新疆特色植物恰瑪古塊根內生真菌的分離與鑒定

梁寒峭迪麗達爾·庫德熱提白飛榮苗蕾李南南劉素輝陳建國劉洋孫玉萍

（1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2. 新疆醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院微生物學教研室，烏魯木齊830011；3. 新疆醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，烏魯木齊 830011）

新疆特色植物恰瑪古塊根內生真菌的分離與鑒定

梁寒峭1迪麗達爾·庫德熱提2白飛榮1苗蕾3李南南1劉素輝2陳建國1劉洋1孫玉萍2

（1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2. 新疆醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院微生物學教研室，烏魯木齊830011；3. 新疆醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，烏魯木齊 830011）

植物體的內生真菌與其自身生長及生物防御均有密切關系，因此對健康恰瑪古塊根組織進行內生真菌分離與純化，利用形態(tài)學結合分子鑒定方法對內生真菌群落多樣性進行了初步研究。從恰瑪古塊根中共分離到可培養(yǎng)內生真菌29株，鑒定結果分屬于8個屬的11個種，其中支頂孢屬（Acremonium sp.）和青霉屬（Penicillium sp.）為優(yōu)勢屬，分別占總菌株數(shù)的34.48%和27.59%。為國內外首次對新疆特色藥用植物恰瑪古內生真菌進行分離研究，并對其分類地位進行了確定。

恰瑪古；藥食兼用；內生真菌；群落多樣性

恰瑪古為十字花科（Cruciferae）蕓苔屬蕓苔種的兩年生草本植物蕪菁（Brassica rapa L.）的塊根，是維吾爾重要的藥用植物之一，維吾爾名查木古爾，別名射里節(jié)木、射里海米，全國各地均有栽培，主產于新疆南部地區(qū)。中國醫(yī)學百科全書《維吾爾醫(yī)醫(yī)學分冊》記載，本品性濕熱，味微苦辛甘。功能生濕生熱、補肺止咳、潤腸軟便、營養(yǎng)身體、增強視力、利尿開胃、補腎壯陽、填補精液等，是一種新疆維吾爾等少數(shù)民族喜愛并且有較長食用歷史的傳統(tǒng)藥食同源植物，主治干寒性或黑膽質性疾病，如干性肺虛咳嗽、腸燥便秘、體虛視弱、小便不利、食欲不振，寒性關節(jié)疼痛、腎虛陽痿、精液稀少等［1］。

現(xiàn)代藥理研究表明，恰瑪古具有增強免疫力、抗輻射和抗疲勞等活性，硫代葡萄糖苷、類黃酮和多糖成分是其主要的活性物質［2-5］。然而，目前對恰瑪古的研究多集中于活性物質和功能開發(fā)，對其內生微生物資源的研究工作尚未見報道。而對應內生真菌的研究開發(fā)不僅對于解決植物資源問題意義重大，并且是新型天然產物獲得的重要資源寶庫。塊根是恰瑪古的藥用部位，也是植物的營養(yǎng)器官，對于恰瑪古塊根內生真菌多樣性進行研究，是探索內生真菌與恰瑪古功能性成分關系的前提和基礎，可為進一步開發(fā)和利用維藥恰瑪古資源提供參考。本研究從形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定入手，探討恰瑪古塊根中內生真菌的多樣性，旨為維藥恰瑪古的進一步開發(fā)利用及新的藥用資源開發(fā)提供基礎的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 恰瑪古塊根的采集 恰瑪古（Brassica rapa L.）塊根樣品，于2015年9月采集自中國新疆省烏魯木齊市米東區(qū)古牧地鎮(zhèn)團結村十一小隊，地理位置為北緯87.69°，東經44.02°。樣品于采集后4℃保存，48 h內進行內生真菌分離處理。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 PDA固體成品培養(yǎng)基，購自北京陸橋公司；真菌基因組DNA提取試劑盒及PCR相關試劑，購自TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離、純化 取恰瑪古材料無病癥的塊狀根用自來水沖洗干凈，晾干，依次用70%乙醇30 s，無菌水沖洗3次，次氯酸鈉溶液（2.5%有效Cl-）3 min，無菌水沖洗4次，在無菌條件下晾干［6］；取表面滅菌后的樣品5 g，置于加有少量滅菌的石英砂和碳酸鈣的無菌研缽中充分研磨，再依次稀釋成10-1和10-2兩個濃度梯度，各取0.1 mL涂布于含有0.002%氯霉素的PDA固體培養(yǎng)基平板上，每個梯度3個重復，共5個植株。每日定時觀察，將新生出的菌絲挑取尖端部分轉接至PDA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)直至獲得純菌株。最后再轉接到PDA平板培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)1-2周，供觀察、鑒定和保藏用［2］。同時取最后一次淋洗水0.1 mL涂于含0.002%的氯霉素的PDA固體培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)7 d，檢測表面滅菌效果，以確保表面消毒徹底，保證分離到的菌株確實是內生真菌。

1.2.2 形態(tài)學鑒定 在PDA平板培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)長至平皿3/4時進行觀察。觀察菌落大小、顏色、菌落紋飾、菌絲質地、邊緣；孢子形態(tài)及大小的觀察采用粘膠法［7，8］。分類檢索參照Barnett等［9］方法。

1.2.3 ITS系統(tǒng)發(fā)育分析 采用傳統(tǒng)CTAB抽提法提取內生真菌基因組DNA，以通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增。得到的基因組DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后進行測序，所得序列進行BLAST比對。將每個菌株的ITS序列分別在GenBank數(shù)據庫中搜索同源序列，挑選與靶序列最相近的參考菌種序列，與測定序列一起用Clustal X（1.83）軟件［10］進行序列對齊。利用MEGA5.1［11］的p-distance模型計算進化距離，用 Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并計算bootstrap值。

2 結果

2.1 內生真菌的分離與純化

將恰瑪古塊根表面消毒后粉碎，進行組織內生真菌的分離培養(yǎng)，在PDA平板上陸續(xù)長出大量菌落，菌落形態(tài)存在明顯差異，通過分離純化共得到內生真菌29株。

2.2 形態(tài)學鑒定結果

分離得到的29株內生真菌合并相同菌落形態(tài)和顯微形態(tài)后，共獲得11株內生真菌，其中10株可產生孢子，顯微形態(tài)特征見圖1，形態(tài)學描述見表1。

2.3 分子學鑒定結果

將上述11株內生真菌的ITS序列利用BLAST比對，并與GenBank的相關參考序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）（內生真菌ITS序列在NCBI核酸數(shù)據庫的登錄號為KX588058-588068）。相關序列GenBank登錄號，見表2。從系統(tǒng)發(fā)育樹可見，11株內生真菌分屬于8個屬的11個種，分別為毛霉屬（Mucor sp.）、小球腔菌屬（Leptosphaeria sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）、支頂孢屬（Acremonium sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）、Plectosphaerella sp.、枝孢屬（Cladosporium sp.）。其中支頂孢屬和青霉菌屬為優(yōu)勢屬，分別占總菌株數(shù)的34.48%和27.59%（圖3）。

表1 恰瑪古塊根內生真菌代表菌株形態(tài)描述

3 討論

植物內生真菌是指寄生在健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌［12］。內生真菌與宿主植物是互惠共生的關系，一方面宿主為內生真菌提供其賴以生存的養(yǎng)分和合適的生態(tài)環(huán)境，另一方面真菌會刺激植物自身產生或將植物所含的一部分成分代謝轉換成植物生長發(fā)育過程所必需的養(yǎng)分，或抵抗外界環(huán)境侵害的活性物質，以提高宿主植物的生態(tài)適應性［13，14］。除了通過刺激宿主植物產生應激物質外，還有研究表明內生真菌自身可以產生抗生素或其它次生代謝物以增強宿主植物的防御能力來殺死或抑制病原菌。

圖1 恰瑪古塊根內生真菌代表菌株產孢顯微結構特征圖

表2 恰瑪古塊根內生真菌代表菌株的 ITS rDNA區(qū)序列相似性分析

新疆恰瑪古（蕪菁）作為維藥的重要資源，其內生真菌組成與結構是其道地性的重要影響因素之一，而其內生真菌作為一種重要的可再生自然資源長期以來被人們所忽視。本研究分離培養(yǎng)得到的29株內生真菌分屬于5個綱7個科8個屬11個種，此結果表明恰瑪古塊根的內生真菌數(shù)量和種類均很豐富，支頂孢屬和青霉菌屬為優(yōu)勢菌屬。

有研究表明，從棉花中分離得到小球腔菌屬和支頂孢屬內生真菌對棉花黃萎病致病菌大麗輪枝菌有明顯的抑制作用，其中小球腔菌屬內生真菌在PDA平板上生長緩慢，但其次級代謝產物對致病菌抑制作用很強，鏡檢見其可導致致病菌菌絲結節(jié)、畸形、膨大，抑制率高達88.1%；支頂孢屬內生真菌對致病菌的抑制表現(xiàn)為包圍型，其菌落呈弧形生長，可導致致病菌菌絲纏繞成團，變粗、混亂、無序生長［15］。此外，另有從印度洋深海底泥中分離得到一株支頂孢屬真菌，對膠孢炭疽、綠色木霉、立枯絲核菌、核盤菌和長柄鏈格孢5種常見病原菌均有較好的抑制作用，經研究表明其中蛋白為主要的抑菌活性成分。到目前為止，已從青霉屬和曲霉屬中分離出9種不同的抗真菌肽。這些抗真菌肽對一系列動物和植物致病真菌均有明顯的抗性作用，并且在極端pH、高溫條件下能夠保持很好的穩(wěn)定性，對蛋白酶的降解作用不敏感［16，17］。

圖2 基于 ITS rDNA 序列構建的恰瑪古塊根內生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 恰瑪古塊根中可培養(yǎng)內生真菌所占的比例

本研究結合傳統(tǒng)形態(tài)學分類和分子生物學方法對恰瑪古可培養(yǎng)內生真菌進行了初步研究，這些內生真菌可能參與植物的生長與代謝過程，它們與植物的生長及活性成分的關系還有待于進一步研究。本實驗所研究的恰瑪古內生真菌的群落多樣性對恰瑪古的深度開發(fā)和利用具有重要意義。

4 結論

利用組織塊培養(yǎng)法從健康恰瑪古塊根中分離得到29株內生真菌，通過形態(tài)學結合分子鑒定方法對內生真菌群落進行分類地位確定。結果表明，其分屬于8個屬的11個種，其中支頂孢屬（Acremonium sp.）和青霉屬（Penicillium sp.）為優(yōu)勢屬，分別占總菌株數(shù)的34.48%和27.59%。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from the Rhizomes of Xinjiang-specific Plant Brassica rapa

LIANG Han-qiao1Dilidaer Kudereti2BAI Fei-rong1MIAO Lei3LI Nan-nan1LIU Su-hui2CHEN Jian-guo1LIU Yang1SUN Yu-ping2
（1. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015；2. College of Basic Medical Science，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011；3. Department of Labor Hygiene and Environmental Hygiene，College of Public Health，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

The endophytic fungi in plants are closely related to their own growth and biological defense，therefore，the root tissue of healthy Brassica rapa was selected for isolating and purifying the endophytic fungi，the community diversity of the endophytic fungi were preliminarily studied with morphology and molecular identification method. Twenty-nine strains of endophytic fungi were isolated，and identified as 11 species in 8 genera. The preponderant fungi were Acremonium sp.（34.48%）and Penicillium sp.（27.59%）. This is the first research of isolating endophytic fungi in Xinjiang-specific medical plant B. rapa L.，and its taxonomic status is determined.

Brassica rapa L.；for both of food and medicine；endophytic fungus；phylogenetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.019

2016-06-27

國家自然科學基金資助項目（31300008），新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目（2015211C014），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項目（15院科-博士02）

梁寒峭，女，博士，研究方向：藥用植物及食品原材內生真菌和功效物質研究；E-mail：lianghanqiao@china-cicc.org

劉洋，男，博士，研究方向：植物內生菌，E-mail：ly81150@163.com；孫玉萍，女，博士，研究方向：主要從事教學和科研工作，E-mail：544481723@qq.com