酸性紅壤中熱研2號柱花草高效固氮根瘤菌的篩選

盧外強， 吳金山

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院, 海南 儋州 571737)

酸性紅壤中熱研2號柱花草高效固氮根瘤菌的篩選

盧外強， 吳金山*

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院, 海南 儋州 571737)

為篩選酸性紅壤中適合熱研2號柱花草的高效固氮根瘤菌菌株，在土培中將19個根瘤菌菌株分別接種到熱研2號柱花草，通過株高、莖葉干重、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標確定酸性紅壤中接種不同根瘤菌對柱花草的影響，并通過主成分分析確定酸性紅壤中與熱研2號柱花草搭配的高效根瘤菌菌株.結(jié)果表明：酸性紅壤中與熱研2號柱花草匹配的高效菌株為RJS9-1、BS2-2、 ZJ2-2、FS3-1-1、RJS9-2及BS1-1；接種后不利于柱花草生長的菌株為LY1、NN1-1-2及SM5-1.本實驗結(jié)果為實際生產(chǎn)中通過接種氮高效根瘤菌提高柱花草產(chǎn)量提供了一定參考.

酸性紅壤； 熱研2號柱花草； 根瘤菌； 高效固氮； 篩選

柱花草Stylosanthesguianensis(Aublet) Swartz原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，是豆科(Fabaceae)柱花草屬多年生草本植物，在世界熱帶和亞熱帶地區(qū)均有分布.自1962年引進入我國后，經(jīng)試種篩選出熱研2號柱花草(Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.2)，于1991年通過全國草品種審定委員會審定[1]，熱研2號柱花草具備眾多很優(yōu)點，如易種植、土壤條件要求不高，粗蛋白含量豐富和粗脂肪含量高、營養(yǎng)價值全面等[2]，作為優(yōu)良的養(yǎng)殖草料，廣泛應用于我國南方地區(qū)畜[3-4]、禽[5-6]、魚[7-8]等農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖中.熱研2號柱花草為多年生草本植物，其本身具有耐旱，喜高溫高濕等特點.在水源充足時，枝葉生長速度快，并向四周擴散，而且根系發(fā)達，并附著生長大量的根瘤菌[9].其根瘤菌具有很強的固氮能力[10]，為植株的生長提供大量的氮肥，在生產(chǎn)中經(jīng)常被作為純天然的有機肥料[11]、也被用作植物間作[12]、改善土壤特質(zhì)[13]，以防止大自然水土流失等用途[2].柱花草在我國的廣東、海南、廣西等省份等都有種植，但這些地區(qū)土壤多數(shù)為酸性，其土壤中含有大量限制植物與根瘤菌生長的物質(zhì)，如大量的鈣、錳、鋁等元素都會對植物和根瘤菌的生長帶來危害[14].根瘤形成的過程與土壤中的根瘤菌的作用密不可分，根瘤菌通過與豆科植物進行密切結(jié)合，產(chǎn)生一系列作用，最終形成了根瘤.而環(huán)境因素是影響根瘤菌與寄主共生固氮的重要因素.因此只有生命力強且具備良好固氮能力的豆科植物并且與當?shù)赝寥老噙m應，根瘤菌與其共生體建立的共生關(guān)系才能體現(xiàn)出它本身特有的功能和作用[15].李友國等[16]通過實驗發(fā)現(xiàn)，根瘤菌的固氮效率高低與土壤中的根瘤菌特性以及植物體本身的遺傳基因有重要關(guān)系，同時也受到其周圍的環(huán)境條件多方面影響.陳文新等[15]通過實驗研究最后提出過一個觀點，在根瘤菌和植株共生關(guān)系中，只有找到對環(huán)境適應性能力最強的菌株，才能發(fā)揮出根瘤共生體的最大作用.本實驗主要在沙培篩選出高效菌株的基礎(chǔ)上，通過土壤栽培等方法進一步篩選適合于我國南方酸性紅壤條件下熱研2號柱花草的高效共生菌株，以期為根瘤菌菌劑的制備和熱研2號柱花草的高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試品種及菌株 本研究選用的柱花草來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心選育主推品種熱研2號.供試菌株選擇參考文獻[17]，其來源如表1.

供試土壤來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶牧草研究中心基地，本基地以前從未種植過柱花草，而且基地土壤為磚紅壤類型.在土壤采集過程，除去表面土壤3 cm，然后取30 cm厚的土層，并將土壤在容器中充分混勻，用50 mm篩孔過篩.

1.1.2供試土壤 通過實驗測定，供試土壤主要成分基本情況如下：有效磷和有效氮的含量分別為8.29 mg·kg-1和45.75 mg·kg-1.pH值為5.04，偏酸性.全磷和全氮分別為0.42 g·kg-1，1.31 g·kg-1，有機質(zhì)為9.98 g·kg-1.

1.2方法

1.2.1無菌種子的準備 將柱花草種子從種皮中取出，80℃水浴，5 min；95%乙醇(體積分數(shù)，下同)浸泡5 min后，2 g·L-1HgCl2浸泡3 min (已滅菌)；無菌水清洗5次，將種子放置于鋪好發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿里，于紙上噴灑50 μmol·L-1無菌CaSO4溶液，蓋好培養(yǎng)皿；最后放置暗光處使其發(fā)芽.

1.2.2根瘤菌提取及菌液的處理 本實驗采用酵母甘露糖瓊脂(YMA)培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，固體、液體培養(yǎng)基制備好后于超凈臺中靜置2 d，確定無細菌污染情況后，將各菌株接種至固體培養(yǎng)基上活化5 d后，將生長出的菌落接種于液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)(180 r·min-1)至對數(shù)期(OD600>0.9).

1.2.3土培系統(tǒng)的制備 用10 mL·L-1的鹽酸將實驗用花盆(9 cm×28 cm)浸泡過夜，ddH2O沖洗3次后浸泡30 min，晾干備用.將1.1.2中的土壤裝入無菌花盆中(2.5 kg/盆).

1.2.4移苗、接種及管理 移植于土培系統(tǒng)中的柱花草幼苗，必須是無菌感染且需在對應菌液中浸泡15 min.移植(4株/盆)后在幼苗根部噴灑5 mL菌液，置于適宜環(huán)境中生長，每周補充1次低氮營養(yǎng)液.若土壤表面干燥，則補充澆灌無菌水，水量為田間持水量1/2.

1.2.5實驗設(shè)計及方法 本實驗選用雙因子隨機區(qū)組安排，分散為不同菌株處理(20份菌株和1個不接菌對照處理)和2個不同柱花草品種，該試驗設(shè)4次重復，樣本總數(shù)為2×21×4=168盆.

1.2.6取樣及各指標水平的檢測 栽植105 d后進行取樣測定.土壤上部樣品干燥后用作氮、磷含量的測定；將所取樣品混勻搗碎，于H2SO4-H2O2溶液中消煮，全磷的測定使用鉬銻抗比色法，全氮的測定使用自動定氮儀(Kjedahl 2300，F(xiàn)OSS，瑞士).對柱花草進行株高測定后取莖葉稱量鮮重，裝袋；于105℃烘箱中進行殺青20 min后，75℃烘干，稱干重.

1.3數(shù)據(jù)處理

本實驗中數(shù)據(jù)采用JMP9、Microsoft Excel 2000、SAS9.0等軟件進行統(tǒng)計處理和方差分析，采用Tukey HSD作為顯著性差異衡量標準，顯著性水平P<0.01.通過IBM SPSS Statistics 19軟件進行因子分析，以最大方差法進行方差正交旋轉(zhuǎn).

2結(jié)果與分析

2.1不同根瘤菌菌株對熱研2號柱花草株高的影響

熱研2號柱花草在酸性紅壤中接種根瘤菌菌株后，不同菌株間株高差異極(F=9.34**，見表2).菌株BS2-3接種后的熱研2號柱花草株高值最大，為42.73 cm，對照株的株高值最小.接種菌株CM2、PS2-1、PS5-1、DF4-2、RJS9-2、PN13-3、DH3-1、FS3-1-1、RJS9-1、BS1-1及ZJ2-2的柱花草株高也較高，且與接種菌株BS2-3的柱花草無顯著差異.

2.2不同根瘤菌菌株對熱研2號柱花草干重的影響

熱研2號柱花草接種根瘤菌菌株后，植株失水后的質(zhì)量在各菌株間差異也極為顯著(F=4.72**，見表2).其中，干重值最大的為接種菌株BS2-3的柱花草植株(2.16 g)，干重值最小為不接種菌株的植株(0.59 g).除接種菌株SM5-1、PS5-1及LY1與不接種菌株莖葉干重差異不顯著外，接種其他菌株的植株莖葉干重都較高，且與接種BS2-3的植株差異不顯著.

2.3不同根瘤菌菌株對熱研2號柱花草莖葉氮含量的影響

根瘤菌菌株接種熱研2號柱花草后，莖葉含氮量在菌株間差別達到顯著水平(F=3.21*，見表2).接種菌株BS2-3莖葉含氮量最高，為23.19 mg·g-1；不接種菌株的植株含氮量最低，為6.64 mg·g-1；除接種菌株DH3-1與不接種菌株莖葉干重含氮量差異不顯著外，其他接種菌株莖葉鮮重含氮量都較高，與接種BS2-3差異不顯著.

2.4不同根瘤菌菌株對熱研2號柱花草莖葉磷含量的影響

20株根瘤菌菌株接種熱研2號柱花草以后，經(jīng)過測定莖、葉的含磷量在菌株間差別達到顯著水平(F=3.40*，見表2).接種菌株P(guān)S2-1后的植株莖葉含磷量最高(5.20 mg·g-1).不接種菌株的植株含磷量最低(1.95 mg·g-1)，顯著低于BS2-3、ZJ2-2、FS3-1-1 及PN13-3的磷含量.

注：字母表示菌株間多重比較顯著性分析結(jié)果，縱向數(shù)值后字母不同表示差異極顯著(P<0.01).**表示差異極顯著.

2.5酸性紅壤中熱研2號柱花草高效菌株的確定

通過對柱花草株高、莖葉鮮重、莖葉干重、含磷量及含氮量等指標進行主因子分析，株高、磷含量兩因子的加和貢獻率已到了89.71%，因此只需提煉2個公因子即可(見表3).屬于第1主導因子的莖葉鮮重、莖葉干重、及株高正載荷高，因此，第1因子F1中基本代表了產(chǎn)量性狀.在對各變量的的方差貢獻中，第1公因子F1的貢獻率達到了45.83%，而第2公因子F2較高的正載荷來源于磷含量和含氮量.第2公因子決定了柱花草的質(zhì)量特性.在對各變量方差的貢獻率中，F(xiàn)2占43.88%(89.71%-F1,見表3).

根據(jù)各個觀測值在第1和第2主因子上的標準得分，繪制關(guān)于F1和F2的二維平面圖(圖1).熱研2號柱花草在酸性紅壤中接種根瘤菌RJS9-1、BS2-2、 BS1-1、FS3-1-1、RJS9-2及ZJ2-2菌株后，植株的F1和F2全為正值，說明柱花草與上述菌株的共生有利于其在酸性紅壤中的生長.接種菌株LY1、NN1-1-2及SM5-1與對照一樣在F1和F2上均為負值，表明上述菌株的共生不能有效地提高熱研2號柱花草在酸性紅壤中的質(zhì)量與產(chǎn)量.

注：表中數(shù)據(jù)是將熱研2號柱花草接種不同根瘤菌后各指標，方差正交旋轉(zhuǎn)后所得的前2個主因子載荷矩陣及所解釋的樣本總方差的累計比例.

3討論

陳文新[15]院士在長期針對根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的研究過程中，對有關(guān)方面有了新論點，即發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)地理環(huán)境中的相同植物可與不同根瘤菌形成共生關(guān)系并固氮；不同植物在相同地區(qū)地理環(huán)境條件下可以與相同的根瘤菌形成共生關(guān)系并固氮.因此，對根瘤菌篩選時，必須既要著重于種植植物的品種(并非是種)，又要著重于生態(tài)環(huán)境，依據(jù)兩方面因素將根瘤菌與宿主匹配到最佳，以期兩者的共生達到最佳.前期實驗中接種結(jié)果不穩(wěn)定可能是由于僅考慮了與宿主的關(guān)系.

柱花草的產(chǎn)量和品質(zhì)最能體現(xiàn)其生長狀況是否良好，柱花草高產(chǎn)則含氮量也高.在篩選評定高效菌株時，主要用產(chǎn)量和含氮量來進行說明.當在高效篩選常規(guī)菌株時，常用于比較有效性的指標有如下幾個：結(jié)瘤與否、結(jié)瘤的數(shù)目和根瘤的重量是多少、根瘤固氮酶活力的強弱、植株地上部的干重，植株全氮量、固氮率及根瘤菌的宿主范圍等等.由于柱花草根瘤的地下部分分布范圍廣、數(shù)目多，而且體積細小，所以無法準確測定根瘤的有效性，因此也很難統(tǒng)計根瘤以及有效根瘤數(shù)目.曾昭海[18]認為在土壤環(huán)境條件不同時，應該有針對性地篩選高效的指標.師尚禮[19]認為應通過全局把握菌株性能、寄主植物、環(huán)境條件，選出適應特殊寄主和環(huán)境條件的特殊菌株或適應多寄主和復雜環(huán)境條件的廣譜菌株.而篩選出的菌株應滿足以下條件：固氮效率高，能與宿主迅速組成有效根瘤，并在不同的田間條件下能迅速適應并有效結(jié)瘤，與土壤中原生根瘤菌的競爭力較強，在無宿主時存活能力也較強，在載體基質(zhì)中也能生長，在種子上存活率也較高，對酸堿、化肥、農(nóng)藥有較高耐受力，有一定的遺傳穩(wěn)定性.本文引入了酸性土壤介質(zhì)，篩選了酸性條件下適合熱研2號柱花草的高效固氮根瘤菌，對于實際生產(chǎn)有著重要的參考價值.

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Selection of highly efficient Rhizobia forStylosanthes
guianensiscv. Reyan No.2 in acid red soil

LU Waiqiang， WU Jinshan

(College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737)

In order to select high efficient Rhizobia strains forStylosanthesguianensiscv. Reyan No.2 (shorted as Reyan 2) in the acid red soil， 19 Rhizobia strains were inoculated into the roots of Reyan 2. Impact of different Rhizobia strains on Reyan 2 in acid red soil were determined by indexes such as height and dry weight， nitrogen content and phosphorus content of stem and leaf. Then highly efficient strains were identified through principal component analysis. The results showed that highly efficient strains forStylosanthesguianensiscv. Reyan No.2 in acid red soil are RJS9-1， BS2-2， ZJ2-2， RJS9-2 and FS3-1-1， while the strains not beneficial to plant growth are LY1， NN1-1-2 and SM5-1. These results provided reference in improvingStylosanthesguianensisproduction by inoculating highly efficient Rhizobia in practice．

acid red soil； Reyan No.2； Rhizobia； nitrogen fixation； selection

2016-12-22.

海南省自然科學基金項目(314057)．

1000-1190(2017)02-0203-05

Q945.79

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: wujsh2007@163.com.