結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄因子基因ZjDREB4.1克隆和逆境表達(dá)模式

李京 吳奇 張琳婕 李旭婷 周敏琪 韋善君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄因子基因ZjDREB4.1克隆和逆境表達(dá)模式

李京 吳奇 張琳婕 李旭婷 周敏琪 韋善君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

以日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）‘Meyer’品種為材料，克隆獲得了1個(gè)DREB（dehydration responsive element binding）類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為ZjDREB4.1。該基因編碼區(qū)長(zhǎng)651 bp，編碼216個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白質(zhì)ZjDREB4.1分子量為22.9 kD，等電點(diǎn)pI為5.74，第50-110位氨基酸組成一個(gè)典型的AP2 保守結(jié)構(gòu)域。在基因的系統(tǒng)發(fā)生樹中，ZjDREB4.1蛋白與擬南芥AtTINY蛋白和玉米ZmDBF2蛋白聚為一支，屬于DREB亞家族A-4組。在葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達(dá)，受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在干旱和高鹽脅迫下表達(dá)先下調(diào)后恢復(fù)至正常水平。

轉(zhuǎn)錄因子；DREB；半定量RT-PCR；非生物脅迫

草坪草作為地被綠化植物，在改善生態(tài)環(huán)境、美化生活中起著重要的作用［1，2］。結(jié)縷草屬（Zoysia Willd.）是一類在全球范圍內(nèi)廣泛種植的暖季型草坪草，系禾本科結(jié)縷草屬植物，它具有發(fā)達(dá)的匍匐莖和根狀莖，葉片厚硬且近革質(zhì)，建成的草坪具有彈性好、耐修剪、耐踐踏、耐鹽堿、抗高溫和抗干旱等優(yōu)良特性［3］，因而被廣泛地用于城市綠地、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪、機(jī)場(chǎng)草坪、水土保持、護(hù)坡護(hù)堤等諸多方面。該屬植物包括11個(gè)種和部分變種、變型，主要分布在太平洋沿岸的東亞、東南亞和澳洲地區(qū)。我國(guó)是結(jié)縷草種質(zhì)資源大國(guó)，分布有5個(gè)種，即日本結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）、細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia Willd.ex Trin.）、大穗結(jié)縷草（Zoysia macrostachya Franch.et Sav.）、中華結(jié)縷草（Zoysiasinica Hance）和溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella（L.）Merr.）［3］。山東省膠州灣和遼寧省的遼東半島是我國(guó)結(jié)縷草天然種質(zhì)資源的主要分布地，也是我國(guó)結(jié)縷草種子生產(chǎn)的重要基地。長(zhǎng)期以來，開發(fā)結(jié)縷草種質(zhì)資源、培育優(yōu)良新品種，一直是我國(guó)草坪草育種的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

自然條件下，干旱、低溫和高鹽堿等非生物逆境是影響草坪建植和養(yǎng)護(hù)的重要因素［4］。研究逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，培育抗逆性強(qiáng)的品種，一直是結(jié)縷草育種研究中的重要內(nèi)容。對(duì)擬南芥、水稻以及其他多種植物的研究結(jié)果表明，植物感受逆境信號(hào)后調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)［5］，從而進(jìn)行一系列生理生化調(diào)節(jié)以應(yīng)對(duì)逆境［6］。根據(jù)功能，逆境應(yīng)答基因可分為兩大類：一類是編碼功能蛋白基因，包括一些滲透調(diào)節(jié)物合成基因、抗氧化酶基因和抗脫水蛋白基因等，主要起保護(hù)細(xì)胞免受脅迫損傷的作用；另一類是調(diào)節(jié)基因，包括轉(zhuǎn)錄因子、激酶基因等，它們參與應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)［7］。轉(zhuǎn)錄因子由于調(diào)節(jié)多個(gè)功能基因的表達(dá)，在逆境響應(yīng)中起重要作用。已報(bào)道的植物逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子包括AP2/EREBP類［8］、bZIP類［9］、MYB類［10］、WRKY 類［11］和NAC類［12］。其中，屬于AP2/EREBP類 的 DREB（dehydration responsive element binding）亞家族基因研究得最深入，它們參與抵抗干旱、低溫和高鹽脅迫應(yīng)答。DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子均含有1個(gè)由57-70個(gè)左右氨基酸殘基組成的保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，分為A-1-A-6六個(gè)亞組［13］。DREB1和DREB2，即A-1和A-2亞組，與逆境響應(yīng)關(guān)系最密切，在林木［14］、果樹［15］、禾谷類作物［16］、觀賞植物［17］、草坪草［18］等種類中均有研究報(bào)道。除此以外，DREB A-4亞組的一些基因，包括擬南芥中的TINY1［19］和 TINY2［20］、棉花中的GhDBP3基因［21］、玉米中的ZmDBF2基因［22］和大豆中的GmTINY1基因［23］，它們的表達(dá)受低溫脅迫、干旱脅迫和植物激素ABA、乙烯等不同程度的誘導(dǎo)。超表達(dá)TINY的擬南芥突變體表現(xiàn)出了植株矮小、葉厚、胚軸縮短、雌蕊和花絲縮短、花藥位置低于柱頭等性狀［24］。轉(zhuǎn)化了川桑（Morus notabilis）MnDREB4A基因的煙草葉片保水能力更強(qiáng)，衰老速度減慢，植株抗低溫、高鹽和干旱的能力也有所增強(qiáng)［25］。這些研究結(jié)果說明DREB亞家族A-4亞組成員也參與植物的逆境應(yīng)答，具有抗逆功能。已有的研究結(jié)果為結(jié)縷草逆境響應(yīng)分子調(diào)節(jié)研究提供了方向。

日本結(jié)縷草‘Meyer’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，結(jié)縷草有多個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，但是它們?cè)诘挚鼓婢持械淖饔蒙形从邢到y(tǒng)的研究［26］，目前僅有一個(gè)DREB1［27］和兩個(gè)DREB2［28，29］基因序列和功能報(bào)道。根據(jù)結(jié)縷草‘Meyer’轉(zhuǎn)錄組的注釋信息，其中有一個(gè)拼接序列可能是DREB4基因。本研究在該序列推測(cè)閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物，克隆獲得結(jié)縷草第一個(gè)DREB4基因，命名為ZjDREB4.1。利用生物信息學(xué)軟件分析該基因的生物信息學(xué)特征，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)低溫、干旱和高鹽脅迫下葉組織中ZjDREB4.1的表達(dá)狀況，構(gòu)建ZjDREB4.1的植物表達(dá)載體，為后續(xù)研究其功能提供理論參考和研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

日本結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）品種‘Meyer’ 由中國(guó)科學(xué)院南京植物所劉建秀研究員惠贈(zèng)。材料種植于培養(yǎng)室中，栽培基質(zhì)為珍珠巖∶蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土按1∶1∶2比例的混合物，培養(yǎng)溫度25℃/20℃（L/D），光周期14 h/d，正常管理。選取生長(zhǎng)狀態(tài)相近的材料，分別進(jìn)行逆境處理。低溫處理是將材料轉(zhuǎn)移到低溫生長(zhǎng)箱中，培養(yǎng)溫度6℃/4℃（L/D），光強(qiáng)6 000 lux。分別用含有20% PEG-6000和300 mmol/L NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌根部模擬干旱和高鹽脅迫。逆境處理時(shí)間梯度為2、12、24和72 h。以培養(yǎng)室內(nèi)未處理材料為對(duì)照（0 h，CK）。取植株頂端第1-2片展開葉，液氮速凍后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

總RNA抽提試劑TRIpure Reagent、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒和pUM-T 載體均購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自Promega公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。DNA限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo 公司。實(shí)驗(yàn)用引物（表1）合成及測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 cDNA合成及DNA提取 采用TRIpure Reagent 總RNA抽提試劑提取各樣品中的總RNA。RNA經(jīng)電泳檢測(cè)完整性、Nanodrop測(cè)定濃度。以檢測(cè)合格的總RNA為模板，以O(shè)ligo dT 為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。以 actin1 為內(nèi)標(biāo)基因，用 cDNA 特異性引物Pactin-F 和 Pactin-R（表1）對(duì) cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果?？侱NA的提取采用CTAB法［30］。

1.2.2 基因的克隆 分別以4℃脅迫2 h的cDNA和基因組DNA為模板，用引物P4.1-F和P4.1-R（表1）擴(kuò)增目的基因的編碼區(qū)序列，反應(yīng)體系為（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，P4.1-F和P4.1-R各2 μL（10 μmol/L），cDNA或DNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，并回收接近700 bp的特異性產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與T載體（pUMT）連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑進(jìn)行液體培養(yǎng)，取菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)。隨機(jī)挑取2個(gè)PCR陽(yáng)性的菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定克隆的基因序列完全正確。

表1 引物序列及用途

1.2.3 基因的生物信息學(xué)分析 采用生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的ZjDREB4.1序列進(jìn)行相關(guān)分析，具體分析目標(biāo)及選用的軟件見表2。

表2 ZjDREB4.1基因的生物信息學(xué)分析使用的相關(guān)軟件

1.2.4 基因的表達(dá)分析 采用半定量RT-PCR分析葉片中ZjDREB4.1在低溫、干旱以及高鹽3種脅迫下的表達(dá)動(dòng)態(tài)。以cDNA為模板，先用Pactin-F和Pactin-R對(duì)內(nèi)參基因actin1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，Pactin-F和Pactin-R各2 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min； 94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確定條帶亮度基本一致時(shí)各處理的cDNA用量。然后以該用量的cDNA為模板，用ZjDREB4.1基因特異性引物P1和P2（表1），參照以上擴(kuò)增體系進(jìn)行34個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，比較各處理?xiàng)l帶亮度。

2 結(jié)果

2.1 ZjDREB4.1基因全長(zhǎng)的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息，在預(yù)測(cè)的基因CDS兩端設(shè)計(jì)引物，分別以4℃低溫處理2 h的cDNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）均獲得了大小在500-750 bp之間的特異帶。將該核酸片段克隆到T載體上，測(cè)序結(jié)果顯示，兩種模板擴(kuò)增的核酸序列相同，且與轉(zhuǎn)錄組中的基因序列完全一致，說明該基因沒有內(nèi)含子。

圖1 ZjDREB4.1基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 ZjDREB4.1基因序列分析

ZjDREB4.1基因CDS長(zhǎng)651 bp，編碼一條由216個(gè)氨基酸殘基組成的多肽（圖2）。推測(cè)的平均蛋白質(zhì)分子量為22.9 kD，理論pI為5.74。蛋白的分子式組成為C996H1556N290O319S7，其中丙氨酸（Ala）含量最高，為15.7%，其次為絲氨酸（Ser，12.0%）、脯氨酸（Pro，10.2%）和天冬酰胺（Asp，7.9%），酪氨酸（Tyr）含量最低，為0.9%。利用ExPASy分析該蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20和10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為47.80（40以上為穩(wěn)定蛋白），推測(cè)為穩(wěn)定蛋白。

在NCBI網(wǎng)站上對(duì)ZjDREB4.1蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在50-110位氨基酸之間含有一個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域（conserved AP2 domain）。cNLS Mapper分析顯示，蛋白ZjDREB4.1有兩個(gè)核定位信號(hào)，分別位于第32-40和第66-80位氨基酸區(qū)間（圖2）；SignalP 3.0 Server軟件分析確定ZjDREB4.1不具有信號(hào)肽，推測(cè)ZjDREB4.1為核定位蛋白。NetPhos軟件分析顯示，ZjDREB4.1蛋白存在絲氨酸和蘇氨酸2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化數(shù)目不同，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)20個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)4個(gè)（圖2）。用ProtScale分析該序列的親/疏水性，結(jié)果表明，在多肽鏈第38位精氨酸（Arg）有最低分值-3.333，親水性最強(qiáng)；第132位賴氨酸（Lys）有最高分值2.422，疏水性最強(qiáng)。親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，故該肽鏈表現(xiàn)為親水性。利用CFSSP預(yù)測(cè)ZjDREB4.1二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊片為主，其中α-螺旋含量達(dá)到64.8%，還含有一部分的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲（圖3-A）。SWISS-MODEL server 在線模型預(yù)測(cè)顯示，ZjDREB4.1的第49-110位氨基酸與數(shù)據(jù)庫(kù)中的14個(gè)模型相匹配，其中與3gcc.1模型相似度最高（61.4%）。以3gcc.1為模板建立的ZjDREB4.1結(jié)構(gòu)模型顯示，其結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)反向平行的β-sheet和一個(gè)與β-sheet幾乎平行的α-helix（圖3-B）。

2.3 ZjDREB4.1蛋白的同源性及系統(tǒng)發(fā)生樹分析

利 用NCBI上 的BLAST對(duì)ZjDREB4.1氨 基酸序列進(jìn)行同源檢索，結(jié)果表明，該基因與已報(bào)道的多種植物的DREB類轉(zhuǎn)錄因子高度相似。將ZjDREB4.1與其6個(gè)直系同源基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖4）表明，它們的AP2結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，而在C端和N端均有較大差異性。選取模式植物擬南芥DREB A-1-A-6基因和其他6種植物的部分DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，通過DNAMAN軟件對(duì)它們的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果（圖5）顯示ZjDREB4.1屬于DREB亞家族的A-4亞組，與水稻的OsDREB4.4遺傳距離最近。進(jìn)化樹中A-4亞組的10個(gè)同源基因明顯地分為3個(gè)分支，水稻的4個(gè)基因分別歸屬到3個(gè)分支中。在第一個(gè)分支中含有單、雙子葉植物的同源基因，但兩類明顯地分開；ZjDREB4.1與水稻的OsDREB4.1/4.4、玉米的ZmDBF2和小麥的TmCBF7同屬第二分支；而水稻OsDREB4.2為一個(gè)單獨(dú)的分支。說明植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子A-4亞組一些成員的出現(xiàn)可能在單、雙子葉植物分化之前。

圖2 ZjDREB4.1基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

圖3 ZjDREB4.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和模型預(yù)測(cè)

2.4 ZjDREB4.1基因表達(dá)模式分析

以actin1為內(nèi)參，采用半定量RT-PCR技術(shù)比較ZjDREB4.1在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)量變化。結(jié)果（圖6）表明，ZjDREB4.1在正常條件下有表達(dá)；在低溫脅迫2-72 h時(shí)間內(nèi)上調(diào)表達(dá)，其中在2 h和72 h表達(dá)水平較高；在干旱和高鹽脅迫下，2-24 h時(shí)間內(nèi)均下調(diào)表達(dá)，72 h后恢復(fù)至接近正常水平，說明ZjDREB4.1是結(jié)縷草葉組織的正常表達(dá)基因，受低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在干旱和高鹽脅迫72 h后保持正常表達(dá)。

圖4 ZjDREB4.1與其他同源基因氨基酸序列比較

3 討論

DREB類轉(zhuǎn)錄因子與植物抵抗非生物脅迫關(guān)系密切，調(diào)控多個(gè)抗逆功能基因的表達(dá)，參與植物的抗逆活性調(diào)節(jié)［31，32］。結(jié)縷草是一種多耐逆的優(yōu)質(zhì)草坪草，研究其DREB基因結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)模式可為該屬植物的抗逆機(jī)制提供分子參考。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，日本結(jié)縷草中含有DREB轉(zhuǎn)錄因子A-1-A-6亞組多個(gè)基因，部分基因與低溫脅迫應(yīng)答相關(guān)［26］。Wang等［28］從結(jié)縷草‘Meyer’中克隆獲得了首個(gè)DREB A-2亞組基因，過量表達(dá)該基因的擬南芥植株的抗寒能力明顯增強(qiáng)?？上榈龋?9］以結(jié)縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得了第2個(gè)DREB A-2亞組基因ZjDREB2.2，其表達(dá)量受低溫和干旱誘導(dǎo)上調(diào)。馮勛偉和才宏偉［27］以日本最北部原產(chǎn)的結(jié)縷草品系為材料，克隆獲得了結(jié)縷草首個(gè)DREB A-1亞組基因ZjCBF，超表達(dá)該基因的擬南芥植株的抗寒性明顯高于野生型。本研究以結(jié)縷草‘Meyer’為實(shí)驗(yàn)材料，克隆獲得該屬植物的首個(gè)DREB A-4亞組基因，命名為ZjDREB4.1。ZjDREB4.1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)651 bp，沒有內(nèi)含子。已報(bào)道的川桑（Morus notabilis）［25］、毛果楊（Populus trichocarpa）［33］、水稻（Oryza sativa）［34］的DREB A-4組基因也沒有內(nèi)含子。說明DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族中，A-4組與A-1基因的結(jié)構(gòu)相似［35］，而與A-2類基因不同，后者通常含有一至多個(gè)內(nèi)含子［28，36］。

圖5 ZjDREB4.1的系統(tǒng)發(fā)生樹

推測(cè)的ZjDREB4.1蛋白含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)模型與擬南芥的AtERF1基因的AP2結(jié)構(gòu)域的模型（3gcc.1）高度相似［37］。AtERF1屬于乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Ethylene-responsive element binding proteins，EREBPs），這些蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域高度保守，可以結(jié)合以GCCGCC為核心的ERE元件（簡(jiǎn)稱GCC-box）［38］。擬南芥的AtTINY、AtTINY2還可以結(jié)合以CCGAC為核心序列的DRE元件。對(duì)不同DREB基因的AP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域的第14位纈氨酸（V14）和第19位谷氨酸（E19）對(duì)識(shí)別和結(jié)合DRE順式元件至關(guān)重要［13］，而第15位的絲氨酸（S15）與識(shí)別ERE元件相關(guān)［19］。ZjDREB4.1 的AP2結(jié)構(gòu)域具有V14、E19和S15的結(jié)構(gòu)特征，其對(duì)ERE和DRE元件結(jié)合活性有待鑒定。

圖6 不同逆境脅迫下ZjDREB4.1的表達(dá)模式

已報(bào)道的DREB A-4組基因中，有一些基因的表達(dá)受非生物脅迫調(diào)節(jié)。擬南芥AtTINY基因在根和葉中的表達(dá)幾乎不受干旱、高鹽、低溫和ABA的誘導(dǎo)［19］，但是AtTINY2基因在正常生長(zhǎng)條件下幾乎不表達(dá)，在低溫、干旱和高鹽脅迫下其表達(dá)量會(huì)上升［20］。水稻OsDREB4.1基因?yàn)榻M成型表達(dá)，OsDREB4.2和OsDREB4.3受干早和高鹽誘導(dǎo)，但不受低溫影響［34］。玉米ZmDBF2基因在低溫和高鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)［22］。川桑MnDREB4A基因在葉中主要響應(yīng)低溫脅迫，在12-24 h時(shí)達(dá)到峰值，然后降低［25］，而在根中對(duì)4種脅迫（高溫、低溫、高鹽、干旱）幾乎都有響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)縷草葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達(dá)，低溫逆境誘導(dǎo)其上調(diào)表達(dá)，在干旱和高鹽脅迫2-24 h時(shí)表達(dá)水平下降，72 h后恢復(fù)到正常水平。該逆境響應(yīng)模式與已報(bào)道同源基因有差異，這也體現(xiàn)了不同植物同類基因在表達(dá)調(diào)節(jié)上有差異，這種差異可能與植物的抗逆特征相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究報(bào)道了結(jié)縷草的DREB 類轉(zhuǎn)錄因子A-4組的一個(gè)基因ZjDREB4.1。該基因具有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，與EREBP的AP2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型高度相似。葉組織中ZjDREB4.1為組成型表達(dá)，受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在干旱和高鹽脅迫72 h后保持正常表達(dá)。

［1］任繼周. 草坪業(yè)是我國(guó)全民共有、全民共建、全民共享的偉大事業(yè)——在中國(guó)草學(xué)會(huì)草坪專業(yè)委員會(huì)第七屆全國(guó)代表大會(huì)暨十一屆學(xué)術(shù)研討會(huì)上的發(fā)言［J］. 草地學(xué)報(bào), 2008, 16（6）：545-546.

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Profiles of a Transcription Factor Gene ZjDREB4.1 in Zoysia japonica Under Adversity

LI Jing WU Qi ZHANG Lin-jie LI Xu-ting ZHOU Min-qi WEI Shan-jun
（College of Life and Environmental Science，Minzu University of China，Beijing 100081）

A novel DREB（dehydration responsive element binding）transcription factor gene，designated as ZjDREB4.1，was isolated from cultivar ‘Meyer’ of Zoysia japonica. The open reading frame（ORF）of ZjDREB4.1 was 651 bp in length，encoding 216 amino acid residues. The putative protein ZjDREB4.1 was 22.9 kD in molecular weight and with a theoretical isoelectric point（pI）of 5.74. Amino acids from the 50thto the 110thwere predicted to build up a conserved AP2 domain. The phylogenetic tree analysis showed that ZjDREB4.1 was grouped with AtTINY of Arabidopsis thaliana and ZmDBF2 of maize，belonging to the A-4 group of DREB subfamily. ZjDREB4.1 was expressed constitutively in leaves. The expression was up-regulated under cold stress，and was first down-regulated then returned to normal level under drought and salt stresses.

transcription factor；DREB；semi-quantitative PCR；abiotic stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.012

2016-06-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100507），國(guó)家大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（GCCX2016110016）

李京，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：horsel@126.com

韋善君，女，博士，講師，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)；E-mail：wei.s.j@163.com