綜合生物防控?zé)煵萸嗫莶〖捌鋵?duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響*

李 想 劉艷霞陸 寧 蔡劉體 袁有波 石俊雄

（貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550000）

綜合生物防控?zé)煵萸嗫莶〖捌鋵?duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響*

李 想 劉艷霞?陸 寧 蔡劉體 袁有波 石俊雄

（貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550000）

利用生物有機(jī)肥結(jié)合相應(yīng)的農(nóng)藝措施進(jìn)行生物防控是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。分別采用常規(guī)施肥（T1）、常規(guī)施肥+生石灰（T2）、常規(guī)施肥+L-25生物有機(jī)肥（T3）、常規(guī)施肥+生石灰+ L-25生物有機(jī)肥（T4）四個(gè)處理來(lái)探究生物防控?zé)煵萸嗫莶〉男Ч?。結(jié)果表明：2014年T4處理在煙草全生育期的防控效果顯著高于T2和T3處理，在90d后防控效果分別是T2和T3的6.26倍和1.99倍。經(jīng)過(guò)三年修復(fù)，青枯病綜合防控效果高達(dá)61.3%。2013年和2014年T4處理產(chǎn)量顯著高于其他各處理。2013年生物有機(jī)肥各處理的拮抗菌在70 d之前均顯著高于各自對(duì)應(yīng)的病原菌數(shù)量，2014年T4病原菌數(shù)量則始終處于106cfu g-1數(shù)量級(jí)以下，其他處理在煙草移栽90 d后病原菌數(shù)量均增長(zhǎng)至107cfu g-1以上。T4處理的根際土壤微生物物種豐度水平、運(yùn)算分類單位（OTU）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannonindex）均高于T1處理，主成分與聚類分析表明T3和T4處理的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)相似，明顯不同于T1處理。綜合的生物防控措施可以有效防控重病區(qū)青枯病，對(duì)烤煙產(chǎn)量產(chǎn)值具有明顯的提高作用，并能有效改良土壤微生物區(qū)系，具有良好的推廣應(yīng)用前景。

煙草青枯??；綜合防控；病原菌；拮抗菌；根際微生物平衡

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種以土壤傳播為主的毀滅性細(xì)菌性煙草病害，煙草青枯病是影響貴州煙葉生產(chǎn)的最主要的細(xì)菌性病害［1］。近年來(lái)，隨著科技進(jìn)步和人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，生物防控方法逐漸引起了人們的重視，目前對(duì)青枯病病原菌的防控都停留在實(shí)驗(yàn)室中拮抗菌對(duì)病原菌的平板拮抗作用，直接應(yīng)用于溫室試驗(yàn)或田間試驗(yàn)的防控效果甚微，Anuratha和Gnanamanickam［2］將平板篩選得到的熒光假單胞桿菌直接用于田間試驗(yàn)，其對(duì)番茄青枯病的防控率僅為36%左右。

拮抗菌單獨(dú)施入土壤后不易定殖，提高拮抗菌在土壤根際的定殖成為生物防控的研究重點(diǎn)。目前主要采用施用拮抗菌結(jié)合有機(jī)肥或經(jīng)過(guò)2次發(fā)酵制成生物有機(jī)肥調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)、改善土壤微生物多樣性、抑制病原菌的生長(zhǎng)或提高植物自身抗性，從而抑制病害的發(fā)生［3-4］。Qiu等［5］利用生物有機(jī)肥顯著降低黃瓜枯萎病的發(fā)病率并改善土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)；Zhao等［6］利用SQR21拮抗菌的生物有機(jī)肥降低西瓜枯萎病真菌尖鐮孢菌的數(shù)量級(jí)進(jìn)而達(dá)到防控效果；Wu等［7］利用解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌制成生物有機(jī)肥施用抑制病原菌的生長(zhǎng)取得很好的防控效果；Ding等［8］研制的BIO-36和BIO-23生物有機(jī)肥防控馬鈴薯青枯病防控效果分別可以達(dá)到96%和91%。但由于環(huán)境的復(fù)雜性及單一防控措施的局限性對(duì)病害發(fā)病嚴(yán)重田塊的防控效果并不理想［9］，比如李紅麗等［10］研制的抑制煙草青枯病生物有機(jī)肥在2005年的抑制煙草青枯病效果不顯著。采用綜合防控的方法能夠消除單一措施帶來(lái)的短板效應(yīng)，是實(shí)現(xiàn)土傳病害生物防控的有效措施之一［11-12］。

本研究采用綜合防控手段對(duì)煙草青枯病發(fā)病嚴(yán)重的煙田進(jìn)行三年長(zhǎng)期定位修復(fù)，并通過(guò)研究土壤中病原菌與拮抗菌的消長(zhǎng)關(guān)系及土壤微生物區(qū)系變化特征，探索綜合防控對(duì)煙草青枯病的有效防控修復(fù)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草品種采用云煙85，該品種品質(zhì)好但易感青枯病。拮抗菌采用前期自健康煙草根際土壤分離篩選到的L-25（短短芽孢桿菌，Brevibacillus brevis），L-25經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏（CGMCC No.3175）［13］。有機(jī)肥載體為菜粕酶解的氨基酸有機(jī)肥與牛糞以1∶1（質(zhì)量比）混合，含有機(jī)質(zhì)338 g kg-1、氨基酸43.0g kg-1、N 42.0g kg-1、P2O522.6g kg-1和K2O 10.8g kg-1。

1.2 抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的制備

將拮抗菌L-25接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，三角瓶裝液量為1/5，30℃、170 r min-1振蕩48 h。將上述發(fā)酵液6 000×g離心10 min，收集菌體按5%接種量接種于滅菌后的有機(jī)肥載體。調(diào)節(jié)有機(jī)肥含水量為40%，發(fā)酵5～6 d，定期翻拋。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定L-25生物有機(jī)肥有效活菌數(shù)及拮抗菌數(shù)量，重復(fù)3次（表1）［14］。

1.3 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別于2012―2014年在貴州省黔南州長(zhǎng)順縣廣順鎮(zhèn)石洞村（26.03°N，106.45°E）連續(xù)開(kāi)展三年長(zhǎng)期定位修復(fù)試驗(yàn)。所選的長(zhǎng)期定位修復(fù)試驗(yàn)點(diǎn)試驗(yàn)前青枯病發(fā)病率達(dá)到100%，連續(xù)1 0年以上種植烤煙，當(dāng)年已經(jīng)決定不再種植煙草。田間試驗(yàn)共設(shè)四個(gè)處理：常規(guī)施肥（T1）：只施用975 kg hm-2的煙草專用復(fù)合肥料（N∶P2O5∶K2O=10∶15∶25）；常規(guī)施肥+生石灰（T2）：在T1處理基礎(chǔ)上在移栽前20天施用600 kg hm-2生石灰調(diào)節(jié)土壤pH；常規(guī)施肥+L-25生物有機(jī)肥（T3）：在施用817.5 kg hm-2煙草專用復(fù)合肥料基礎(chǔ)上加施375 kg hm-2的L-25生物有機(jī)肥，磷和鉀不足的部分分別用過(guò)磷酸鈣和硫酸鉀補(bǔ)齊；常規(guī)施肥+生石灰+ L-25生物有機(jī)肥（T4）：在移栽前20天施用600 kg hm-2生石灰調(diào)節(jié)土壤pH，施肥處理與T3相同。

表1 拮抗菌二次發(fā)酵前后微生物數(shù)量Table 1 Counts of microbes before and after the secondary fermentation of antagonistic bacteria（cfu g-1）

供試土壤類型為普通黃色濕潤(rùn)鐵鋁土。pH 5.45，有機(jī)質(zhì)48.6 g kg-1，全氮2.29 g kg-1，堿解氮158 mg kg-1，有效磷48.9 mg kg-1，速效鉀543 mg kg-1。每處理4個(gè)重復(fù)區(qū)組，每區(qū)組120株煙株，加保護(hù)行等共占地0.05 hm2。田間管理及追肥的施用與當(dāng)?shù)仄渌麩熖锵嗤?/p>

1.4 田間試驗(yàn)病害調(diào)查及相關(guān)性狀測(cè)量

分別于煙草移栽后40～90 d，每隔10 d觀測(cè)煙草發(fā)病情況并測(cè)定根際土壤微生物病原菌與拮抗菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性，煙葉采摘并烘烤后計(jì)算各處理產(chǎn)量。

青枯病調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（以株為單位）：調(diào)查病情指數(shù)以及防控效果，采用劉艷霞等［14］方法進(jìn)行測(cè)定。病情指數(shù)與防控效果的計(jì)算如下：

煙草移栽后約60～70 d，葉片開(kāi)始自下而上逐漸成熟，根據(jù)煙葉成熟情況由下至上分次采收并放于烤房中烘烤，烘烤后計(jì)算其產(chǎn)值量［15］。

1.5 土壤病原菌與拮抗菌數(shù)量的檢測(cè)

土壤基因組D N A采用土壤歐米伽D N A提取試劑盒（Soil DNA Isolation Kit，Omega）提取，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)D N A的純度和濃度。以樣品D N A作為擴(kuò)增模板，分別用病原菌（R. s o l a n a c e a r u m）特異引物（flicF：GAACGCCAACGGTGCGAACT；flicR：GGCGGCCTTCAGGGAGGTC）與拮抗菌（B.b re v i s）的特異性引物（B r e-F：AGACCGGGATAACATAGGGAAACTTAT；Bre-R：GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC）在熒光定量PCR儀（StepOne Plus Real-time PCR System，ABI，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，記錄每個(gè)樣品的Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品模板的初始基因拷貝數(shù)，最終換算出每克干土的茄科勞爾氏菌或短短芽孢桿菌的基因拷貝數(shù)［12］。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，茄科勞爾氏菌的擴(kuò)增效率達(dá)到91.0 %，短短芽孢桿菌的擴(kuò)增效率達(dá)到100%，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞0.99。茄科勞爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.56C0+38.7，短短芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Ct=-3.32C0+37.2。

1.6 根際土壤微生物區(qū)系檢測(cè)

移栽90 d后采集根際土壤，將煙株慢慢連根拔起，輕輕震蕩掉附著的土塊，將根連同根上震蕩不掉的土壤置于10 ml滅菌水中，超聲波震蕩15 min后得到的土壤即為根際土壤［16-17］。

上述提取的土壤DNA，取適量的樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋至1 ng μl-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶標(biāo)簽序列（Barcode）的特異引物，使用紐英倫生物技術(shù)（New England Biolabs）公司的高保真（Phusion? High-Fidelity）含有GC緩沖液的PCR混合液（Master Mix with GC Buffer）。使用高效和高保真的酶進(jìn)行擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物為515F-806R。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用賽默科學(xué)公司（Thermo Scientific）的凝膠回收試劑盒（GeneJET）回收產(chǎn)物。

使用紐英倫生物技術(shù)（New England Biolabs）公司億美達(dá)（Illumina）的超DNA文庫(kù)制備試劑盒（NEB Next? Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina）進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)量子位（Qubit）定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序?；趥€(gè)人基因組分析測(cè)序平臺(tái)（MiSeq Personal Sequencing System，Illumina，美國(guó)）［18］，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)利用Uparse［19］軟件（Uparse v7.0.1001，美國(guó)）對(duì)所有樣品的全部有效標(biāo)簽序列聚類，以95%的一致性（Identity）進(jìn)行運(yùn)算分類單位（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果［20］。再對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。最后在以上分析的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行一系列的基于OTUs和物種組成的聚類分析、主成分分析（Principal component analysis，PCA）等［21］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS，IL，Chicago，美國(guó)）進(jìn)行，最小顯著差異法（LSD）或鄧肯（Duncan）新復(fù)極差進(jìn)行多重比較（p＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 煙草青枯病的綜合防控效果

2013年對(duì)照T1在生育末期青枯病發(fā)病率達(dá)到100%，而T4處理發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照（圖1）。采用生物防控綜合措施后，2012年移栽53 d后各處理煙株全部暴發(fā)青枯病，各處理間的防控效果無(wú)顯著差異（表2）。2013年T4處理在煙草全生育期的防控效果顯著高于T2和T3處理，在煙草生育90 d后仍分別較T2和T3高78.1%和18.2%。2014年T4和T3處理的青枯病發(fā)生較對(duì)照推遲40 d，T4處理在60 d后防控效果顯著高于T3和T2處理，在90 d后防控效果分別為T2和T3的6.26倍和1.99倍。

圖1 煙草青枯病綜合防控田間防效（2013年）Fig. 1 Tobacco bacterial wilt controlling effect of the integrated control measures

表2 綜合防控?zé)煵萸嗫莶》揽匦Ч麆?dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamics of controlling effect of the integrated control measures on tobacco bacterial wilt

2.2 煙草青枯病的綜合防控試驗(yàn)產(chǎn)值量

由于2012年移栽60 d后各處理煙株全部暴發(fā)青枯病，各處理間的產(chǎn)值量均為零（表3）。2013年T4處理產(chǎn)量顯著高于其他各處理，分別為T1、T2和T3處理的3.71倍、1.61倍和1.13倍，T4、T3和T2處理的產(chǎn)值分別為T1的3.44倍、2.62倍和1.87倍。2014年T4處理產(chǎn)量和產(chǎn)值顯著高于其他處理，T1 與T2的產(chǎn)量和產(chǎn)值之間無(wú)顯著差異，且均顯著低于T3處理。

表3 綜合防控試驗(yàn)產(chǎn)值量Table 3 Tobacco yield and output value of different treatments

2.3 土壤病原菌與拮抗菌的消長(zhǎng)關(guān)系

從圖2中可以看出，修復(fù)1年時(shí)（2012年）各處理病原菌數(shù)量在煙草移栽30 d后居高不下，一直保持在107cfu g-1土以上，而T2、T3和T4處理的拮抗菌數(shù)量全生育期基本呈直線下降，最后降為104cfu g-1土；經(jīng)過(guò)2年修復(fù)后（2013年），T1處理的病原菌數(shù)量在30 d后即達(dá)到107cfu g-1土，經(jīng)過(guò)生物有機(jī)肥處理的T3和T4處理病原菌數(shù)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，但生物有機(jī)肥各處理的拮抗菌在70 d之前均顯著高于各自對(duì)應(yīng)的病原菌數(shù)量，在80 d，T3和T4處理的病原菌數(shù)量與拮抗菌數(shù)量之間無(wú)顯著差異，而T2處理的病原菌數(shù)量是拮抗菌的1.49倍，呈顯著差異；2014年T1和其他處理病原菌數(shù)量在50 d前呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，在50 d 后T1處理病原菌數(shù)量迅速上升，T2處理病原菌數(shù)量在70 d后才呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而T4病原菌數(shù)量則始終處于106cfu g-1土數(shù)量級(jí)以下，在煙草移栽90 d后，各處理除T4外土壤中病原菌數(shù)量均增長(zhǎng)至107cfu g-1土以上。拮抗菌的數(shù)量在全生育期呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，T2處理病原菌與拮抗菌的數(shù)量交匯時(shí)間在72 d，T3處理的交匯時(shí)間為78 d，而T4的拮抗菌數(shù)量在90 d后仍然高于病原菌數(shù)量，達(dá)到1.23×106cfu g-1土，隨著生物修復(fù)防控時(shí)間的延長(zhǎng)，拮抗菌的數(shù)量降低速度趨于緩慢。

2.4 根際土壤微生物物種豐度及群落構(gòu)成主要影響因素

從不同處理土壤微生物物種豐度水平上看（圖3），T1與T4處理的微生物門水平分布差異明顯，T1處理的Planctomyces、Sphingobium、Rhodanobacter、Gemmata、Candidatus_Nitrososphaera和Stenotrophomonas六個(gè)門為豐度水平較高的種群，而Chitinophaga、Niastelia、Methylotenera等門相對(duì)豐度水平較低；T4處理豐度水平較高的種群只有Nitrospira和Novosphingobium，較低的只有Phenylobacterium門，其他微生物門之間豐度差異較小，分布水平相近，整體微生物群落處于平衡、均勻的狀態(tài)。

主成分分析（PCA）是一種從復(fù)雜的多維變量數(shù)據(jù)中提取主要變量，并進(jìn)行可視化的方法。對(duì)β多樣性進(jìn)行PCA分析后，T3與T4處理土壤微生物多樣性關(guān)系較近（圖4），均處在左下半部，T2處理的土壤微生物多樣性在像限的左上部，而T1處理與T2、T3和T4處理之間關(guān)系較遠(yuǎn)，處于像限的右上部。

3 討 論

圖2 不同年限間土壤中病原菌與拮抗菌的消長(zhǎng)關(guān)系Fig. 2 Populations of pathogens and antagonistic bacteria in soils in different years

圖3 不同處理物種豐度聚類圖Fig. 3 Species abundance cluster map relative to treatment

圖4 不同處理β多樣性主成分分析Fig. 4 Principal component analysis（PCA）analysis of β diversity relative to treatment

有機(jī)肥與功能微生物（生防菌等）相結(jié)合制成微生物有機(jī)肥后施用，對(duì)各種土傳病害的防控體現(xiàn)出很好的效果［22］。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照（T1）相比，單施用生石灰處理（T2）對(duì)青枯病90d的防控效果分別為40.2%（2013年）和9.8%（2014年），防控效果十分不理想，單施用L-25生物有機(jī)肥（T3）對(duì)青枯病90 d的防控效果分別為60.6% （2013年）和30.8%（2014年），但綜合防控T4處理的防控效果最高分別達(dá)到75.2%（2013年）和61.3%（2014年）。由此可見(jiàn)，在本試驗(yàn)中單一地采用生石灰或者生物有機(jī)肥處理均不能有效防控青枯病的發(fā)生，通過(guò)生石灰和施用生物有機(jī)肥這2項(xiàng)農(nóng)藝措施結(jié)合后可以改良土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)煙草根系深扎，進(jìn)而提高植物抗逆性［23］。生石灰調(diào)節(jié)土壤pH減少土傳病原菌的數(shù)量［11］（圖2），進(jìn)而達(dá)到很好的生物防控效果。此外，通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施用生物有機(jī)肥處理能延緩青枯病的發(fā)病時(shí)間，2013年與2014年青枯病初發(fā)期分別推遲30 d和40 d。這主要由于采用的拮抗微生物均從煙草根際土篩選獲得，在煙草根際具有很強(qiáng)的定殖能力；同時(shí)拮抗菌以有機(jī)肥為載體，經(jīng)過(guò)二次固體發(fā)酵后施入土壤中，在前期對(duì)病原菌起到較好的抑制作用［24］，進(jìn)而推遲煙草植株發(fā)病時(shí)間。

各處理防控效果隨煙草生育期先增加后降低，這是由于生物有機(jī)肥在初期抑制了煙草青枯病的發(fā)生，具有延緩發(fā)病的功效。而隨時(shí)間增加，對(duì)照煙株基本已經(jīng)枯萎死亡，發(fā)病率和病情指數(shù)均不再變化，后期處理青枯病仍有少量發(fā)生，因此防控效果會(huì)逐漸下降。相比較而言，T3和T4處理2014年煙草生育前期防控率均高于2013年相應(yīng)處理，而到后期又低于2013年，這主要是由于2013年移栽30 d后多為高溫（＞30℃）高濕（＞80%）氣候，2013年青枯病在30 d就發(fā)生，此時(shí)T3和T4處理病原菌數(shù)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，但其拮抗菌數(shù)量在70 d之前均顯著高于病原菌（圖2），在90 d后病原菌數(shù)量仍未達(dá)到發(fā)病濃度107cfu g-1［12］，進(jìn)而防控效果在60%以上；但在2014年移栽70 d后進(jìn)入高溫高濕氣候，此時(shí)T4和T3的拮抗菌數(shù)量減少到與病原菌數(shù)量持平或者低于病原菌數(shù)量，且病原菌數(shù)量達(dá)到發(fā)病濃度107cfu g-1，進(jìn)而導(dǎo)致青枯病的發(fā)生，因此2014年表現(xiàn)為T3和T4處理前期的防控效果較高，后期有所下降。施用拮抗菌二次發(fā)酵的生物有機(jī)肥結(jié)合農(nóng)作措施，使根表和根際土中的病原菌數(shù)量降低到發(fā)病濃度以下，是生物防控的主要機(jī)理之一［25］。

在高通量測(cè)序中選取樣品中土壤微生物物種相對(duì)豐度排名前35進(jìn)行橫縱向聚類（圖3）［19］，主要展現(xiàn)的是優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度在各個(gè)樣本之間的差別。由于本試驗(yàn)田處理前為煙草青枯病發(fā)病率100%的土壤，故勞爾氏菌屬豐度水平在物種豐度聚類圖中得以體現(xiàn)；而本試驗(yàn)施用的L-25拮抗菌隨著時(shí)間的延長(zhǎng)數(shù)量逐漸降低，尤其在煙草生育后期的根際土壤中L-25菌屬的相對(duì)豐度排在35種微生物物種之外，故在物種豐度聚類圖上未體現(xiàn)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)在高通量測(cè)序物種豐度聚類圖中找到該菌屬，而本文選用引物fliCF/ fliCR 和Bre-F/Bre-R建立了勞爾氏菌和短短芽孢桿菌熒光定量PCR 體系進(jìn)行檢測(cè)，與陳巧玲等［26］的結(jié)果一致。

綜合防控措施對(duì)土壤中青枯病病原菌有較好的抑制作用，主要是因?yàn)槠溆行Ц纳仆寥牢⑸锲胶?，恢?fù)被破壞的土壤生態(tài)系統(tǒng)，從而建立起復(fù)雜而健康的土壤微生物體系［27］。拮抗菌在有機(jī)肥協(xié)助下形成“基質(zhì)-菌群”生態(tài)系統(tǒng)，更有利于調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境，可改變根際土壤微生物生態(tài)特征和物理化學(xué)特征，從而起到防病、抑病的作用［28］。本試驗(yàn)中采用的PCA分析是從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，較物種相對(duì)豐度的聚類更加說(shuō)明問(wèn)題［29］，其結(jié)果表明T3和T4處理微生物區(qū)系在同一范圍內(nèi)，說(shuō)明兩處理土壤微生物結(jié)構(gòu)、功能等多樣性基本處于相同的水平；而T1處理在PCA分析中距離T4處理最遠(yuǎn)，因而土壤微生物結(jié)構(gòu)、功能等多樣性最不相同，這一結(jié)果與張慧等［30］和Lang等［31］類似。當(dāng)土壤肥力水平提高、微生態(tài)環(huán)境得到改善、微生物活性增強(qiáng)時(shí)，土壤微生物群落功能多樣性會(huì)提高［32］，青枯病生物綜合防控技術(shù)能較好地恢復(fù)土壤微生物達(dá)到健康區(qū)系的水平，具有很好的應(yīng)用前景［33-34］。

4 結(jié) 論

施用抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥配合生石灰防控措施，可以有效降低青枯病發(fā)病率，增加煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值，降低土壤中病原菌濃度，有利于病害土壤生態(tài)系統(tǒng)向健康可持續(xù)發(fā)展的方向轉(zhuǎn)化，進(jìn)而達(dá)到對(duì)重病煙區(qū)煙草青枯病良好的防控效果。

［1］Liu Y，Li X，Cai K，et al. Identification of benzoic acid and 3-phenylpropanoic acid in tobacco root exudates and their role in the growth of rhizosphere microorganisms. Applied Soil Ecology，2015，93：78—87

［2］Anuratha C S，Gnanamanickam S S. Biological control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum in India with antagonistic bacteria. Plant and Soil，1990，124（1）：109—116

［3］Abawi G S，Widmer T L. Impact of soil health management practices on soilborne pathogens，nematodes and root diseases of vegetable crops. Applied Soil Ecology，2000，15（1）：37—47

［4］李勝華，谷麗萍，劉可星，等. 有機(jī)肥配施對(duì)番茄土傳病害的防治及土壤微生物多樣性的調(diào)控. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2009，15（4）：965—969

Li S H，Gu L P，Liu K X，et al. Effect of combined application of organic fertilizers on the control of soilborne diseases and the regulation of soil microbial diversity（In Chinese）. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer，2009，15（4）：965—969

［5］Qiu M，Zhang R，Xue C，et al. Application of bioorganic fertilizer can control Fusarium wilt of cucumber plants by regulating microbial community of rhizosphere soil. Biology and Fertility of Soils，2012，48（7）：807—816

［6］Zhao S，Liu D，Ling N，et al. Bio-organic fertilizerapplication significantly reduces the Fusarium oxysporum population and alters the composition of fungi communities of watermelon Fusarium wilt rhizosphere soil. Biology and Fertility of Soils，2014，50（5）：765—774

［7］Wu Y，Zhao C，F(xiàn)armer J，et al. Effects of bio-organic fertilizer on pepper growth and Fusarium wilt biocontrol. Scientia Horticulturae，2015，193：114—120

［8］Ding C，Shen Q，Zhang R，et al. Evaluation of rhizosphere bacteria and derived bio-organic fertilizers as potential biocontrol agents against bacterial wilt （Ralstonia solanacearum）of potato. Plant and Soil，2012，366（1）：453—466

［9］陳雯廷.馬鈴薯黑痣病綜合防控技術(shù)的研究與集成. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014

Chen W T. Study and integration on synthetically prevention technology of Rhizoctonia solanifrom potato（In Chinese）. Huhehaote：Inner Mongolia Agricultural University，2014

［10］李紅麗，郭夏麗，李清飛，等. 抑制煙草青枯病生物有機(jī)肥的研制及其生防效果研究. 土壤學(xué)報(bào)，2010，47 （4）：798—801

Li H L，Guo X L，Li Q F，et al.Tobacco wilt suppressing bio-manure and its bio-control effect（In Chinese）. Acta Pedologica Sinica，2010，47（4）：798—801

［11］王麗麗，石俊雄，袁賽飛，等. 微生物有機(jī)肥結(jié)合土壤

改良劑防治煙草青枯病. 土壤學(xué)報(bào)，2013，50（1）：153—159

Wang L L，Shi J X，Yuan S F，et al.Control of tobacco bacterial wilt with biomanure plus soil amendments（In Chinese）. Acta Pedologica Sinica，2013，50（1）：153—159

［12］劉艷霞，李想，曹毅，等. 抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的田間防效研究. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2014，20 （5）：1203—1211

Liu Y X，Li X，Cao Y，et al. Field control efficiency of tobacco specific bio-organic fertilizer on tobacco bacterial wilt（In Chinese）. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer，2014，20（5）：1203—1211

［13］Liu Y X，Shi J X，F(xiàn)eng Y G，et al. Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the applicaiton of antagonistic strains in combination with organic fertilizer. Biology and Fertility of Soils，2013，49 （4）：447—464

［14］劉艷霞，李想，蔡劉體，等. 生物有機(jī)肥對(duì)煙株和土壤酶活性以及煙草超微結(jié)構(gòu)的影響. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2013，19（6）：78—84

Liu Y X，Li X，Cai L T，et al. Effect of bio-organic fertilizer on enzyme activity and ultramicro-structure of xylem vessel in tobacco（In Chinese）. Acta Tabacaria Sinica，2013，19（6）：78—84

［15］張翔，毛家偉，李彰，等. 氮用量及基追比例對(duì)煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)及氮肥利用效率的影響. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2012，18（6）：1522—1527

Zhang X，Mao J W，Li Z，et al. Effects of nitrogen fertilizer rates and ratios of base and topdressing fertilizer on yield，quality of tobacco leaves and N-use efficiency（In Chinese）. Plant Nutrition and Fertilizer Science，2012，18（6）：1522—1527

［16］劉艷霞. 土傳煙草青枯病的生物防控及其機(jī)理研究. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012

Liu Y X. Study on pathogenic factors of tobacco bacterial wilt，its biological control and mechanism of action（In Chinese）. Nanjing：Nanjing Agricultural University，2012

［17］Carlsen S C K，Pedersen H A，Spliid N H，et al. Fate in soil of flavonoids released from white clover （Trifoliumrepens L.）. Applied & Environmental Soil Science，2012，2012：Article ID：743413

［18］Luo C. Direct comparisons of illumina vs. Roche 454 sequencing technologies on the same microbial community DNA sample. PLoSone，2012：e30087

［19］Edgar R C. Uparse：Highly accurate otu sequences from microbial amplicon reads. Nature methods，2013，10 （10）：996—998

［20］Wang Q，Garrity G M，Tiedje J M，et al. Na?ve bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（16）：5261—5267

［21］林新堅(jiān)，林斯，邱珊蓮，等. 不同培肥模式對(duì)茶園土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)的影響. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2013，19（1）：93—101

Lin X J，Lin S，Qiu S L，et al. Effect of different fertilization strategies on structure and activity of microbial community in tea orchard soils（In Chinese）. Plant Nutrition and Fertilizer Science，2013，19 （1）：93—101

［22］Trillas M I，Casanova E，Cotxarrera L，et al. Composts from agricultural waste and the Trichoderma asperellumstrain t-34 suppress Rhizoctonia solaniin cucumber seedlings. Biological Control，2006，39 （1）：32—38

［23］Maderia M V A，Melo M G，Alexandre C A. Effects of deep ploughing and superficial disc harrowing on physical and chemical soil prperties and biomass in a new plantation of Eucalyptus globulus. Soil and TillageResearch，1989，14（2）：163-175

［24］El-Abyad M S，El-Sayed M A，El-Shanshoury A R，et al. Towards the biological control of fungal and bacterial diseases of tomato using antagonistic Streptomyces spp. Plant and Soil，1993，149（2）：185—195

［25］Zhao Q，Dong C，Yang X，et al. Biocontrol of Fusarium wilt disease for Cucumismelo melon using bio-organic fertilized. Applied Soil Ecology，2011，47 （1）：67-75

［26］陳巧玲，胡江，汪漢成，等. 生物有機(jī)肥對(duì)盆栽煙草根際青枯病原菌和短短芽孢桿菌數(shù)量的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（1）：75—79

Chen Q L，Hu J，Wang H C，et al. Effects of bioorganic fertilizer application on population of Ralstonia solanacearum and Brevibacillus brevis in tobacco rhizosphere（In Chinese）. Journal of Nanjing Agricultural University，2012，35（1）：75—79

［27］Liu Y，Shi J，F(xiàn)eng Y，et al. Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the applicaiton of antagonistic strains in combination with organic fertilizer. Biology and Fertility of Soils，2013，49 （4）：447—464

［28］張志紅，李華興，韋翔華，等. 生物肥料對(duì)香蕉枯萎病及土壤微生物的影響. 生態(tài)環(huán)境，2008，17（6）：2421—2425

Zhang Z H，Li H X，Wei X H，et al. Infulence of biological fertilizers on banana wilt disease and microorganisms in soil（In Chinese）. Ecology and Environment，2008，17（6）：2421—2425

［29］Fierer N，Leff J W，Adams B J，et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（52）：21390—21395

［30］張慧，楊興明，冉煒，等. 土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng). 土壤學(xué)報(bào)，2008，45（6）：1095—1101

Zhang H，Yang X M，Ran W，et al. Screening of bacteria antagonistic against soil-borne cotton Verticilllium wilt and their biological effects on the soilcotton system（In Chinese）. Acta Pedologica Sinica，2008，45（6）：1095—1101

［31］Lang J，Hu J，Ran W，et al. Control of cotton Verticillium wilt and fungal diversity of rhizosphere soils by bio-organic fertilizer. Biology and Fertility of Soils，2012，48（2）：191—203

［32］張志明，許艷麗，韓曉增，等. 連續(xù)施肥對(duì)農(nóng)田黑土微生物功能多樣性的影響. 生態(tài)學(xué)雜志，2012，31 （3）：647—651

Zhang Z M，XuY L，Han X Z，et al. Effects of continuous fertilization on microbial functional diversity in black soil under cropland（In Chinese）. Chinese Journal of Ecology，2012，31（3）：647—651

［33］佀國(guó)涵，王瑞，袁家富，等. 綠肥與化肥配施對(duì)植煙土壤微生物群落的影響. 土壤，2013，45（6）：1070—1075

Si G H，Wang R，Yuan J F，et al. Effects of green manure application combined with chemical fertilizers on soil microbial community structure of tobaccoplanting soil（In Chinese）. Soils，2013，45（6）：1070-1075

［34］羅佳，劉麗珠，王同，等. 養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料有機(jī)肥對(duì)辣椒產(chǎn)量及土壤微生物多樣性的影響. 土壤，2015，47 （6）：1101—1106

Luo J，Liu L Z，Wang T，et al. Effect of organic fertilizer from deep-litter pig rearing on pepper yield and soil microbial diversity（In Chinese）. Soils，2015，47（6）：1101—1106

Integrated Bio-control of Tobacco Bacterial Wilt and Its Effect on Soil Microobial Community Structure

LI Xiang LIU Yanxia?LU Ning CAI Liuti YUAN Youbo SHI Junxiong
（Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 550000，China）

【Objective】Tobacco bacterial wilt is one of the most serious soil-borne pests affecting tobacco production in Southwest China. Biocontrol of tobacco bacterial wilt has been a hot research topic in recent years. For control of the pest，a kind of biomanure prepared out of microbes antagonistic to the pest is used together with some proper agronomic measures，so as to achieve sustainable and healthy development of tobacco production.【Method】In this study，a three-year long field experiment was conducted in aseverely wilt infected tobacco field in Guizhou Province to explore effects of the pest control measures. The experiment was designed to have four treatments or measures，that is，T1（Conventional fertilization），T2（Conventional fertilization + liming），T3（Conventional fertilization + L-25 Biomanure）and T4 （Conventional fertilization + liming + L-25 Biomanure）. High-throughput sequencing was done of the microbial genome in the rhizosphere to explore effects of the integrated control measures on soil microflora. 【Result】The experiment indicated thatin 2013 Treatment T4 was significantly（p＜0.05）higher than Treatments T2 and T3 in controlling effect during the entire tobacco growing period，and in 2014，Treatment T4 was significantly higher than Treatments T2 and T3 in controlling effect，60 days after transplanting and 6.26 and 1.99 times as high as Treatments T2 and T3，respectively，90 days after transplanting. At the end of the experiment，the pest controlling effect reached up to 61.30%. In 2013，Treatment T4 was significantly higher than all the other treatments in tobacco yield or 3.71，1.61 and 1.13 times as high as Treatment T1，T2 and T3，respectively. In 2014，Treatment 4 was the highest in tobacco yield and output value and Treatment T3 was significantly higher than the other two，which were more or less the same. In 2013，although the pathogen in the treatments amended with biomanure slowly increased in population，the counts of antagonistic bacteria in the treatments were higher than those of pathogen during the initial 70 days after transplanting，while in 2014，the population of pathogen in Treatment T4 was always kept below the level of 106cfu g-1soil，but the counts of pathogen in all the other treatments grew beyond the level of 107cfu g-1soil，90 days after transplanting and on. Treatment T4 was higher than Treatment T1 in microbial species abundance，operational taxonomic unit（OTU）and Shannon index. Principal component and cluster analysis shows that Treatments T3 and T4 were quite similar，but significantly different from Treatment T1 in microfloral structure. 【Conclusion】The integrated measure，（like Treatment T4）can effectively control tobacco bacterial wilt and significantly improve yield and output value of cured-tobacco，and soil microflora as well，which demonstrates that the measure has a promising application and extension prospect.

Tobacco bacterial wilt；Integrated control measure；Pathogen；Antagonistic bacteria；Rhizosphere microbial balance

S144.1

A

10.11766/trxb201601140582

（責(zé)任編輯：陳榮府）

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41461068）、貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2013］2197、2198）和中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（201410）共同資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41461068），the Science and Technology Foundation of Guizhou Province（No.［2013］2197 and 2198）and the Science and Technology Foundationof Guizhou Tobacco Monopoly Bureau of China（No. 201410）

? 通信作者Corresponding author，E-mail：iversonlyx@163.com

李 想（1982—），遼寧省鞍山市人，博士，副研究員，主要從事土壤養(yǎng)分管理與循環(huán)研究。E-mail：newcool1361214@163.com

2016-01-14；

2016-08-05；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2016-09-21