10個(gè)南方皂莢群體遺傳多樣性的AFLP分析

李 偉，林富榮 ，鄭勇奇*，孫 圣

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

10個(gè)南方皂莢群體遺傳多樣性的AFLP分析

李 偉1,2，林富榮1，鄭勇奇1*，孫 圣1

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

[目的]研究南方皂莢的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，為制定有效的保護(hù)策略和育種策略提供理論依據(jù)。[方法]采用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)對(duì)供試的215份皂莢的遺傳多樣性及遺傳距離進(jìn)行分析。[結(jié)果]表明：檢測到1 782個(gè)位點(diǎn)，其中，有1 389個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為77.94%；皂莢各群體Shannon’s信息指數(shù)平均為0.256；Nei’s多樣性指數(shù)平均為0.168，表明皂莢群體的遺傳多樣性偏低，皂莢群體間存在著一定的遺傳分化；根據(jù)遺傳距離UPGMA聚類分析，將10個(gè)群體劃分為4大類。由遺傳分化系數(shù)和分子方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，群體內(nèi)的變異是皂莢遺傳變異的主體，74.79%的變異來自群體內(nèi)。[結(jié)論]皂莢群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的形成不僅與其分布廣泛、種子特性及生活史有關(guān)，而且與人為的砍伐、引種、生境片段化等因素有重要關(guān)系?；谏鲜鼋Y(jié)果提出了皂莢的保護(hù)策略。

皂莢， AFLP標(biāo)記，遺傳多樣性，遺傳結(jié)構(gòu)

皂莢(Gleditsiasinensis)又名皂莢樹，為豆科皂莢屬植物，為我國重要的鄉(xiāng)土樹種，皂莢原產(chǎn)于我國長江流域，在我國大部分地區(qū)均有分布，多生于山坡林地、山谷及路旁。皂莢適應(yīng)性強(qiáng)[1]、耐干旱，也具有很高的工業(yè)價(jià)值和藥用價(jià)值，是優(yōu)良的中藥材[2]和工業(yè)原料[3]，可用作經(jīng)濟(jì)林、用材林、防護(hù)林及園林綠化。盡管皂莢分布區(qū)域廣，但是近年來，由于人為的砍伐和自然環(huán)境的惡化，導(dǎo)致我國皂莢天然種群呈片段化分布，多數(shù)的群體以單株形式存在，皂莢野生種的數(shù)量逐漸減少，處于瀕危狀態(tài)，遺傳多樣性是物種的重要特征，也是研究物種多樣性的核心問題，它反映了物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。通過對(duì)物種遺傳多樣性的研究，對(duì)于揭示物種對(duì)環(huán)境演替的適應(yīng)規(guī)律，對(duì)物種的保護(hù)和合理利用有著重要意義。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性AFLP分子標(biāo)記具多態(tài)性豐富、可重復(fù)性強(qiáng)和穩(wěn)定性高、標(biāo)記覆蓋密度高、引物組合通用等優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用于品種鑒定[4]、遺傳多樣性評(píng)價(jià)[5]、分子標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建[6]、數(shù)量性狀位點(diǎn)定位[7]以及親緣關(guān)系分析[8]。相比于測序技術(shù)，AFLP在分析精度上與測序方法存在明顯的差距，但是群體遺傳學(xué)研究通常需要通過多群體大樣本采樣分析，因此，基于成本、效率以及數(shù)據(jù)分析等因素的限制，測序技術(shù)在林木群體遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的成功應(yīng)用未見相關(guān)報(bào)道， AFLP技術(shù)在對(duì)于一些沒有參考基因組序列的植物，非常有用[9]，仍是進(jìn)行植物遺傳多樣性研究的有力手段。

目前，國內(nèi)外對(duì)皂莢開展了引種栽培[10]、抗逆性[1]、種實(shí)、刺特性與成分[2]等方面的研究，對(duì)皂莢的遺傳學(xué)研究主要集中在北方群體[14]，顧萬春等[11]對(duì)中國北方6個(gè)省市的皂莢進(jìn)行了種源試驗(yàn)，并構(gòu)建了北方產(chǎn)區(qū)的核心種質(zhì)；蘭彥平等[12]對(duì)北方自然分布區(qū)的皂莢表型多樣性進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)，皂莢不同群體間絕大多數(shù)種子表型指標(biāo)都存在極顯著差異；李偉等[13]對(duì)南方皂莢表型多樣性研究發(fā)現(xiàn)，皂莢果實(shí)、種子等性狀在群體間和群體內(nèi)存在豐富的變異，群體內(nèi)的變異是皂莢的主要變異來源。因此，為有效保護(hù)南方皂莢的遺傳資源，在6個(gè)省(市)采集10個(gè)皂莢天然群體，采用AFLP分子標(biāo)記研究南方皂莢群體遺傳多樣性，揭示我國南方地區(qū)皂莢群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的現(xiàn)狀，為制定有效的保護(hù)策略和科學(xué)的育種策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在勘查的基礎(chǔ)上，2011年11月采樣，選擇皂莢分布相對(duì)集中、具有代表性的10個(gè)群體，共計(jì)215個(gè)個(gè)體，具體地理位置詳見表1。株間距大于100 m，樣本采集盡量選擇生長正常，無病蟲害，在群體內(nèi)選定的每個(gè)植株樹冠中部向南的位置采集嫩葉片，用硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存在-80℃冰箱，備用。

表1 皂莢種群采集信息及樣本大小Table 1 Collecting data and samples size of G. sinensis

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 皂莢葉片DNA提取采用CTAB法，利用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop8000, Thermo, American)檢測DNA質(zhì)量以及濃度，DNA濃度稀釋到50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP分析 AFLP實(shí)驗(yàn)步驟參考黃平[14]的方法，僅對(duì)PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行優(yōu)化。接頭序列和預(yù)擴(kuò)增引物序列由北京天根生物科技有限公司合成，選擇性擴(kuò)增引物5’端添加Cy5熒光標(biāo)記。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 PCR產(chǎn)物檢測參照黃平[14]的方法，原始數(shù)據(jù)分析使用系統(tǒng)自帶軟件。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用軟件NTSYS-pc2.1和Popgene3.2對(duì)皂莢群體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳相似性分析，包括多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPB)、Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)I、遺傳距離(D)和遺傳一致度，對(duì)各群體進(jìn)行UPGMA聚類分析和分子方差分析(AMOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增片段多態(tài)性

表2 AFLP引物組合多態(tài)性分析Table 2 AFLP primers and their amplification results

圖1 酶切電泳圖
Fig.1 The restriction patterns of G. sinensis

圖2 預(yù)擴(kuò)增電泳圖
Fig.2 Preamplification electrophoretogram

2.2 遺傳多樣性分析

本研究表明：皂莢群體在種水平上的遺傳多樣性(Ht)為0.126，群體間的遺傳多樣性(Hs)占0.032，群體內(nèi)的遺傳多樣性(Dst)為0.095，群體內(nèi)的遺傳多樣性占74.79%，群體間的遺傳多樣性占25.21%，表明皂莢群體的遺傳多樣性主要存在于群體內(nèi)部。

圖3 部分引物組合毛細(xì)管電泳圖Fig.3 Detection result of different premier capillary gel electrophoresis based on AFLP-marker

基因流(Nm)是表明基因在群體間的交換程度，根據(jù)公式Nm=0.5(1-Gst)/Gst得出皂莢群體種水平上的基因流為1.483，這說明皂莢群體的基因流處于中等偏下水平，群體間交流較少。

表3 皂莢種群遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity of G. sinensis

2.3 群體變異的AMOVA分析

表4表明：皂莢不同群體的遺傳多樣性存在極顯著差異(P<0.01)，說明10個(gè)南方皂莢群體間均存在一定程度的遺傳分化。在總的遺傳變異中，73.13%的變異發(fā)生在群體內(nèi)，只有26.87%發(fā)生在群體間，說明皂莢群體在群體內(nèi)和群體間均存在遺傳變異，而群體內(nèi)的變異是皂莢群體變異的主要來源(表4)，說明皂莢遺傳變異以群體內(nèi)為主，AMOVA分析和遺傳多樣性指數(shù)分析結(jié)果相同。

2.4 皂莢群體關(guān)系與聚類分析

采用NTSYS-pc2.1軟件對(duì)皂莢群體進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖4)，10個(gè)群體的遺傳距離均大于0，這表明供試的10個(gè)群體間有相同的遺傳背景，但是各群體間又存在著一定差異，其中湖北恩施群體、湖北宜昌群體、湖北京山群體、重慶秀山群體這4個(gè)群體距離相近，群體間遺傳距離較小，可以聚為一類；四川成都群體、四川萬源群體、廣西桂林群體和湖南城步群體間遺傳距離較小，這4個(gè)群體聚為1類，以上2類基本與其地理分布格局相吻合，但貴州麻江群體和貴州興義群體的地理距離較近，但是并未優(yōu)先聚在一起，各自聚為1類，這說明群體間的地理距離和群體間遺傳分化程度并沒有顯著的相關(guān)性。

表4 皂莢種群分子方差分析(AMOVA)Table 4 Molecular variance analysis (AMOVA) of G. sinensis

表5 皂莢群體間遺傳相似度和遺傳距離Table 5 Genetic similarity and genetic distance of G.sinensis populations

注：上三角為遺傳距離；下三角為遺傳一致度。

Note: Nei’s genetic identity(above diagonal)and genetic distance(below diagonal).

圖4 10個(gè)皂莢群體遺傳一致度UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of 10 G. sinensis populations using Nei’s biased genetic identity

3 討論

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)是對(duì)生物基因組進(jìn)行分析的一種較為理想的方法，具有分析所需DNA量少、可重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高、樣品適用性廣等諸多特點(diǎn)，但是AFLP分析中也存在操作步驟繁瑣、銀染檢測靈敏度低、實(shí)驗(yàn)效率低以及數(shù)據(jù)分析復(fù)雜的缺點(diǎn)。本研究通過加入熒光引物和毛細(xì)管電泳進(jìn)行自動(dòng)分析，使AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性的測定上更方便快捷，結(jié)果也更準(zhǔn)確。皂莢是我國特有的鄉(xiāng)土樹種，在我國分布廣泛，但是由于人為破壞，我國皂莢呈片段化分布，多數(shù)的皂莢以單株形式存在，皂莢野生種的數(shù)量逐漸減少。到目前為止，有關(guān)皂莢遺傳資源評(píng)價(jià)工作并不多，對(duì)其遺傳背景也不清楚，這嚴(yán)重影響了皂莢遺傳資源的保護(hù)和利用。本研究從湖北、四川、重慶、湖南、廣西和貴州收集了10個(gè)群體，共計(jì)215份皂莢種質(zhì)資源，對(duì)不同地區(qū)的皂莢遺傳資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)。AFLP分析表明：所有14對(duì)熒光引物組合對(duì)215份樣品擴(kuò)增出1 389條多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分比達(dá)77.94%，平均每對(duì)引物的多態(tài)性條帶有99條。

群體的遺傳結(jié)構(gòu)受到基因流、交配系統(tǒng)、突變和選擇等因素的影響。群體變異的分子方差分析(AMOVA)表明，10個(gè)南方皂莢群體間均存在著一定程度的遺傳分化，皂莢群體在群體內(nèi)和群體間均存在遺傳變異，而群體內(nèi)的變異(73.13%)是皂莢群體變異的主要來源。皂莢群體的遺傳分化系數(shù)(Gst)為25.21%，低于自交(0.65)和混合交配(0.40)系統(tǒng)植物，高于異交(0.27)系統(tǒng)植物，這與皂莢蟲媒異花授粉的特征不符，這可能是由于皂莢群體間的分布距離較遠(yuǎn)，使得群體間呈現(xiàn)出一定的遺傳分化；此外，皂莢群體的遺傳分化系數(shù)高于栓皮櫟(QuercusvariabilisBl.) (4.55%)、銀葉樹(HeritieralittoralisDryand.) (23.94%)、秀雅杜鵑(RhododendronconcinnumHemsl.) (7.26%)，低于連香樹(cercidiphyllumJaponicumSieb.) (50.00%)、鵝掌楸(LiriodendronchinensisSargent.) (34.34%)，刺槐(RobiniapserdoacaciaLinn.) (42.03%)，觀光木(TsoongiodendronodorumSin.) (34.34%)、白花樹(StyraxtonkinensisCraib.) (34.04%)、珙桐(DavidiainvolucrateBaill.) (26%)、資源冷杉(AbiesziyuanensisL.K.Fu et S.L.Mo) (37.77%)，銀杉(CathayaargyrophyllaChun.) (26.00%)等樹種。物種的分布范圍會(huì)影響到群體間的分化，群體間如果由于生境破碎化等因素造成生殖隔離，則該群體間就會(huì)產(chǎn)生較大的遺傳差異[21]。目前，皂莢在我國分布呈散生的狀態(tài)，成片的天然林基本消失，人為的破壞嚴(yán)重，造成生境片段化以及交換種子花粉的幾率變小，從而導(dǎo)致皂莢群體的遺傳結(jié)構(gòu)存在著一定的分化。

基因流影響著群體的遺傳結(jié)構(gòu)，基因流的大小反映出群體遺傳結(jié)構(gòu)的大小，通常來說，基因流越大，群體間的遺傳分化系數(shù)越小。基因流>1時(shí)說明該群體間存在著一定的基因流動(dòng)[21]。本研究表明，皂莢群體的基因流(Nm=1.483)處于中等偏下水平，群體間的交流較少。本研究所用材料分布廣泛，其花粉和種子可以借助風(fēng)力、昆蟲和鳥類進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，因此，皂莢群體間有一定的基因交流；但是，由于皂莢散生分布的特點(diǎn)造成交換種子及花粉的幾率小，因此，群體間交流也相對(duì)較少。

大多數(shù)研究表明，遺傳關(guān)系和地理距離具有一定的相關(guān)性[22]，但也有研究表明，二者之間并不呈顯著的相關(guān)性[23]。根據(jù)Nei’s遺傳距離聚類分析可以看出，10個(gè)群體主要分為4大類，各類群體按地理空間分布聚在一起，但是也有例外，如湖南城步群體，這可能與湖南群體特定的分布范圍(多分布于村邊、路邊等人流量較大地區(qū))和特定的環(huán)境條件(降雨量大)等有關(guān)，也可能是從四川等地引種等多因素造成的。

4 結(jié)論

本研究利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)揭示了皂莢群體的遺傳多樣性，該結(jié)果比較全面的反映了我國南方皂莢群體的遺傳信息。(1)AFLP分析表明：所有14對(duì)熒光引物組合對(duì)215份樣品擴(kuò)增出1 389條多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分比達(dá)77.94%，平均每對(duì)引物的多態(tài)性條帶有99條。(2)皂莢群體在種水平上的遺傳多樣性為0.126，遺傳多樣性偏低；皂莢群體間均存在著一定程度的遺傳分化，皂莢群體在群體內(nèi)和群體間均存在遺傳變異，而群體內(nèi)的變異是皂莢群體變異的主要來源。(3)根據(jù)Nei’s遺傳距離聚類分析可以看出，10個(gè)群體主要分為4大類，各類群體主要按地理空間分布聚在一起。為更好的保護(hù)和利用皂莢遺傳資源需要廣泛的分析全國范圍內(nèi)皂莢的遺傳多樣性，從皂莢生態(tài)效益、藥用價(jià)值和分子水平相結(jié)合來全面評(píng)價(jià)其遺傳多樣性。此外，對(duì)于保護(hù)皂莢遺傳資源來說，在開展原地保存和異地保存的同時(shí)建立種質(zhì)資源收集圃進(jìn)行保存。在進(jìn)行皂莢的原地保存工作時(shí)，保護(hù)一個(gè)群體的完整性尤為重要；在對(duì)皂莢進(jìn)行異地保存時(shí)，保存的個(gè)體盡量來自不同的居群，以保證基因流能在各居群間最廣泛的交流。

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(責(zé)任編輯：詹春梅)

Genetic Diversity of TenGleditsiasinensisPopulations from Southern China

LIWei1,LINFu-rong1,ZHENGYong-qi1,SUNSheng1

(1.Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration,Beijing 100091, China; 2.College of Landscape Architecture and Forestry, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China)

[Objective] To understand the genetic diversity ofGleditsiasinensis.[Method]215G.sinensissamples were analyzed using AFLP (amplified fragment length polymorphism) approach. [Result]The results showed that total of 1 782 loci ofG.sinensisgenome were examined for molecular variation in which 1 389 loci were polymorphism, accounting for 77.94%. The average Shannon’s andNei’sindex were 0.256 and 0.168, respectively. At the species level, the total genetic diversity (Ht) was 0.127, suggesting a lower genetic diversity inG.sinensispopulations. The gene flow and average genetic distance were 0.059 and 1.483, respectively. It is suggested that there were some genetic differentiations among the ten populations. The UPGMA cluster analysis showed that theG.sinensispopulations were divided four types. The variance within population was the main part of the genetic variation of the species according to the AMOVA andGstanalysis. [Conclusion]In combination with on-site investigation, it is conclude that the present status of genetic diversity and genetic structure ofG.sinensispopulations are strongly affected by wide distribution, fruit characteristics, chop, introduction and habitat fragmentation. Some suggestions on the gene conservation ofG.sinensisare proposed.

Gleditsiasinensis； AFLP marker； genetic diversity; genetic structure

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.007

2016-06-17

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201504103)

李 偉(1981—)，男，山東濰坊人，博士，主要從事林木遺傳資源與改良方面研究.
* 通訊作者：鄭勇奇，男，研究員，主要從事林木遺傳資源方面研究.E-mail: zhengyq@caf.ac.cn.

S718

A

1001-1498(2017)01-0046-07