; photosynthetic microbe

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.008

倪俊，微生物學博士，上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室博士后。主要從事高值植物天然產(chǎn)物微生物發(fā)酵和光合生產(chǎn)的研究。E-mail：tearroad@sjtu.edu.cn