Egr-1通過上調(diào)NDRG1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

史素琴，潘 研，岳 新，陳 妍，趙 璐△

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000)

論著·基礎(chǔ)研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.004

Egr-1通過上調(diào)NDRG1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

史素琴1，潘 研1，岳 新1，陳 妍2，趙 璐2△

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000)

[摘要] 目的 探究早期生長因子1(Egr-1)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影響。方法 采集成年男性骨髓組織，分離培養(yǎng)原代BMSCs并在顯微鏡下觀察其形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物；pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染BMSCs，MTT檢測BMSCs的增殖，茜素紅鈣染色試劑盒檢測細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的形成，ALP活性測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ALP的活性，實時定量qPCR和 Western blot分別檢測細(xì)胞內(nèi)Egr-1、Runx2、NDRG1 mRNA和蛋白表達(dá)；Egr-1 siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs，檢測細(xì)胞內(nèi)ALP活性、Egr-1、Runx2和NDRG1 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 離體培養(yǎng)的BMSCs高表達(dá)CD90和CD29，而CD34和CD45呈陰性表達(dá)；pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染對BMSCs增殖無明顯作用，卻能促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的形成，上調(diào)ALP活性和Egr-1、Runx2、NDRG1的表達(dá)，而Egr-1 siRNA則作用相反。結(jié)論 Egr-1通過上調(diào)NDRG1誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。

骨質(zhì)疏松；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨細(xì)胞；早期生長因子1；N-myc下游調(diào)節(jié)基因1

[Abstract] Objective To explore the effects of early growth response gene-1 (Egr-1) on bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) proliferation and osteogenic differentiation,which is aimed at providing new molecular targets for the treatment of osteoporosis.Methods Bone marrow was collected from adult men and the BMSCs were cultured primarily and observed by microscope.Meanwhile,flow cytometry was used for BMSCs phenotypic identification;After transfection of pcDNA3.1/Egr-1 into BMSCs,the level of BMSCs proliferation was determined by MTT respectively on the 2 d,4 d and 6 d;On the 7 d after transfection,the ALP activity assay was used for testing the ALP activity in BMSCs.And then,alizarin red S-calcium kit was used for measuring the calcified knots respectively on the 7 d,14 d and 21 d;On the 21 d after transfection,real-time qPCR and Western blotting were used respectively for measuring the expression of mRNA and protein of Egr-1,Runx2 and NDRG1;Further,BMSCs were transfected with Egr-1 siRNA,and the content of calcium nodules,ALP activity,the expression of Egr-1,Runx2 and NDRG1 were detected as above methods.Results The cells cultured in vitro showed high level of CD90 and CD29 and very low level of CD34 and CD45,which is accorded with the characteristic of BMSCs.The pcDNA3.1/Egr-1 transfection for BMSCs had no effect on cells proliferation.However,the calcified knots,ALP activity and the expression of Egr-1,Runx2 and NDRG1 were increased after transfection of pcDNA3.1/Egr-1 for BMSCs.In addition,Egr-1 siRNA showed the opposite effect with pcDNA3.1/Egr-1 transfection for BMSCs.Conclusion Egr-1 induces osteogenic differentiation of BMSCs by promoting NDRG1 but has no effects on proliferation of BMSCs.

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥常見于中老年人和絕經(jīng)后婦女，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)的改變等。成骨細(xì)胞功能和數(shù)量的退化對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展有重要作用[1]，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)經(jīng)定向誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞，成為防治骨質(zhì)疏松癥的重要手段[2-3]。

N-myc下游調(diào)節(jié)基因(N-myc downstream regulated gene，NDRG)是一個與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，能轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種蛋白的表達(dá)，也對骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞的生長和分化有調(diào)控作用[4]。之前有研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2能通過上調(diào)成骨標(biāo)志基因(runt-related transcription factor 2，Runx2)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性促進(jìn)BMSCs成骨分化，而NDRG1與NDRG2在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性[5]。最近的一項研究證明，NDRG1在腰椎到骶椎體節(jié)過渡區(qū)域特化過程中起一定作用[6]。而且，NDRG1可被早期生長因子1(early growth response gene-1，Egr-1)上調(diào)。Egr-1又是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)的偶聯(lián)過程調(diào)控諸多下游長期反應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的纖維化和分化[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Egr-1介導(dǎo)了小鼠軟骨細(xì)胞的凋亡過程[8]，但它對BMSCs的增殖和分化作用尚未見報道。本文檢測了Egr-1對BMSCs增殖、成骨分化及NDRG1表達(dá)的影響，旨在為骨質(zhì)疏松癥的治療尋找新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象來自2014年3月至2015年1月在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院擇期手術(shù)的4例脊柱側(cè)彎16～20歲的男性自愿手術(shù)患者。術(shù)中收集4例骨髓組織，每例約8 mL。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。所有患者均被告知風(fēng)險，經(jīng)患者知情同意后簽署書面同意書。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的分離與培養(yǎng) 在收集的骨髓組織中加入10 mL DMEM(Invitrogen，USA)培養(yǎng)基后搖勻，離心，去上清。加細(xì)胞重懸液重懸洗滌后加4 mL D-Hanks(Invitrogen)溶液和4 mL細(xì)胞分離液(0.56∶0.44)，離心后收集單核細(xì)胞層，用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌。將BMSCs接種到25 mL培養(yǎng)瓶中(5×105/cm2)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后換液，以后每2天換液1 次。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%后，用2.5 g/L胰酶消化，以1×104/cm2將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs 在生長狀態(tài)良好的BMSCs中加入胰酶消化液，離心。然后分別加入購自英國Abcam公司的PE-CD34、FITC-CD29、FITC-CD45和FITC-CD90抗體，4 ℃孵育30 min。PBS沖洗后在流式細(xì)胞儀上檢測。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建正義Egr-1質(zhì)粒并合成，經(jīng)感受態(tài)轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取后轉(zhuǎn)染到空載體pcDNA3.1中，命名為pcDNA3.1/Egr-1。待細(xì)胞融合達(dá)80%后，分別配置pcDNA3.1、pcDNA3.1/Egr-1、siRNA、Egr-1 siRNA與脂質(zhì)體復(fù)合物，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到點狀綠光則表明轉(zhuǎn)染成功。本實驗轉(zhuǎn)染用的Egr-1 siRNA引物序列均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成。

1.2.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測BMSCs細(xì)胞增殖 BMSCs經(jīng)胰酶消化后，以1×104個/cm2接種于96 孔板。經(jīng)pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)2、4、6 d，加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h。吸棄孔內(nèi)MTT，加二甲基亞砜后避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm，吸光度(A)490 nm值。

1.2.5 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色 BMSCs如1.2.4接種后，pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)，各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染第7、14、21天分別按照茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥有限公司)對樣本進(jìn)行固定、染色和澄清，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 ALP活性檢測 轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化7 d后，ALP活性測定試劑盒(南京建成公司)檢測各組細(xì)胞內(nèi)ALP活性，酶標(biāo)儀上測定各孔A520 nm值。

1.2.7 實時定量 PCR TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，在核酸定量儀上測得濃度，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒(K1621，F(xiàn)ormentas)用于總RNA的反轉(zhuǎn)錄，熒光定量試劑盒(K0241，F(xiàn)ermentas)檢測Egr-1 Runx2和NDRG1的表達(dá)。各基因引物見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。

表1 基因引物

1.2.8 Western blot RIPA裂解細(xì)胞，用總蛋白提取試劑盒(Millipore，USA)提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，測定濃度。吸取50 μg蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠孔，80 V恒壓電泳，然后恒流轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用含脫脂奶粉的Tris緩沖液于室溫封閉1 h，分別加入Runx2、NDRG1一抗(Abcam，UK)4 ℃過夜。經(jīng)TBST洗膜、FITC標(biāo)記的二抗(Abcam，UK)室溫孵育1 h。蛋白質(zhì)發(fā)光試劑盒(Millipore，USA)化學(xué)發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的鑒定 接種BMSCs后于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)2 d后細(xì)胞貼壁，呈集落樣生長，細(xì)胞形態(tài)清晰可見，呈多突、梭形，部分伸出偽足呈短棒狀(圖1A)。7 d 后BMSCs圍繞集落中心迅速生長和增殖，此時的細(xì)胞相對形態(tài)均一，排列緊密，細(xì)胞胞體略大，多呈長梭形，集落周圍能觀察到許多放射狀或旋渦狀的貼壁細(xì)胞(圖1B)。 通過流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90的表達(dá)(圖1C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD90和CD29，其陽性率值分別為99.2%和99.5%，極少表達(dá)CD34和CD45，陽性率值分別為0.2%和0.8%，這些結(jié)果符合BMSCs 表型特征。

A：接種第2 天；B:接種第10天；C：BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90的表達(dá)。

2.2 Egr-1對BMSCs增殖無明顯作用 為了探究Egr-1對BMSCs增殖的作用，筆者采用pcDNA3.1和pcDNA3.1/Egr-1分別轉(zhuǎn)染BMSCs。表2是轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別培養(yǎng)2、4、6 d的MTT檢測結(jié)果，與對照組相比，pcDNA3.1和pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染對BMSCs的增殖過程無明顯作用(P>0.05)。

表2 Egr-1 對人BMSCs增殖的影響

2.3 Egr-1促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的形成 為了探究Egr-1能否誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，分別于pcDNA3.1和pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染BMSCs后第7、14、21天用茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色試劑盒對細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)染色。結(jié)果顯示，pcDNA3.1/Egr-1組細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和密度在轉(zhuǎn)染后7、14、21 d逐漸增加，且明顯高于對照組和pcDNA3.1組(P<0.05)；pcDNA3.1組細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和密度與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.4 Egr-1促進(jìn)BMSCs內(nèi)ALP活性及Egr-1、Runx2、NDRG1表達(dá) 為了探討Egr-1是否通過NDRG1促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，筆者檢測了pcDNA3.1/Egr-1轉(zhuǎn)染后第7天細(xì)胞內(nèi)ALP活性和第21天細(xì)胞內(nèi)Runx2、NDRG1的表達(dá)。結(jié)果表明，pcDNA3.1/Egr-1組細(xì)胞內(nèi)ALP活性(圖3A)明顯高于對照組和pcDNA3.1組(P<0.05)；Egr-1 mRNA(圖3B)和蛋白(圖3C)的表達(dá)在pcDNA3.1/Egr-1組明顯高于對照組和pcDNA3.1組(P<0.01)；Runx2和NDRG1 mRNA(圖3B)和蛋白(圖3C)的表達(dá)在pcDNA3.1/Egr-1組也都明顯高于對照組和pcDNA3.1組(P<0.05)。

2.5 Egr-1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制BMSCs向成骨細(xì)胞的分化 為了進(jìn)一步探討Egr-1在BMSCs成骨細(xì)胞分化中的作用，筆者接下來采用Egr-1 siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs，于第7天檢測細(xì)胞內(nèi)ALP活性，第21天檢測細(xì)胞內(nèi)Runx2、NDRG1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Egr-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)ALP活性(圖4A)明顯低于對照組和siRNA組(P<0.01)；Egr-1 mRNA(圖4B)和蛋白(圖4C)的表達(dá)在Egr-1 siRNA組明顯低于對照組和siRNA組(P<0.01)；Runx2和NDRG1 mRNA(圖4B)和蛋白(圖4C)的表達(dá)在Egr-1 siRNA組也都低于對照組和siRNA組(均P<0.05)。表明Egr-1通過上調(diào)NDRG1的表達(dá)來誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

A：ALP活性分析圖； B：Egr-1、Runx2、NDRG1 mRNA表達(dá)分析圖；C:Westerm blot圖；D：Westerm blot分析圖。a:P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較。

A：ALP活性分析圖；B：Egr-1、Runx2、NDRG1 mRNA表達(dá)分析圖；C:Egr-1、Runx2、NDRG1 蛋白表達(dá)及分析圖。a:P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較。

3 討 論

BMSCs的數(shù)量和功能一直是維持骨骼正常生理機能的關(guān)鍵因素，當(dāng)機體發(fā)生骨質(zhì)疏松時，骨髓中BMSCs的成骨能力降低。因此，BMSCs向成骨細(xì)胞分化相關(guān)的研究是近年來骨質(zhì)疏松癥關(guān)注的焦點。NDRG1是一個在體內(nèi)廣泛表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)蛋白，之前關(guān)于NDRG1的研究大都集中在對癌細(xì)胞分化，包括肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌和前列腺癌等[9-10]。近年來，King等[11]發(fā)現(xiàn)NDRG1能促進(jìn)髓鞘細(xì)胞的形成和分化。在NDRG1基因敲除鼠中，NDRG1具有調(diào)控腰椎和胸椎過渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)換的作用[6]。甚至有人認(rèn)為NDRG1參與了骨肉瘤中成骨細(xì)胞的分化，可作為成骨分化的候選標(biāo)志基因[12]。又考慮到NDRG2能通過上調(diào)Runx2表達(dá)和ALP活性促進(jìn)BMSCs成骨分化，不難發(fā)現(xiàn)NDRG1能促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在ALP活性和Runx2表達(dá)越高、鈣結(jié)節(jié)形成越多的BMSCs中，即骨化程度越高的細(xì)胞內(nèi)，NDRG1表達(dá)也越高，進(jìn)一步證實NDRG1與成骨細(xì)胞的形成相關(guān)。

Egr-1是即刻早期反應(yīng)基因家族的成員之一，在細(xì)胞的生長分化過程中能檢測到其活性表達(dá)，對多種類型細(xì)胞的增殖分化都有調(diào)控作用。Egr-1基因的過表達(dá)不僅能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展[13]，也能通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[14]。在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中，Egr-1的表達(dá)比健康人要低，而且Egr-1能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化過程[15]。反之，在大骨節(jié)病患者的軟骨組織中，其表層細(xì)胞內(nèi)Egr-1的表達(dá)也明顯高于健康人[16]。與此同時，TGF-β已被報道能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，而Egr-1又是TGF-β的上游基因，這也進(jìn)一步間接暗示Egr-1或許參與了BMSCs成骨分化。本研究的結(jié)果與之前研究的結(jié)論相一致，發(fā)現(xiàn)Egr-1能促進(jìn)BMSCs基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)的形成及ALP活性，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。另外，由于NDRG1作為Egr-1的下游靶點之一，又在BMSCs成骨分化過程中高表達(dá)，因此，筆者認(rèn)為Egr-1通過上調(diào)NDRG1的表達(dá)誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

由此看來，Egr-1能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，這將有助于骨的形成，也為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的理論依據(jù)。但是，BMSCs 增殖和分化的機制較為復(fù)雜，可能有多種信號分子參與，Egr-1在該過程中也可能存在更多潛在的作用靶點。而且，Egr-1究竟能否用于骨質(zhì)疏松的治療，這都需要進(jìn)一步構(gòu)建相關(guān)的動物模型，并結(jié)合細(xì)胞水平的實驗來加以評價。

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《重慶醫(yī)學(xué)》對臨床研究論文醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求

凡投本刊的臨床研究論文(主體是以人為研究對象)，作者應(yīng)說明其遵循的程序是否符合倫理委員會(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并提供(上傳)該委員會的批準(zhǔn)文件復(fù)印件及受試對象或其親屬的知情同意書復(fù)印件。

《重慶醫(yī)學(xué)》編輯部

Egr-1 induces osteogenic differentiation of BMSCs by promoting NDRG1

ShiSuqin1,PanYan1,YueXin1,ChenYan2,ZhaoLu2△

(1.DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450000,China;2.DepartmentofEndocrinology,theThirdAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450000,China)

osteoporosis;bone marrow mesenchymal stem cells;osteoblast;early growth response gene-1;N-myc downstream regulated gene 1

史素琴(1977-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。△

,E-mail:zhaolu.cn@163.com。

R335

A

1671-8348(2017)04-0442-04

2016-09-29

2016-10-17)