尿源性干細(xì)胞移植在糖尿病腎病治療中的研究進(jìn)展*

黃英姿 綜述，張克勤 審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院腎科，重慶 400038)

·綜 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.043

尿源性干細(xì)胞移植在糖尿病腎病治療中的研究進(jìn)展*

黃英姿 綜述，張克勤△審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院腎科，重慶 400038)

尿源性干細(xì)胞；細(xì)胞治療；干細(xì)胞移植；糖尿病腎病

近年來隨著細(xì)胞治療技術(shù)的快速發(fā)展，對于干細(xì)胞在慢性腎臟病中的研究與應(yīng)用已成為腎臟病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。干細(xì)胞是人體的起源細(xì)胞，存在于胚胎及成體中，是一種具有自我更新能力及在特定條件下可以分化為多種終末細(xì)胞的特殊細(xì)胞。依據(jù)來源不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。目前，干細(xì)胞移植已經(jīng)廣泛應(yīng)用于慢性腎臟疾病的治療。胚胎干細(xì)胞因其來源困難，存在倫理問題，且本身具備致瘤性而臨床鮮有應(yīng)用。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞是將成熟體細(xì)胞經(jīng)“插入式”基因操作誘導(dǎo)方法或“無插入式”誘導(dǎo)方法，獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其具有與胚胎干細(xì)胞相同的多能性，但同樣存在致瘤性，且移植后形成的局部誘導(dǎo)微環(huán)境也有可能引起移植部位宿主細(xì)胞的“癌性轉(zhuǎn)化”，遺傳安全性無法穩(wěn)定控制。

成體干細(xì)胞來源于成熟個(gè)體各種組織和器官，主要包括造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、尿源性干細(xì)胞(urine-derived stem cells，USCs)、神經(jīng)干細(xì)胞等。與胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞來源廣，獲取相對容易，致瘤風(fēng)險(xiǎn)低，所受倫理爭議少，且同樣具有多向分化潛能，因此廣泛應(yīng)用于臨床。其中，USCs作為一種新型的干細(xì)胞來源，具有良好的多向分化潛能，制備過程簡便、無創(chuàng)、成本低，且具備高度的自我更新能力，成為了細(xì)胞替代治療中更為理想的種子細(xì)胞來源。本文就USCs的生物學(xué)特性及其在糖尿病腎病治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 USCs的生物學(xué)特性

2008年，Wake Forest大學(xué)再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Zhang等[1]首次報(bào)道從清潔尿液中分離得到一種貼壁生長的細(xì)胞，這類細(xì)胞具有高度的增殖能力，且能分化表達(dá)泌尿道上皮、平滑肌組織、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，因此稱之為USCs。

1.1 USCs的形態(tài) 目前所已知的USCs形態(tài)主要有兩種，一種是Zhang等[1]所培養(yǎng)的克隆邊緣較規(guī)則、細(xì)胞排列緊密、細(xì)胞體積較小和形如米粒的UCSs，一種是Guan等[2]培養(yǎng)的克隆邊緣不規(guī)則、細(xì)胞排列松散、細(xì)胞體形呈“紡錘形”的USCs。而引起USCs不同形態(tài)的差異現(xiàn)尚不清楚，但比較Zhang等與Guan等的培養(yǎng)體系可發(fā)現(xiàn)，Zhang等采用的是富含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和胚胎纖維母細(xì)胞培養(yǎng)基的等比例混合液，而Guan等采用的則是自制的包含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和EGF等生長因子的LMM101培養(yǎng)基[3]，因此可推測，所用培養(yǎng)基不同可能會(huì)造成USCs形態(tài)不同，但兩種培養(yǎng)基所培養(yǎng)出的USCs在分化潛能上并無明顯差異。

1.2 USCs的表面分子標(biāo)志物 USCs屬于成體干細(xì)胞的一種，除高表達(dá)c-kit、SSEA4、TRA1-60、Sox-2、Oct3/4等干細(xì)胞標(biāo)志物外[4]，還具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，穩(wěn)定表達(dá)CD73、CD90、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面分子，不表達(dá)CD31、CD34、CD45等造血細(xì)胞表面抗原[5]，因此現(xiàn)多把USCs看做間充質(zhì)干細(xì)胞的一種。

在Kang等[6]比較USCs與脂肪源性干細(xì)胞在細(xì)胞增殖、免疫調(diào)控及多向分化能力中的一項(xiàng)研究中[6]，他們所分離培養(yǎng)出的USCs形態(tài)呈“鵝卵石樣、褶邊”，類似于以前報(bào)道的尿路上皮細(xì)胞形態(tài)，而Zhang等[1]最初研究USCs時(shí)曾發(fā)現(xiàn)USCs表達(dá)尿路上皮特異性分子uroplakin Ⅰ a和細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin 7，CK7)等，但進(jìn)一步研究移植了男性供者腎臟的女性患者的尿液發(fā)現(xiàn)，其尿液中分離培養(yǎng)得到的USCs含有Y染色體，且高表達(dá)腎系標(biāo)志物及腎臟臟層上皮細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞標(biāo)志物，不表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞標(biāo)志物，提示相比尿路上皮細(xì)胞，USCs更可能來源于腎臟[7]。

1.3 USCs的分化潛能 既往多項(xiàng)研究表明，在不同的培養(yǎng)基條件下，USCs可定向分化為三胚層各類細(xì)胞。在Guan等[2]的研究中，USCs在含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硝酸鹽、EGF、bFGF等成分的DMEM/F12培養(yǎng)基中，可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白巢蛋白、神經(jīng)組織蛋白質(zhì)s(S100)、神經(jīng)絲蛋白(NF200)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，將用綠色熒光蛋白標(biāo)記的誘導(dǎo)后細(xì)胞植入大鼠腦內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)綠色熒光陽性的細(xì)胞能遷移、分散到病變部位，細(xì)胞形態(tài)也由植入前的長梭形變成類似于星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。

類似于間充質(zhì)干細(xì)胞，USCs也具有良好的成骨、成脂分化能力。骨形成蛋白(BMP)被公認(rèn)為具有誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨的能力，高濃度BMP時(shí)USCs趨向于向成脂細(xì)胞分化，低濃度BMP時(shí)則更傾向于向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化[2]。Bharadwaj等[5]通過BMP9誘導(dǎo)USCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，并將誘導(dǎo)后細(xì)胞接種于裸鼠皮下，4周后可見骨樣包塊形成，病理切片證實(shí)為骨組織，Guan等[2]用BMP2誘導(dǎo)也得出了一致的結(jié)果。

Zhang等[1]最初研究USCs時(shí)曾認(rèn)為USCs來自尿路上皮細(xì)胞，而Bharadwaj等[4]在富含血清及EGF的KSFM/EFM混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)USCs，發(fā)現(xiàn)可將USCs定向誘導(dǎo)為尿道上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)與尿路上皮細(xì)胞類似，絕大部分表達(dá)uroplakin Ⅲ、uroplakin Ⅰ a及CK7、AE1/AE3，經(jīng)向尿路平滑肌誘導(dǎo)的USCs則可表達(dá)平滑肌分化特異性抗原smoothelin[5]，表明USCs可被誘導(dǎo)向尿路上皮細(xì)胞和尿路平滑肌細(xì)胞特異性分化。

有研究表明，采用含有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs[5]或者經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染使USCs過表達(dá)VEGF[8]，均可誘導(dǎo)USCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后細(xì)胞接種于Matrigel上離體培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間形成管道狀結(jié)構(gòu)，且高表達(dá)CD31、vWF、KDR、FLT1、eNOS等內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物[9]。在體內(nèi)試驗(yàn)中，將含有誘導(dǎo)后細(xì)胞的Ⅰ型膠原凝膠植入裸鼠皮下，可發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組廣泛血管化并且大量表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原[9]，證明USCs可被特異性誘導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞分化，且可形成功能性結(jié)構(gòu)。

2 USCs的永生化

在體外培養(yǎng)的人體正常細(xì)胞，在經(jīng)過一段時(shí)間的分裂后，就會(huì)進(jìn)入一種生長抑制狀態(tài)，即衰老期(M1期)，經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可越過衰老期進(jìn)入另一種增殖抑制狀態(tài)，即危機(jī)期(M2期)，細(xì)胞開始逐漸出現(xiàn)退化并死亡，外源基因的穩(wěn)定表達(dá)也會(huì)隨著時(shí)間及細(xì)胞傳代分化而被沉默或顯著降低[11]，極大地限制了干細(xì)胞的來源。USCs也同樣面臨這樣的問題。但在近期的研究中，溫晟[12]通過運(yùn)用hEFH啟動(dòng)猿腎病毒40大T抗原(SV40Tag)基因在USCs中表達(dá)，篩選獲得的陽性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，得到永生化尿源性干細(xì)胞(iUSC)。USCs通常在傳至8代左右開始萎縮死亡，而iUSC傳代至50代仍生長旺盛。iUSC可在體外逃離M2期，獲得無限增殖傳代的能力，從而有助于外源基因在USCs穩(wěn)定的高水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，iUSC依舊表達(dá)CD73、CD44、CD106、SSEA4等干細(xì)胞表明標(biāo)志物，具有成脂、成骨、成軟骨分化特性，保持了干細(xì)胞分化潛能，且在裸鼠皮下注射4周內(nèi)無腫瘤形成，初步證明無成瘤性。USCs永生化的成功為USCs在細(xì)胞移植治療及組織工程學(xué)應(yīng)用方面提供了新的穩(wěn)定的細(xì)胞來源。

3 USCs移植與糖尿病腎病

大量研究證實(shí)，干細(xì)胞移植能在一定程度上有利于慢性腎臟病患者恢復(fù)腎功能[10]，其可能的機(jī)制主要有4種：(1)干細(xì)胞與腎臟細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的融合；(2)干細(xì)胞分泌的生長因子、細(xì)胞因子等活性物質(zhì)有利于腎功能的恢復(fù)；(3)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用；(4)干細(xì)胞在腎臟環(huán)境內(nèi)分化成為腎臟細(xì)胞[13]。

張超等[14]通過將USCs直接注射到慢性腎病模型大鼠腎臟皮質(zhì)，在腎組織蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色中發(fā)現(xiàn)，USCs組腎臟結(jié)構(gòu)病理變化較安慰劑組輕，較健康對照組重，在膠原沉積方面，雖然USCs組仍高于對照組，但明顯少于安慰劑組，腎臟間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤也得出同樣結(jié)果。在術(shù)后的監(jiān)測中，可發(fā)現(xiàn)術(shù)后2周時(shí)大鼠血肌酐開始出現(xiàn)明顯下降，在第4周時(shí)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定水平，同時(shí)腎小球?yàn)V過率(GFR)也在術(shù)后4周明顯改善。術(shù)后12周追蹤時(shí)發(fā)現(xiàn)有個(gè)別HLA染色陽性細(xì)胞(即USCs)與Bowman′s細(xì)胞融合，部分細(xì)胞分散在腎臟間質(zhì)中，位于腎小管之間，提示USCs與腎臟組織結(jié)構(gòu)的融合可能對腎功能恢復(fù)有一定作用。但同時(shí)不可忽視的是，在有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞移植的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)，不管是何種移植方式或移植手段，只有很少的移植間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢到腎臟，而這也代表可能干細(xì)胞對腎臟的修復(fù)作用主要是靠旁分泌或者內(nèi)分泌途徑來實(shí)現(xiàn)的[15]。

糖尿病腎病是引起終末期腎病的常見原因之一，糖尿病腎病中蛋白尿的進(jìn)展和足細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而既往研究表明，高糖可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，減少足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin的表達(dá)，從而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[17-18]。姜珍珍等[19]的體外試驗(yàn)證實(shí)，USCs主要依賴旁分泌作用發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，不同劑量USCs的條件培養(yǎng)基能夠減輕Synaptopodin的下調(diào)、抑制足細(xì)胞的早期凋亡。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，USCs條件培養(yǎng)基中的外泌體可能是USCs在高糖環(huán)境中對足細(xì)胞起保護(hù)作用的重要物質(zhì)。USCs來源的外泌體能減少體內(nèi)外高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞的凋亡與損傷[20]，同時(shí)能改善1型糖尿病大鼠尿微量清蛋白/肌酐，減少腎小球系膜增生，減少組織細(xì)胞凋亡，延緩糖尿病腎病的發(fā)生和進(jìn)展。外泌體是一類介導(dǎo)細(xì)胞間遺傳信息、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的微泡物質(zhì)，不同細(xì)胞來源的外泌體膜上有特定的蛋白和脂質(zhì)，通過特異性的受體配體結(jié)合作用，向細(xì)胞轉(zhuǎn)移表面受體、蛋白和生物活性脂類，同時(shí)傳遞特定的mRNA和microRNA，從而通過旁分泌/內(nèi)分泌途徑實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的調(diào)控。大量研究表明，外泌體能促進(jìn)血管生成及抑制細(xì)胞凋亡[21-22]。在經(jīng)過USCs來源的外泌體干預(yù)過的1型糖尿病大鼠腎組織中，TUNEL染色陽性細(xì)胞較單純1型糖尿病組明顯減少，且凋亡蛋白Bax和活性Caspase-3較單純1型糖尿病組少，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)[16]，且通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測到，在USCs的條件培養(yǎng)基和USCs來源的外泌體中，BMP-7、VEGF、TGF-β1和血管生成素水平都較正常對照組顯著升高[16]，而以上幾種細(xì)胞因子均參與血管的生成。因此可推測，USCs來源的外泌體可能通過抑制Caspase-3的過表達(dá)及通過細(xì)胞因子如BMP-7、VEGF、TGF-β1等促進(jìn)血管再生和細(xì)胞存活來減少足細(xì)胞的凋亡[16]，從而實(shí)現(xiàn)在糖尿病中保護(hù)腎臟的作用。

干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及在腎臟環(huán)境中可分化為腎臟細(xì)胞的能力已在大量的研究中得到證實(shí)[23-24]，間充質(zhì)干細(xì)胞能通過抑制T細(xì)胞增殖、抑制B細(xì)胞的增殖和終末分化，以及影響樹突狀細(xì)胞的成熟和功能，同時(shí)聯(lián)合參與其他免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)，從而改善糖尿病腎病的腎臟功能[20]。USCs與間充質(zhì)干細(xì)胞有著類似的生物學(xué)共性，但目前大部分關(guān)于USCs的研究仍集中于其在組織工程學(xué)中的應(yīng)用，USCs是否也具有免疫調(diào)節(jié)作用及在腎內(nèi)能否分化為腎細(xì)胞，這些都有待更進(jìn)一步的研究來揭示。

4 問題與展望

USCs由于其來源無創(chuàng)、方便，且有類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，有望成為糖尿病腎病等慢性腎臟疾病治療中的新希望?，F(xiàn)有研究結(jié)果也基本肯定了USCs在保護(hù)腎功能方面有明確效果，但目前研究多停留在初期階段，主要研究對象是動(dòng)物模型，還存在許多問題有待探究和解決：(1)USCs修復(fù)腎功能的機(jī)制仍不十分明確，是否參與了受損組織或器官的免疫應(yīng)答，是否能在腎臟環(huán)境中分化為腎細(xì)胞？(2)USCs的移植方式、移植時(shí)機(jī)的選擇對改善病情的影響尚不明確；(3)USCs聯(lián)合多種干細(xì)胞移植是否會(huì)更好？(4)USCs移植的遠(yuǎn)期效果及安全性等問題亟待進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。USCs在慢性腎臟病中的研究剛剛起步，隨著對USCs研究的深入，相信USCs一定能在細(xì)胞治療中發(fā)揮其巨大的作用。

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國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81670684)。 作者簡介：(1989-)，在讀碩士，主要從事慢性腎臟病研究。△

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