基于全基因組的毛竹同義密碼子使用偏好性分析

黃笑宇，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

基于全基因組的毛竹同義密碼子使用偏好性分析

黃笑宇，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

密碼子使用偏好性是物種在遺傳信息傳遞過程中的一個重要特點，分析物種的密碼子使用偏好性對于了解該物種遺傳信息的傳遞規(guī)律具有重要意義。應用CodonW軟件對毛竹Phyllostachys edulis基因組中的26 103個蛋白質(zhì)編碼基因序列進行了分析，計算了位于密碼子3個位置的G＋C含量、有效密碼子數(shù)、同義密碼子的使用頻率等，確定了毛竹的最優(yōu)密碼子。結果顯示：毛竹密碼子第1位和第3位的G＋C含量明顯高于第2位，表現(xiàn)出對以G或C堿基開頭和結尾的密碼子發(fā)生強烈偏向使用，且確定的26種最優(yōu)密碼子均以G/C堿基結尾。與模式動植物酵母Saccharomys cerevisiae，大腸埃希菌Escherichia coli，果蠅Drosophila melanogaster，擬南芥Arabidopsis thaliana，煙草Nicotiana tabacum，水稻Oryza sativa，玉米Zea mays，小麥Triticum aestivum等8個代表性物種進行比較，結果顯示：毛竹密碼子偏好性與模式動植物存在不同程度的差異，與大腸埃希菌、酵母、果蠅、擬南芥、煙草和玉米的差異較大，差異分別為8個、11個、6個、7個、6個和6個，而與小麥的差異較?。?個），與水稻完全一致。密碼子偏好性差異大小在一定程度上反映物種間的進化關系。圖1表4參29

植物學；毛竹；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子

三聯(lián)密碼子是整個生物王國的核心，作為最基本的編碼組分編碼特定的氨基酸。除了甲硫氨酸Met和色氨酸Trp外，同一個氨基酸會由2~6個同義密碼子編碼［1］。根據(jù)中心法則，盡管同義突變不會引起蛋白序列的變化，但同義密碼子使用偏好性在基因組內(nèi)和基因組間廣泛存在［2－4］。密碼子使用偏好性是物種在遺傳信息傳遞過程中的一個重要特點，分析物種的密碼子使用偏好性對于了解該物種遺傳信息的傳遞規(guī)律具有重要意義。密碼子使用偏好性的研究有助于更好地理解分子生物及進化，信使核糖核酸（mRNA）翻譯，轉基因設計，新基因發(fā)現(xiàn)，以及其他生物應用［3－6］。幾十年來，大量模式物種如擬南芥Arabidopsis thaliana，水稻Oryza sativa，果蠅Drosophila melanogaster，楊樹Populus trichocarpa等的測序產(chǎn)生了大量的開放閱讀框，這些全長編碼序列作為密碼生物學的基礎，為研究密碼子使用模式提供了強有力的保障。隨著深度測序技術的快速發(fā)展，非模式植物也紛紛被測序，產(chǎn)生了大量的序列，有關密碼子使用模式的工作也逐漸拉開序幕［7］。毛竹Phyllostachys edulis為禾本科Gramineae多年生木本植物，地上部分可材用，地下部分發(fā)育的筍可食用。毛竹基因組序列測定［8］，產(chǎn)生了大量基因組及編碼區(qū)序列，為研究毛竹密碼子的使用情況提供了大量的信息。本研究通過分析毛竹全基因組編碼序列數(shù)據(jù)，了解毛竹基因密碼子用法特征，并與不同代表性物種進行比較。這些分析有助于我們理解毛竹的密碼子模式，提升植物密碼子使用的研究，同時為毛竹基因選擇合適的表達系統(tǒng)，優(yōu)化密碼子提高基因表達量等提供重要理論基礎。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

從http://202.127.18.221/bamboo/index.php的毛竹基因組注釋數(shù)據(jù)中獲取了31 987條蛋白質(zhì)對應的編碼基因序列（coding DNA sequence，CDS），從中挑選出以ATG為起始密碼子，以TAA，TAG或TGA為終止密碼子的，且CDS長度大于300 bp的26 103個基因作為序列分析樣本［9］。這個數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)去除所有假基因的信息。

1.2 序列處理

采用C語言編寫程序進行序列篩選與處理。

1.3 同義密碼子使用偏好性分析

采用EMBOSS軟件包中的CHIPS和CUSP程序在線http://emboss.bioinformatics.nl及CodonW1.4.4（http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::codonw）對毛竹全基因編碼序列進行分析，計算有效密碼子數(shù)（effective number of codons，Enc），CDS區(qū)的GC含量，密碼子中第3位堿基的GC含量（GC3s），同義密碼子相對使用頻率（relative synonymous codon usage，RSCU）及密碼子使用概率。

衡量同義密碼子使用偏好性參數(shù)的含義：①有效密碼子數(shù)（Enc）。該值被認為是在評價基因整體密碼子偏好性用法中最具有參考價值的參數(shù)之一，目前被廣泛用于評價基因密碼子偏好性，其取值范圍為20（每個氨基酸只使用1個密碼子的極端情況）到61（各個密碼子均被平均使用）［10］。②同義密碼子相對使用頻率RSCU。該值的計算方法為某一密碼子所使用的頻率與其在無偏好使用時預期頻率之間的比值，若某一密碼子的RSCU值等于1，則表明該密碼子的使用沒有偏好性；RSCU值大于l，表明該密碼子的使用頻率相對較高，反之亦然。它去除了氨基酸組成對密碼子使用的影響，且直觀地反映了密碼子使用的偏好性［11］。③同義密碼子使用的絕對頻率（Fract）。該值表示各個密碼子在編碼該氨基酸的密碼子中所占的比例（各比例相加總和為1）［12］。

1.4 最優(yōu)密碼子的確定

采用STENICO等［13］的方法，把密碼子使用偏好性強和弱的2組基因之間相應密碼子出現(xiàn)頻率之差達到統(tǒng)計學上顯著水平的密碼子定義為最優(yōu)密碼子。具體方法如下：通過計算樣本中每個基因的有效密碼子數(shù)，并按該值的大小對基因進行排列，從這一排列的兩端各取基因樣本總數(shù)的5%，分別組成高、低表達樣本組。計算這2組基因的相對密碼子使用度，并進行卡方檢驗，確定最優(yōu)密碼子［14］。

1.5 毛竹與其他物種密碼子偏好性比較

運用CUSP程序計算毛竹基因各密碼子的使用頻率，并與從Codon Usage Database（http://www.kazusa. or.jp/codon/）中獲得的果蠅，酵母Saccharomys cerevisiae，大腸埃希菌Escherichia coli，擬南芥，煙草Nicotiana tabacum，水稻，玉米Zea mays，小麥Triticum aestivum等的密碼子使用頻率進行比較。密碼子使用頻率若為 0.5~2.0，表明這2個物種對該密碼子的偏好性較接近，若≥2.0或≤0.5，則表明偏好性差異較大［15］。

1.6 基于密碼子使用偏好性的聚類

利用SPSS 19.0對毛竹及其他9個物種進行基于密碼子使用偏好性的聚類分析，方法參考文獻［15］。

2 結果與分析

2.1 有效密碼子數(shù)與密碼子的堿基組成

將毛竹基因組注釋數(shù)據(jù)中獲取到的31 987條蛋白質(zhì)對應的編碼基因序列進行篩選后，獲得26 103條有效序列，將這些序列作為一整體，在線計算了其有效密碼子數(shù)及密碼子第1位、第2位、第3位和3個位置平均的堿基GC百分率，結果見表1。毛竹基因整體的有效密碼子數(shù)為57.88，表明毛竹整體基因的密碼子存在一定程度偏好，但偏好性不強。從密碼子的GC含量來看，3個位置平均GC含量為0.52。其中，GC1含量為0.56，比GC2（0.44）高0.12，而GC3含量（0.57）比GC1略高0.01，表明選擇壓力使得毛竹密碼子的第1位傾向于選擇G/C，第2位傾向于選擇T/A，第3位可以有大幅擺動。

表1 毛竹基因密碼子中3個位置的GC含量及有效密碼子數(shù)值Table 1 GC content of different positions and effective number of codons in Phyllostachys edulis

2.2 同義密碼子的使用頻率

經(jīng)軟件計算的同義密碼子使用次數(shù)及頻率結果見表2。在64個密碼子中，GAG是出現(xiàn)次數(shù)最高的密碼子，絕對頻率為39.21，是毛竹平均頻率的2.51倍；緊隨其后的是AAG，達到33.90；處于第3位的是GAU，為28.40；CGA的出現(xiàn)頻率最低，僅為5.34，是毛竹平均頻率的1/3；另有6個密碼子（UUA，CUA，GUA，ACG，UGU，CGU）的頻率小于10.00（表2）。

有34個密碼子的RSCU值大于1，這些密碼子為毛竹基因的偏好密碼子，其中約1/3的密碼子以A/U結尾，2/3的密碼子以G/C結尾。AGG（編碼Arg），CUC（編碼Leu）和GUG（編碼Val）的RSCU值處于前3位，分別為1.57，1.45和1.39。CUG（編碼Cys）以及AAG（編碼Lys）和GGC（編碼Gly）相對于其同義密碼子的使用頻率高，分別為1.36和1.31。這5個密碼子為本文的高頻率密碼子。

4個NUA密碼子的RSCU值最低，AUA為0.69，CUA為0.52，GUA為0.47，UUA為0.45，表明這幾個是毛竹基因避免使用的密碼子。4個NCG的RSCU值相對來說接近于平均水平甚至更低，CCG為0.99，GCG為0.91，ACG為0.76，UCG為0.75，表明毛竹體內(nèi)的甲基化水平可能較低或中等，這點從NCG∶NCC的比值（為0.82）也可看出。終止密碼子UGA在毛竹基因中的使用頻率較其余2個終止密碼子高，為1.02，其次是UAG，RSCU值為0.67，UAA的使用頻率最低，僅為0.55。

2.3 最優(yōu)密碼子的確定

不僅同義密碼子間存在偏好性，且密碼子本身的使用也存在偏好性。目前，關于毛竹基因表達的數(shù)據(jù)偏少，多數(shù)轉錄組測序的數(shù)據(jù)也基于幾個毛竹的特異組織。因此，本研究依據(jù)Enc值來衡量基因的表達量。表3中的結果是通過計算高表達/低表達基因之間同義密碼子相對使用頻率之差，經(jīng)卡方測驗確定的毛竹中的最優(yōu)密碼子，用*號標記，共26個。這些密碼子均以G/C結尾，表明在高表達基因中優(yōu)先使用這些密碼子。這些密碼子的使用頻率在高表達基因組與低表達基因組之間的差異達到極顯著水平。

2.4 毛竹與模式動植物密碼子偏好性比較

將毛竹與3種模式生物大腸埃希菌、酵母和果蠅密碼子使用頻率比較，比值0.5~2.0表明2物種使用該密碼子的偏好性相似，比值小于0.5或大于2.0，表明該密碼子的使用偏好性差異較大。結果顯示：毛竹與大腸埃希菌、酵母和果蠅密碼子的比值中，分別有8，11，6個小于0.5或大于2.0，表明毛竹與這些模式生物之間的密碼子偏好性存在一定差異。

表2 毛竹基因同義密碼子的使用頻率Table 2 Frequency of synonymous codons in genes of Phyllostachys edulis

表4的結果顯示：毛竹與雙子葉植物的代表種擬南芥和煙草的密碼子偏好性差異性較大，比值大于2.0或小于0.5的分別有7個和6個，與同科植物相比，與C4植物玉米的密碼子偏好性差異也較大，有6個，而與C3植物水稻和小麥的偏好性一致。

2.5 不同物種間密碼子偏好性的聚類分析

根據(jù)各物種編碼序列密碼子的使用頻率，利用SPSS 19.0進行聚類分析（圖1）。從圖1可以看出：雙子葉植物擬南芥和煙草密碼子使用偏好更相近，禾本科植物毛竹與水稻的最近，其次與小麥和玉米。利用密碼子使用頻率得出的聚類結果一定程度上反映了各物種間的進化關系。

表3 毛竹中高/低表達樣本的密碼子用法Table 3 Codon usage of high/low expressed genes in Phyllostachys edulis

3 討論

在長期的進化過程中，不同物種對進化環(huán)境和選擇壓力的適應不同，因此，任何一個物種都會形成特定的密碼子用法以適應其基因組環(huán)境，最終使其宿主適應外界進化環(huán)境。由此，不同物種就形成了各自特定的密碼子偏好性。若要通過基因工程技術改造某一物種或?qū)⒛骋换蛴糜隗w外表達，應先按照宿主的密碼子使用偏好性對所導入的基因進行優(yōu)化和改造。本研究在毛竹全基因組測序的基礎上，對編碼蛋白基因的密碼子偏好性進行了分析，結果表明與很多物種包括人、細菌、酵母、果蠅、玉米、草菇Volvariella volvacea等相似［15－16］，毛竹基因密碼子偏好使用G/C結尾的密碼子，這種密碼子使用偏好性有利于保證翻譯的準確性［17－18］，但與同為植物界的雙子葉植物相比，密碼子使用偏好性差異較大，雙子葉植物偏好使用以A或T結尾的密碼子［14,19－20］。

圖1 基于不同物種密碼子使用頻率的聚類分析Figure 1 Cluster analysis dendrogram of frenquency of codon usage of different species

表4 毛竹與模式植物的密碼子偏好性比較Table 4 Comparison of codon preference between bamboo and other model plants

表4 （續(xù)）Table 4 Continued

從GC含量上看，很多植物的密碼子的GC1含量均比GC2高，兩者含量的差異達到0.096（Medicago truncatula）~0.155（Micromonas pusilla RCC299）。裸子植物、單子葉植物、綠藻等物種GC3的含量一般來說略高于GC1［7］。本研究中的毛竹GC1含量比GC2高0.12，而GC3含量比GC1高0.01，表明選擇壓力對毛竹密碼子不同位置的堿基組成影響不同。不同物種中GC3會隨著進化不同而發(fā)生變化［7,21－22］。一般來說，原始的單細胞或多細胞綠色植物GC3含量會比較高，為0.690~0.854，苔蘚植物為0.481~0.578，而被子植物GC3s的含量變異差異比較大，單子葉植物的變異范圍為0.581~0.609，優(yōu)等雙子葉植物的變異范圍為0.335~0.482。本研究中毛竹GC3s為0.52，超出了單子葉植物的變異范圍。這樣的特例在其他物種中也有發(fā)生，如萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，團藻Volvox carteri和 細小微胞藻Micromonas pusilla［7］。

本研究用CodonW軟件分析了毛竹同義密碼子的RSCU值，發(fā)現(xiàn)AGG，CUC，GUG，AAG和UGC 5個密碼子為本文的高頻率密碼子。而4個NUA密碼子RSCU值較低，AUA為0.69，CUA為0.52，GUA為0.47，UUA為0.45，表明毛竹基因避免使用UA密碼子，同一現(xiàn)象在其他物種中也發(fā)現(xiàn)，可能因為低含量的UA抑制了mRNA的降解，提高蛋白產(chǎn)物或產(chǎn)量［23］。毛竹中終止密碼子的使用以UGA的使用頻率最高，與大多數(shù)植物相吻合［24］。

NCG∶NCC的比值已廣泛用于評估CpG抑制，反映了編碼區(qū)甲基化水平，尤其在真雙子葉植物。甲基化水平低的物種往往其 NCG∶NCC的比值相對較高，如擬南芥（0.921），深山南芥 Arabis lyrata（0.93）；而高甲基化水平的物種，該比值相對較低，如葡萄Vitis vinifera（0.414），楊樹（0.463）；甲基化程度中等的物種；該比值中等，如蘋果Malus×domestica（0.639），番茄Solanum lycopersicon（0.634）。毛竹中該比值為0.819 7，表明毛竹為低甲基化水平的物種。由此可以判斷：甲基化水平對毛竹的生長發(fā)育過程影響有限［7］。

本研究使用同義密碼子相對使用頻率（RSCU）方法鑒定出26個最優(yōu)密碼子，全部以G/C結尾，毛竹編碼蛋白序列的GC含量平均為52.4%，因此，本研究結果符合一般規(guī)律，即富含GC堿基的基因組中最優(yōu)密碼子也富含GC［2,25］。通過比較某一特定基因與外源表達系統(tǒng)之間的密碼子使用偏好性差異，從而分析是否會引起甲基化，導致基因表達量下降或基因沉默［26］，從而改造密碼子以提高外源基因在宿主中的表達［27－29］。本研究將毛竹基因組密碼子的偏好性與模式動植物大腸埃希菌、酵母、果蠅、擬南芥、煙草、玉米、水稻和小麥待密碼子偏好性相比，結果表明：毛竹與不同物種的差異程度不同，其中與大腸埃希菌和酵母的差異最大，而與同科C3植物水稻和小麥的偏好性一致。因此，要將毛竹基因進行體外表達時，需要通過密碼子的改造，來提高表達效率。若要將毛竹基因用于水稻和小麥中表達時，可以不用經(jīng)密碼子優(yōu)化直接進行外源基因表達。本研究的聚類結果表明：密碼子偏好性差異大小在一定程度上反映物種間的進化關系，與傳統(tǒng)分類有一定的吻合性，但不完全吻合，這與其他物種的基于密碼子偏好性聚類的結果類似［4,15］，很可能是因為參數(shù)選擇單一造成的。該研究結果可為毛竹基因外源表達選擇合適的受體提供理論基礎，同時，還為將毛竹基因轉入模式生物中進行功能驗證提供基礎資料。

4 結論

本研究對毛竹基因組中的26 103個蛋白質(zhì)編碼基因序列進行了分析，根據(jù)同義密碼子相對使用頻率（RSCU值）確定了毛竹中的最優(yōu)密碼子26個，且均以G/C結尾。同時與模式動植物9個代表性物種進行了比較，毛竹密碼子偏好性與水稻完全一致。

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Synonymous codon bias of Phyllostachys edulis

HUANG Xiaoyu,XU Zaien,GUO Xiaoqin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Analysis of codon usage bias for different species,an important characteristic of genetic information transfer in organisms,is important for understanding the rules of genetic information transfer.To better understand the characteristics of Phyllostachys edulis,coding DNA sequences （CDS）of 26 103 proteins in this species were analyzed.The content of G+C at three positions of codons’the Effective number of codons（ENC）and frequency of synonym codon usage for genes were calculated the“optimal codons”were determined by Codon W,CHIPS and CUSP.Then,the frequency of codon usage for Ph.edulis with other organisms including five model value species （Drosophila melanogaster,Saccharomys cerevisiae,Escherichia coli,Arabidopsis thaliana,and Nicotiana tabacum）and three other Gramineae species （Oryza sativa,Zea mays,and Triticum aestivum）were compared.Results showed that the content of G+C at the first and third position of codons was much higher than that of the second positions,and genes preferred codons with C or G in the synonymous position.Meanwhile,26 codons,ending with G or C,were determined as the “optimal codons”.Frequency of codon usage also had fewer differences for the three Gramineae species than it did for the six model value species.To some extent,differences in the size of codon bias reflected the evolutionary relationships between species.These results provided the useful information for understanding the evolution of Ph.edulis ［Ch,1 fig.4 tab.29 ref.］

botany;Phyllostachys edulis;codon bias;optimal codon

S722；S795.7

A

2095-0756（2017）01-0120-09

2016-02-29；

2016-04-20

浙江省自然科學基金資助項目（Y307499，LY13C160011）；國家自然科學基金資助項目（30901155）；浙江省大學生新苗人才計劃項目（2015R412020）

黃笑宇，從事林學研究。 E-mail：593796107@qq.com。通信作者：郭小勤，副教授，博士，從事竹類植物遺傳育種等研究。E-mail：xqguo@zafu.edu.cn

浙 江 農(nóng) 林 大 學 學 報，2017，34（1）：129-136

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.018